酶联免疫法与时间分辨荧光免疫法检测HBsAg

时间分辨荧光免疫分析技术
王征
达瑞抗体
a
1
标记免疫学分析技术发展历程
免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶免ELISA (Engvall, 1971) 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 液相芯片(美国Luminex公司, 1997)
孵育
+
铕标记抗原
+
Eu
a
14
中和法示意图(回滴定法)
孵育
+
+
中和抗原 待测抗体
孵育
+
Eu
铕标记抗体
+ 增强液
Eu
a
Eu
+ Eu
15
小分子抗原竞争抑制示意图
固相包被二抗 孵育
+
一抗
+
+
孵育
Eu
待测抗原
铕标抗原
Eu
+ 增强液
Eu
a
+ Eu
16
时间分辨技术重点和难点
固定相（96孔板） 标准品 铕标记物
肿瘤科检查 传染病检查 妇产科检查
糖尿病系列：insulin、C-Peptide
生长激素：hGH
其他：Cortisol
AFP、CEA、tPSA 、β2-MG 、hTG、 CA-242、CA-724 、 CA-50 、 fPSA 、 NSE 、 cyfra 211 、 CA-199、CA-125、 CA153

胃癌筛查时血清胃蛋白酶原4种检测方法的比较分析目的比较分析血清胃蛋白酶原4种检测方法在胃癌筛查时的敏感性和特异性。

方法采用放射免疫分析法（RIA）、时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）、乳胶增强免疫比浊法、酶联免疫法（ELISA）4种检测方法，检测98例胃癌患者及137例正常对照者血清中的胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）的含量并计算两者比值（PGR）。

根据不同检测方法的临界值，严格判读阳性例数及阴性例数。

结果RIA、TRFIA、乳胶增强免疫比浊法、ELISA的敏感性分别为74.49%、71.43%、68.37%、63.27%，特异性分别为73.00%、75.18%、78.10%、83.21%。

4种检测方法敏感性和特异性相比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

结论对于4种检测方法，不同医院可视自身情况进行选择。

RIA法试剂具有放射性且有效期短，可不作为首选。

有条件的大医院可选用TRFIA法、乳胶增强免疫比浊法，基层医院可选用ELISA法。

血清中胃蛋白酶原（PG）的检测，作为胃癌筛查的血清学指标已广泛应用于临床［1］，其检测方法有多种。

本文对临床较常见的检测4种检测方法进行了对比分析，现报告如下。

1 资料与方法1.1 一般资料选取健康体检者自愿进行胃镜检查，未发现胃部黏膜有任何异常者137例作为正常对照组，其中男90例，女47例，平均年龄（48.73±10.58）岁。

