米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖的体外免疫应答和抗肿瘤活性研究

２０１５年３月　第３０卷第３期　中国粮油学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　Ｏｉｌｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．３　ＭａＬ　２０１５　

米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖的　

体外免疫应答和抗肿瘤活性研究　

朱丽丹　王　莉　徐逸木　＇　王　韧　，　李亚男　陈正行　，　

（江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室　，无锡２１４１２２）　（江南大学食品学院　，无锡２１４１２２）　

摘要　以小鼠黑色素瘤细胞（Ｂ１６）为抗肿瘤模型，通过ＭＴＦ比色法评价米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖　

对ＢＩ６增殖抑制能力。以小鼠巨噬细胞Ｒａｗ２６４．７细胞系为免疫模型，通过ＭＩＴ比色法评价Ｒａｗ２６４．７增殖　能力，中性红吞噬试验评价巨噬细胞活性，Ｇｒｉｅｓｓ方法检测一氧化氮（ＮＯ）释放量，以及酶联免疫（ＥＬＩＳＡ）检测　

肿瘤坏死因子（ＴＮＦ一仪）分泌量，考察米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖的免疫活性。研究发现：米糠粗多糖　（ＲＢＰ）和米糠多糖纯化组分（ＲＢＰ２ａ）主要通过增强机体的免疫功能而间接抑制肿瘤细胞。质量浓度为２５０　

ｇ／ｍＬ时，ＲＢＰ和ＲＢＰ２ａ样品组的ＮＯ释放量分别为对照组的４．６７、６．３６倍，ＴＮＦ一　分泌量为对照组的　４４１．１、４６５．５倍；ＲＢＰ直接组和间接组的Ｂ１６抑制率分别为８．１６％、４５．５５％，间接组的Ｂ１６抑制率比直接组　增长４５８％。硫酸酯化米糠多糖（ＳＲＢＰ—Ｂ，ＳＲＢＰ—Ｄ，ＳＲＢＰ２ａ—Ｂ）一方面可以直接抑制Ｂ１６增殖，质量浓度　

为１　０００　ｇ／ｍＬ时，对Ｂ１６抑制率达７３．６５％、６５．５３％、７８．４３％，另一方面也可通过免疫途径提高ＮＯ和ＴＮＦ　

一仅等细胞因子释放，进一步提高抗肿瘤活性。但高浓度ＳＲＢＰ—Ｂ，ＳＲＢＰ—Ｄ，ＳＲＢＰ２ａ—Ｂ能抑制Ｒａｗ２６４．７　增殖，在５００　ｇ／ｍＬ时，Ｒａｗ２６４．７存活率仅为８３．２６％、８１．８％、７９．７８％。　

关键词　米糠多糖硫酸酯化米糠多糖免疫调节抗肿瘤活性　中图分类号：Ｑ２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３—０１７４（２０１５）０３—００３５—０６　

米糠是稻米加工的副产物，含有优质的蛋白质、　多糖、脂肪、生育酚等生物活性物质　Ｊ。研究表明，　米糠中活性多糖具有提高免疫能力　］，抗肿瘤　２－５］，　

降血脂－ｏ　等功能。生物活性多糖的抗肿瘤途径主要　有２种：一方面通过宿主介导提高抗肿瘤活性，即多　

糖作为生物免疫反应的调节剂，通过增强机体的免　疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞；另一方面多糖　

对细胞有毒性，直接抑制肿瘤细胞增殖ｌ　。目前米　糠多糖的活性研究主要集中在对肿瘤的直接抑制作　

用或提高免疫活性等单一方面，将肿瘤直接抑制作　用和免疫活性联系起来对米糠多糖抗肿瘤途径的研　究很少。有研究表明　Ｊ：对米糠多糖进行硫酸酯化　

修饰，可以提高多糖的抗肿瘤活性，对体外人肝癌细　胞Ｈｅｐ　Ｇ２和小鼠乳腺癌细胞ＥＭＴ一６抑制能力有　

显著增强。但是米糠多糖经硫酸酯化后免疫活性是　

否有所变化，抗肿瘤途径是否有所转变，尚鲜见报　道。鉴于此，本试验旨在研究米糠多糖及硫酸酯化　

基金项目：国家自然科学基金（３１１０１３８３）　牧稿日期：２０１３—１１—２０　作者简介：朱丽丹，女，１９８８年出生，硕士，谷物活性物质　通讯作者：陈正行，男，１９６０年出生，教授，粮食精深加工　米糠多糖对体外小鼠黑色素瘤细胞（Ｂ１６）抑制能力　