选取在本院经胃镜及病理检查确诊的未经过任何治疗的胃癌患者98例，其中男68例，女30例，平均年龄（56.97±7.84）岁。

1.2 方法受试者采集空腹静脉血3 ml，分离血清后，-20 ℃保存。

检测前1 h血清复融，并离心取上清液检测。

放射免疫分析法（RIA）法试剂盒由江苏原子医学研究所提供。

仪器采用西安XH-6020放射免疫r计数仪。

时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）法试剂盒由江苏原子医学研究所提供。

符合 率为 ９ ． ％， ７ ３ 灵敏 度为 ９ ．１ ， ７ ％ 特异 性为 ９ ５
作 者 简 介 ： 彪 （９ ３ ， ， 西 钦 州 市 人 ， 管 技 师 ， 要 从 事 临 熊 １６ 一）男 广 主 主
５ ， 统计学 分析 ， ％ 经 两种 方法 的检 出率差 异无统 计 学意 义 （ Ｐ＞００） ．５。见表 １ 。
较， 差异均无统计学意义 （ Ｐ＞００ ） 但 ３ ．５ ， 项指标的符合率 Ｅ ＩＡ法均不如 Ｔ ＦＡ法高 ， ＬＳ ＲＩ 在检测 临床标本 时， Ｅ Ｉ 用 ＬＳ Ａ法 测定 Ｈ ｓｇ Ｈ ｅ ｇ和 Ｈ ｅ ｂ比Ｔ ＦＡ法易 出现假 阴性 ， ＢＡ 、 Ｂ Ａ ＢＡ ＲＩ 测定 Ｈ ｅ ｇ 抗 一 Ｂ 时 ， ＢＡ 、 Ｈ ｅ 这两种方法都有假阳性可能。 结论 间分辨荧光免疫法是 目前临床上用于检测 乙型肝炎病毒血清学标志物的较为灵敏 、 特异 、 准确 的的检测方法 。 【 关键词 】 乙型肝 炎病 毒血清学标志物； Ｍ Ｉ ；Ｔ ＦＡ； Ｅ ＩＡ ＥＡ Ｒ Ｉ ＬＳ
告如 下 。 １ 材 料与方 法 １ １ 标 本来 源 ． ２０例为 ２０ 年 ３ ６月广 西 医科 ６ ０７
步骤均严格按照仪器及试剂盒说明书进行 。 １４ 统计学处理 采用 ＳＳ 统计软件包 ，进行配 ． ＰＳ 对设计 的 Ｘ 检验 。
２ 结 果
２ １ Ｔ ＦＡ法 与 ＭＥＡ法 检 测 结 果 的 比较 见 表 ． Ｒ Ｉ Ｉ
灵敏度 的定量 检测 方法 ， 应用 范围逐 渐扩 大 “ 。本 ］ 文采 用 Ｔ ＦＡ法和 Ｅ ＩＡ法 同时对 乙型 肝炎 患者 血 ＲＩ ＬＳ 清标 本 的 Ｈ ｓｇ ＢＡ ＢＡ 、Ｈ ｅｇ和 Ｈ ｅｂ３ 标 志物 进行 ＢＡ 种 检测 ， 以 Ｍ Ｉ 做 为金标准 进行 对 比分析 ， 并 ＥＡ法 现报

４ ． ５ ０ ％、 ４ ． ７ ５ ％， 阳性率差异 比较无统计学意义（ Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） 。结论 ： 时间分辨法与酶联免疫法在梅 毒筛查实验上敏感性 基 本 相 同。
【 关键词 】 梅毒 （ Ｔ Ｐ 性传播疾病之一 ， 并且有逐 年上 升 的趋 势 ，它带 来 了严 重 的公 共 卫 生 问题 ， 母 婴传播 、 性传播和血液传播是其主要的传播途径Ⅲ 。 应用方法 简便 、 容易操作 、 灵敏度高的实验方法能 够 及 早 发现 ， 可有 效 减少 疾病 的传 播 。我 们 采 用 了 两种 检测 方法进行 了实验 ，并对实验结果进行 对 比， 现 报告 如下 ： １ 材料 与 方法 １ ． １ 标本 选择 ２ ０ １ ２年 ｌ ０ 月一 ２ ０ １ ３ 年 ４月 ， 我院 门诊及住院患者进行梅毒血清检验标本 ４ ０ ０ 份。 １ ． ２ 试剂 、 仪器 安图酶标仪 （ Ａ ｕ ｔ ｏ ｂ ｉ ｏ ． Ｐ Ｈ Ｏ Ｍ Ｏ ） ； 安 图洗板机 （ １ ｗ ｏ Ａ ｕ ｔ ｏ ． ｂ ｉ ｏ ） ；时 间 分 辨 仪 （ Ｅ Ｆ Ｆ Ｉ Ｃ Ｕ Ｙ Ａ Ａ ｕ ｔ ｏ ｍ ａ ｔ ｉ ｎ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ Ａ Ｎ Ｙ ｔ ｅ ｓ ｔ ） ；英科新创梅毒酶联免疫 ９ ６人份 ／ 盒试 剂盒 。 １ ３ 方 法 根 据 说 明 书对 ２ ０ １ ２年 ｌ ０月 ～ ２ ０ １ ３年 ４月份 的 ４ ０ ０份 标 本分 别用 时 间分 辨法 和 酶联 免 疫 法 进行 检测 。 １ ． ４ 原 理 高纯 度 Ｔ Ｐ特 异性 抗原 （ 通常 分 子质量 为 １ ５ ５ ０ ０ 、 １ ７ ０ ０ ０ 、 ４ ４ ５ ０ ０ 、 ４ ７ ０ ０ ０的 蛋 白质 ） 包 被 于微 孔反应板 ， 待测血清中如存在抗 １ ＇ Ｐ 抗体 ， 即可与之 结合。再与加入酶标记的高纯度 Ｔ Ｐ 或生物素标记 的Ｔ Ｐ抗 原 ，在 固相 上 形 成 ｒ ｒ Ｐ抗 原 一抗 Ｔ Ｐ抗 体 一 酶标 记 的 １ １ Ｐ 抗 原 夹 心 复合 物 或 Ｔ Ｐ抗 原 （Ｉ） 一抗 Ｔ Ｐ — Ｔ Ｐ抗 原 （ Ⅱ） 一生物 素 一链 亲 和 素 一 Ｅ ｕ复合 物 ， 待 加 入显 色 剂 或荧 光增 强 液 ， 呈 色 强度 或 荧 光 强度 与抗 Ｔ Ｐ水平 成正 比。 １ ． ５ 统 计 学 分 析 数 据 比较 采 用 检 验 ， Ｐ＞ Ｏ ． ０ ５ 为 差异 无统 计学 意义 。 ２ 结 果 ２ ． １ 酶联免疫法 筛查 出 １ ８ 份 阳性标本 ，其 中 ， ２ ０ １ ２年 ｌ ０月 ２份 、 ｌ ２月 ３份 ； ２ ０ １ ３年 １月 ３份 、 ２ 月 ３份 、 ３月 ２份 、 ４月 ３份 。２ ０ １ ２年 １ ０月 和 ２ ０ １ ３ 年 １ 月 各有 ２份 标本 为弱 阳性 。 ２ ． ２ 时间分辨 法 筛查 出 １ ９份 阳 性 标 本 ，仅 在