及小鼠巨噬细胞（Ｒａｗ２６４．７）免疫应答作用。　

１　材料与方法　

１．１材料及试验细胞　脱脂米糠：万福生科（湖南）农业开发股份有限　公司；小鼠黑色素瘤细胞（Ｂ１６）、Ｒａｗ２６４．７（小鼠单　核巨噬细胞白血病细胞）：中国科学院上海生命科学　

研究院细胞资源中心；胎牛血清：美国Ｇｉｂｉｃｏ公司；　ＲＰＭＩ１６４０培养基、青霉素／链霉素、胰蛋白酶：美国　Ｃｅｌｌｇｒｏ公司；ＤＭＥＭ（ＨｉｇｈＧｌｕｅｏｓｅ）：美国Ｔｈｅｒｍｏ公　

司；３一（４，５一二甲基噻唑一２）一２，５一二苯基四氮　唑溴盐（ＭＴｒ）、脂多糖（ＬＰＳ）：美国Ｓｉｇｍａ公司；ＴＮＦ　

一仪检测试剂盒：美国ｅＢｏｓｃｉｅｎｃｅ公司；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｂｉｇ　

Ｂｅａｄｓ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ一６Ｂ：美国通用电气（ＧＥ）公司；　淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶：无锡杰能科生物工程　有限公司；注射用香菇多糖：山西振东泰盛制药有限　

公司；注射用顺铂：齐鲁制药有限公司。　１．２主要仪器　ＳＨ一１０００酶标仪：日本Ｃｏｒｏｎａ公司；ＴＨ一１

０００　３６　中国粮油学报　２０１５年第３期　

型梯度混合器、ＨＬ～２Ｓ型恒流、ＨＤ一５电脑紫外检　

测仪：上海青浦沪西分析仪器厂。　１．３试验方法　１．３．１　米糠多糖的制备及分离纯化　

米糠多糖的提取及分离纯化方法参考文献　［１—２］。采用热水浸提，氢氧化钙、　一高温淀粉酶、　糖化酶、中性蛋白酶除去植酸、淀粉、蛋白等杂质，工　

业酒精醇沉多糖（酒精体积浓度为７０％）。将离心得　到沉淀利用透析除去残留的盐，浓缩后冷冻干燥即　

为米糠粗多糖（ＲＢＰ）。将ＲＢＰ复溶液上样于Ｓｅｐｈａ－　

ｒｏｓｅ　Ｂｉｇ　Ｂｅａｄｓ离子交换柱，以含０、０．５　ｍｏｌ／Ｌ氯化钠　的磷酸盐缓冲液（０．Ｉ　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝８．５）作为洗脱剂　洗脱柱子，根据多糖含量绘制洗脱曲线，得到组分　ＲＢＰ１、ＲＢＰ２、ＲＢＰ３。根据抗肿瘤和免疫活性综合指　

标评价ＲＢＰ１、ＲＢＰ２、ＲＢＰ３，选取ＲＢＰ２作为进一步纯　化组分。将ＲＢＰ２复溶液上样于Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ一６Ｂ　凝胶柱，以磷酸盐缓冲液（０．１　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝７．６）作为　洗脱剂洗脱柱子，根据多糖含量绘制洗脱曲线，得到　