酶联免疫法和胶体金法测定HBsAg的比较目的比较酶联免疫法和胶体金免疫层析法测定乙肝表面抗原的结果,为实验室工作提供参考。

方法对我站10493份血清标本分别采用酶联免疫法和胶体金免疫层析法测定乙肝表面抗原,对结果进行比较分析。

结果酶联免疫法和胶体金免疫层析法的检测阳性率分别为0.48%、0.40%,两者比较无显著性差异(χ2=0.6987,P>0.05);两种方法检测标本符合率为99.81%,胶体金试纸法的灵敏度为72.00%,特异度为99.94%。

结论酶联免疫法和胶体金免疫层析法均为测定乙肝表面抗原的可靠方法,但胶体金免疫层析法的灵敏度有待提高。

标签：乙肝表面抗原; 酶联免疫法; 胶体金免疫层析输血是乙肝病毒经血液传播的重要途径之一,为了防止乙肝病毒经输血传播,提高血液质量,对献血者进行乙肝病毒表面抗原检测是有效的防范措施之一。

乙肝病毒表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)的外膜蛋白,可在感染HBV后早期出现,本身不具有传染性,但它的出现常伴随乙肝病毒的存在,所以它是已感染乙肝病毒的标志[1]。

本研究比较酶联免疫法和胶体金免疫层析法测定乙肝表面抗原的结果,现将相关资料总结报道如下。

1 材料与方法1.1 标本来源来源于2009年2～4月我站自愿无偿献血者的血液标本,EDTA-2Na抗凝,经正确处理血液标本得到待检血浆,共计10493份。

1.2 试剂①乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)(英科新创科技有限公司,批号:2008085111);②乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(胶体金法)(英科新创科技有限公司,批号:2009010102);③质控血清(卫生部临检中心,批号:090040);所有试剂均严格按说明书要求进行操作。

1.3 仪器加样器:STAR;全自动酶标仪:FAME或加样器:TECAN RSP 150;洗板机:TECAN ;酶标仪:SUNRISE1.4 方法对10493份自愿无偿献血者标本,采用两种不同的方法进行检测,初次检测反应性标本用原试剂双孔复查。