ＲＢＰ２ａ、ＲＢＰ２ｂ。由于ＲＢＰ２ｂ组分含量少，故选取　ＲＢＰ２ａ作为纯化米糠多糖。　

１．３．２硫酸酯化米糠多糖的制备　以ＲＰＢ为反应底物，１一丁基一３一甲基咪唑四　氟硼酸盐（［ＢＭＩＭ］ＢＦ　）或Ｎ，Ｎ一二甲基甲酰胺　

（ＤＭＦ）为反应介质，根据吡啶一氯磺酸法制备得到　硫酸酯化米糠多糖，分别命名为ＳＲＰＢ—Ｂ、ＳＲＰＢ—　

Ｄ。以ＲＰＢ２ａ为反应底物，［ＢＭＩＭ］ＢＦ　反应介质，根　据吡啶一氯磺酸法制备得到硫酸酯化米糠多糖，命　名为ＳＲＢＰ２ａ—Ｂ。　

Ｉ．３．３细胞培养　小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６置于１６４０完全培养液　（含１０％胎牛血清、１００　Ｕ／ｍＬ的青霉素和１００　Ｕ／ｍＬ　的链霉素），在３７℃、５％ＣＯ：、饱和湿度条件下培养。　小鼠巨噬细胞Ｒａｗ２６７．４置于高糖ＤＭＥＭ完全　

培养液（含１０％胎牛血清、１００　Ｕ／ｍＬ的青霉素和１００　Ｕ／ｍＬ的链霉素），在３７℃、５％ＣＯ　、饱和湿度条件下　培养。　

１．３．４试验分组　取对数期的Ｂ１６或Ｒａｗ２６４．７经胰蛋白酶消化，　

调整细胞浓度，接种于９６孔板中，每孔１００　Ｌ，每组　设置５个复孔，培养１２　ｈ，吸取上清液，加入不同溶　液２００　Ｌ。其中无细胞孔作为空白组，仅加完全培　养液孔为对照组，含１　ｇ／ｍＬ脂多糖（ＬＰＳ）的完全培　

养液孔为ＬＰＳ模型组，含５０　ｇ／ｍＬ香菇多糖的完全　培养液孔为香菇多糖模型组，含５　ｔｚｇ／ｍＬ顺铂的完　全培养液孔为顺铂模型组（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ），加不同浓度的　

米糠多糖（ＲＢＰ、ＲＢＰ２ａ）及硫酸酯化米糠多糖（ＳＲＢＰ　

—Ｂ、ＳＲＢＰ—Ｄ、ＳＲＢＰ２ａ—Ｂ）孔为样品组。　

１．３．５对Ｂ１６增殖直接抑制的影响　调整Ｂ１６细胞密度为５×１０　～１０×１０　爪／ｍＬ，按　照１．３．３培养４８　ｈ，加入５　ｍｇ／ｍＬ　ＭＴ－Ｆ　２０　Ｌ，培养　