是检测抗体最常用的方法, 本法主要用于对病原体抗 体的检测而进行传染病的 诊断
只要变换包被抗原就 可利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗体
小分子抗原如激素和药物 快，只有一次保温洗 等ELISA测定多用此法。 涤过程
竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质 不易除去，或不易得到足 够的纯化抗原时，可用此 法检验特异性抗体
--
Y
酶标仪450nm波长 或双波长450/630nm
固 相 抗 体 抗 原 酶 标 抗 体 免 疫 复
Y 合 YYYYYY 物
OD值
加终液50ul 37℃育温15分钟 加底物液A和底物液B各50ul
洗板5次 37℃育温（ ）分钟
酶工作液50ul 血清样本
根据校准品浓度对应的 OD值，使用双对数线 拟合方式 log（x）-log
（Y）计算结果 =concentration（浓度） ×样品稀释倍数＝样品
最终浓度
高特异性高敏感性鼠人抗（ ）单克隆抗体作为包被抗体
CRP、ALB、BTAA
•双抗夹心法适用范围
待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相 载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。
此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、 HBeAg、AFP、hCG、CRP、ALB、BTAA等。不能用于分子量 小于5000D的半抗原或小分子单价抗原的测定。
㈠ 磁珠碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图
三、电化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以 三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性 化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。

ｔｏ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ＴＲＦＩＡ，ＲＩＡ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ＲＩＡ．ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｒａａｓｓａｙ
ｒａｎｇｅ
１
１ ０００ ｎｇ／ｍｌ ｆｏｒ ＴＲＦＩＡ，５～４００ｎｇ／ｍｌ ｆｏｒ ＲＩＡ ａｉｌ（｛５～３００ｎｇ／ｍｌ ｉｎｔｅｒａｓｓａｙ ＣＶ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ ｓｅｒｕｍ
ｏ（－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ
ＣＨＥＮ Ｈａ／一ｗｅｉ。ｅｔ
ｂｙ ＴＲＦＩＡ，ＲＩＡ ａｎｄ
ａｌ
ＥＬＩＳＡ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ
ｄ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｉｎ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔａｒｙ，ｔｈｅ
２结果
２．１线性比较
将ＡＦＰ标准品（苏州新波生物技术有限公司提 供）１ ０００ｎｇ／ｍｌ按不同的浓度稀释后做线性实验。 结果显示，ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法和ＴＲＦＩＡ法分别当 ＡＦＰ浓度在５～３００ｎｇ／ｍｌ、５～４００ｎｇ／ｍｌ、１—１ ｍｌ范围内呈现良好的线性关系。 ２．２精密度试验比较 取一混合血清（ＡＦＰ含量为６２ｎｇ／ｍ１）分别用３ 种方法同时平行２０次计算批内误差；连续１０ｄ，次 ／ｄ，计算批间误差，结果见表１。 ２．３对比试验 将随机抽检的３０份病人血清标本分别用３种 方法进行检测，并对３种方法进行比较。回归方程： 设Ｙ为ＲＩＡ法所测ＡＦＰ含量，Ｘ。为ＴＲＦＩＡ法所测 ＡＦＰ含量，ｘ：为ＥＬＩＳＡ法所测ＡＦＰ含量，结果见表
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ

酶联免疫试剂
• 抗原抗体之间的特异反应与酶的高效催 化反应有机的结合。 固相 样品 放大
• 抗原 抗体 抗抗体-酶-底物-显色 • 抗体 抗原 抗体-酶-底物-显色
丙肝抗原 ELISA试剂
HRP酶 单克隆抗体
HRP 酶标记抗HCV抗体
酶标板
样品中HCV 抗原 抗 HCV 抗体
HIV-1 p24抗原检测试剂的原理
• 多肿瘤标志物检测试剂盒（蛋白芯片法）
NS4
NS4
NS3
NS3
总
总
C
C
NS5
NS5
（C代表核心,NS3,NS4,NS5代表 非结构区抗原）
阳
阴
空
性
性
白
对
对
对
照
照
照
每张芯片检测48个样本，每个样本同时检测5个指标，
丙型肝炎病毒分片断抗体检测蛋白芯片
（第五类） 单抗类试剂
• 血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单 克隆抗体）
发光免疫试剂
• 1.抗原抗体反应的基本原理及方法模式与 酶联免疫试剂完全相同
• 2.检测光信号，其光信号可因酶催化而产 生也可用其他方法使其产生
酶促化学发光
• 以酶为催化剂，通过氧化反应，使 底物发光。 过氧化物酶（HRP )促发光，底 物——鲁米诺 碱性磷酸酶(AP )促发光，底物——
商业化产品中常见的化学发光系统（一）
• 酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂盒（酶 联免疫法）；
• 癌胚抗原定量测定试剂盒(免疫荧光法) • 化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒
• 增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测 试剂盒
• 时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测 定试剂盒

ｄ ｔｃｅ ｄ ｃ ｍｐ ｒ ｄ Ｔ ｅ ｉ ｃ ｎ ｉ ｅ ｔｒ ｓ ｌ ｒ ｅ ｔ ｄ ａ ａｎ ｗ ｔ ｌ ｃ ｏ ｈ ｍｉａ ｌ ｍｉ ｅ ｃ ｎ ｅ ｉ ｓｒ ｍｅ ｔ ｅｅ ｔｄ ａ ｏ ａ ｅ ． ｈ ｎ ｏ ｓｓ ｎ ｅ ｕ ｔ ｗｅ ｅ ｔｓｅ ｇ ｉ ｉ Ｅ ｅ ｔ ｃ ｅ ｃ ｎ ｔ ｓ ｈ ｒ ｌ ｕ ｎ ｓ ｅ ｃ ｎ ｔｕ ｎ ， ｎ ｌ ｓｓｏ ｔ ｅ ｕ ｔ Ｒｅ ｕ ｔ ａ ａｙ ｉ ｅ ｒ ｓ ｌ ． ｓ ｌ Ｔ ｔｏ ｓｆ ｒｔ ｅ ｄ ｔｃｉｎ ｏ ｅ ａ ｔ ｉ ｓ ｍａｋ ｒ ｏ ｓｎ ｔｅ ｉｔｓｇ ｉ ｃ ｔ ｆ ｈ ｓ ｓ ｗｏ ｍｅ ｄ ｅｅ ｔ ｆｈ ｐ ｔ ｓ Ｂ ｖｒ ｒ ｅ ８ｄ ｅ ｏ ｘ ｓ ｉ ｎｆ ａ ｈ ｏ ｈ ｏ ｉ ｉ ｕ ｉｎ ｄ ｆ ｒ ｎ ｅ ｂ ｔ ＲＦ Ａ ｉ ｒ ｖ ｅ ｅ ｌ ｅｅ ｔ ｎ ｒｔ ｆｉｆ ｃ ｏ ｉ ｅ ｅ ｃ ， ｕ Ｔ Ｉ ｍｐ ｏ ｅ ｔ ａ ｙ ｄ ｔｃ ｏ ａｅ ｏ ｅ ｔ ｎ，Ｓ ｒ ｃ ｔ ｏ ｙ ｑ ａ ｔ ｔ ｅ ａ ａｙ ｉ Ｃ ｒ ｓ ｅ ｈ ｒ ｉ ｎ ｉ ｕ ｆ ｅａ ｉ ｄ ｕ ｉ ｉ ｎ ｓ ａ ｇａ ｐｔ ａ ｎ ｂ ｎ ｔ ｖ ａ ｌ ｓ ｎ ｈ ｉ ｔ ｎ ａ ｃｎ ｔ ｎ， ｌｗ ｒ ｆ ｓ ｏ ｋ ｖ ｄ ｆ ｓ ｅ ａｉｅ ｒｔ ， ｅ ｍｅ ｏ ｓ ｗ ｒ ｐ ｐ ｌｒ ｉｇ ｍｉ ｇ ｏ ｖ ｃ ｉ ａ ｏ ｆ ｉ ｏ ｅ ａ ｅ ｐ ｓ ｉｅ ａ ａ ｅ ｎ ｇ ｔ ａ ｅ ｔ ｔ ｄ ｉ ｏ ｔ ｏ ｕ ａｉ ｎ ．Ｃｏ ｃｕ ｉ ｎ ｌ ｎ ｌ ｖ ｈ ｈ ｈ ｚ ｎ ｌ ｓｏ ｓ Ｔ ｍｅ ｒｓ ｌｅ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｍｍｕ ｏ ｓ ａ ｏ ｅ ｅ ｔ ｎ ｏ ｅ ｍ ｒ ｋ ｒ ｆｈ ｐ ｔ ｉ Ｂ ｖｒ ｓ ｈ ｄ ｇ ｏ ｓ ｎ ｉ ｖｔ ｄ ｉ － ｅ ｏｖ ｄ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｉ ｌ ｎ ａ ｓ ｙ ｆ ｒｄ ｔ ｃ ｏ ｓ ｒ ｉ ｆ ｕ ｍａ ｅ ｏ ｅ ａｉ ｓ ｉ ａ ｏ ｄ ｅ ｓ ｉ ａ ８ ｔ ｕ ｉ ｔ ｙｎ