４　ｈ，小心的吸出上清液，加入１５０　ＩｘＬ二甲亚砜，在平　板震荡仪上震荡１０　ｍｉｎ，在５７０　ｎｍ测定９６孔板各孔　

的吸光值。　

抑制率＝　｛　×－。。％　

１．３．６对Ｒａｗ２６４．７增殖的影响　调整Ｒａｗ２６４．７细胞密度为１×１０　个／ｍＬ，按照　

１．３．３培养２４　ｈ，加入５　ｍｇ／ｍＬ　Ｍｑｑ＇２０　ＩｘＬ，培养４　ｈ，小心的吸出上清液，加入１５０　ｉｘＬ二甲亚砜，震荡　

１０　ｍｉｎ，在５７０　ｎｍ测定９６孔板各孔的吸光值。　增殖刺激指数＝　（Ｏ　Ｄ　ｖ，ｅ　．－　Ｏ　Ｄ￣ｔ３）×ｌ００％　

１．３．７对Ｒａｗ２６４．７吞噬能力的影响　调整Ｒａｗ２６４．７细胞密度为１×１０　／￣／ｍＬ，按照　

１．３．３培养２４　ｈ，弃培养基，ＰＢＳ洗涤２次，然后每孑Ｌ　加入１００“Ｌ　０．０５％中性红溶液继续培养１　ｈ。细胞　

用３７℃温浴的ＰＢＳ洗涤３次，以除去未被吞噬的中　性红，最后每孔加入１００　Ｌ细胞裂解液（５０％乙酸　

和５０％乙醇）裂解过夜，于５５０　ｎｍ波长条件下测定　各孔中性红吸光度值。按下式计算Ｒａｗ２６４．７吞噬　

指数和平均吞噬指数：　

吞噬指数＝若　ｘ・ｏｏ％　

平均吞噬指数＝吞噬指数／增殖指数　１．３．８对Ｒａｗ２６４．７　ＮＯ产生量的影响ｌ９　

调整Ｒａｗ２６４．７细胞密度为５×１０　个／ｍＬ，按照　１．３．３培养４８　ｈ，取上清液５Ｏ　Ｌ于新的９６孔中，加　入５０　ＩｘＬ　Ｇｒｉｅｓｓ试剂，震荡１０　ｍｉｎ，在５５０　ｎｍ测定各　

孑Ｌ的吸光值。根据ＮａＮＯ　制得的标准曲线计算培养　液中的ＮＯ生成量（ｇ￣ｍｏｌ／Ｌ）。　

ＮＯ标准曲线的制作：配置１００　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＮＯ　

标准溶液，分别取０、１０、２０、３０、４０、５０　ＮａＮＯ２标准　溶液，超纯水补足至５０　Ｌ，加入５０　Ｌ　Ｇｒｉｅｓｓ试剂，　

震荡１０　ｍｉｎ，在５５０　ｎｍ测定其吸光值。　１．３。９对Ｒａｗ　２６４．７ＴＮＦ一仅产生量的影响　调整Ｒａｗ２６４．７细胞密度为５　ｘ　１０　个／ｍＬ，按照　

１．３．３培养２４　ｈ。上清液的ＴＮＦ一０【含量按照ｅＢ．　ｏｓｉｅｎｃｅ试剂盒说明书进行ＥＬＩＳＡ试验。

　第３０卷第３期　朱丽丹等米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖的体外免疫应答和抗肿瘤活性研究　３７　

１．３．１０对Ｂ１６增殖间接抑制能力的影响　叫　

调整Ｒａｗ２６４．７细胞密度为５×１０　个／ｍＬ，按照　

１．３．３培养２４　ｈ，收集２００　Ｌ上清液于离心管中备　用。按照１．３．５测定不同溶液处理Ｒａｗ２６４．７上清　液对Ｂ１６细胞体外抑制率。　

１．４数据处理　采用ＳＰＳＳ１８．０软件对数据进行ＡＮＯＶＥ方差分　析，并以检验比较组间差异性，显著性水平为Ｐ＝　

０．０５，极显著性水平为Ｐ＝０．０１。数据　４－ＳＤ表示。　

２　结果与讨论　

２．１　对Ｂ１６直接增殖抑制能力的影响　采用Ｍ＇／Ｔ比色法测定细胞的活性，Ｍｒｒｒ能和活　

细胞线粒体脱氢酶生成蓝紫色的甲躜，甲臌在最大　吸收波长５５０　ｎｍ的吸光值与活性细胞数成正比。　

从图１可以看出：和对照组相比，ＬＰＳ模型组对Ｂ１６　抑制率较低，仅为３．６６％；香菇多糖和顺铂模型组对　

Ｂ１６有良好的体外抑制作用，抑制率分别为６０．４２％，　７３．１２％。ＲＢＰ、ＲＢＰ２ａ、ＳＲＢＰ—Ｂ、ＳＲＢＰ—Ｄ、ＳＲＢＰ２ａ　

—Ｂ样品组对Ｂ１６抑制率都随样品浓度的增加而增　

加，在质量浓度为１　０００　ｇ／ｍＬ，抑制率分别为　１５．３２％、４４．９２％、７３．６５％、６５．５３％、７８．４３％。与　ＲＢＰ样品组相比，ＲＢＰ２ａ样品组显著提高了对Ｂ１６