乙肝病毒血清标志物检测与临床价值摘要】使用探讨时间分辨荧光免疫测定法，进行定量检测乙型肝炎血清标志物和酶联免疫吸附试验定性检测的关系，有着非常重要的临床应用意义。

采用检测86份血清标本HBV-M方法，可以得出两种检测方法，同时具有较高一致性意义，但是利用TRFIA检测会明显高于ELISA。

【关键词】乙肝病毒；血清标志；检测；临床价值乙型肝炎属于病毒性肝炎，也是流行最广泛和危害最严重的病毒肝炎，乙肝血清标志物检查仍然是目前临床诊断和治疗病毒感染者传染非常重要的标志。

血清标志物检测是目前对于乙型肝炎检测最常用指标，临床上常用的免疫检测方法主要就是放射性技术，时间分辨荧光免疫分析法的研究分析更加突出其优越性，本文通过对于酶联免疫吸附和时间分辨测定检测差异性进行一定临床价值分析。

一、乙型肝炎检测方法1、一般资料显示，于2007年我中心对于患有乙肝患者进行检测，其中男士42例，女44例，年龄是5～58岁之间，采用静脉血分离血清置-70℃进行保存。

2、试剂使用上海新波生物技术有限公司的HBSag和抗-HNE定量检测试剂盒，另外还有卫生部临检中心提供的乙肝病毒血清标志物质控品，然后按照操作，严格按照作业指导书进行测试。

3、仪器是Anytest2000型时间分辨荧光免疫分析仪，判定结果方法是参照实际说明书判定，经过本室严格进行检测工作，不同浓度标准对应不同法定性检测结果，抗-HBc大于或者等于0.6NCU/ml判定为阳性，反之是阴性。

使用TRFIA法和ELOSA法检测HBVM结果相互比较，86例血清标本中，除了对于抗-HBE检测结果也是两种方法，可以很好分别出差异性，其他的单个项目检测无统计意义。

二、乙肝病毒传播方法1、乙肝病毒是全球传染非常广泛的传染病，以HBV感染数和HBSAG携带率估算，全世界病毒携带者就有3.5亿人，其中亚非拉地区有2.8亿，中国就有1.2亿人，占全世界总携带者的三分之一。

所以要加强对于乙肝病毒携带者的防止工作，保障我国人民健康，促进经济发展和社会整体进步工作，都需要一定合理医疗和防止措施。

免疫标记：四大免疫标记原理介绍！为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。

常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。

这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。

免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断提供方便。

免疫标记技术大致分为两大类：一类属于免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)，用于组织切片或其他标本中抗原的定位。

另一类称为免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的测定。

一，免疫酶技术(immunoenzymatic technique)最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。

目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。

该法特异性强，敏感性高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。

主要方法及操作要领见图18.5，除了图示的两种方法外，还有抗原竞争法，现较少应用。

ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，底物被分解则呈棕褐色，可目测或借助酶标仪比色。

ELISA为非均相免疫测定，另外还有均相法，在此不作介绍。

由于酶免疫测定无需特殊仪器和试剂，且操作简便，利于普及。

因此，在免疫标记技术中，该法应用最为广泛，并在原有方法基础上加以改良，使得众多新的，更敏感的方法应运而生。

①生物素-亲和素放大系统(biotin-avidin system，BAS)，建立于70年代后期，通过将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲力和生物素能与抗体结合的特点应用于ELISA，显著提高了检测的敏感性。

Ｃ Ｃ 中 医 临床 研 究 ２ １ 年 第 ２ 第 ２ 期 ＪＭ ００ 卷光 与 Ｅ ＩＡ 法 检 测 ＬＳ
乙 型 肝 炎 病 毒 血 清 标 志 物 结 果 的 比 较 与 分 析
Ａｎ ａ ａｙ ｉ ａ ｄ ｃ ｍｐ ｒｓ ｎ ｏ ｅｄ ｔ ｃｉ ｎ ｏ ｐ ｔ ｉ ｎ ｌ ｓｓ ｎ ｏ ａ ｉｏ ｎ ｔ ｅ ｅ ｔｏ ｆ ｈ Ｈｅ ａ ｉ ｓ ｔ Ｂ
析。结果：Ｔ ＦＡ法 Ｈ ｓ ｇ灵敏度 （ ． ｇｍ１ ＲＩ ＢＡ ０ ｎ ／ ）高于 Ｅ ＩＡ 法，Ｔ ＦＡ 法 Ｈ ｓ ２ ＬＳ ＲＩ Ｂ Ａｇ线性检 测范 围在 ０ ． ０ ｎ ／ ，且 Ｔ ＦＡ法 ２～２ ０ ｇｍｌ ＲＩ
的特异性优 于 Ｅ ＩＡ法 ，Ｅ ＩＡ法在检 测 Ｏ ＬＳ ＬＳ ． ｎ ／ 时易出现假 阴性 ；且 Ｅ ＩＡ法 易出现 ＨＢ Ａ 、Ｈ ｅ ５～１ｇｍｌ ＬＳ ｓ ｇ Ｂ Ａｇ或 Ｈ ｅ ｂ假 阴性 ， ＢＡ Ｈ ｃ ｂ假 阳性 ，导致其他模 式增多。结论 ：Ｔ ＦＡ 法具有 测量范围宽、灵敏度 高、特异性强等优点，在临床检 测 ＨＢ 中具有 广 ＢＡ ＲＩ Ｖ
ｔ ｓ ａ ｄ ｄ ｏ ｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ＦＩ ｍｅｈ ｄ Ｍ ｅｈ ｄ ： ｏ ＨＢｓ ｓ ０ ａ ｅ ｆｓ ｒ ｍ ａ ｌ ｓＨＢｓ ｙ ＴＲ Ｉ ａ ｄ Ｅ Ｉ Ａ ｎ ｅ ｔ ｎ ｏ ｓ ｍｅ ｒ ｓ ａ ｃ ｎ ＴＲ Ａ ｔ ｏ ． ｔｏ ｓ Ｔ ｄ ｏ Ａｇ ｔ ｔ２ ０ ｃ ｓ ｓｏ ｕ ｓ ｍｐ ｅ ｅ ｅ Ａｇ ｂ Ｆ Ａ ｎ Ｌ Ｓ ａ ｄ ａ ｏｈ ｒ ０ ｅ ｔ ｄ ｂ ｎ ｔ ｅ ０ ｔ ｓｅ ｙ ＨＢＶ Ｍ ｅ ａ ａｅ ｙ ａ ｅ ｓ ｍｅ ｔ ０ ｃ ｓ ｓｏ ａ ｄ ｒ ｌ ｏ ｉｈ ＨＢｓ ｓｔ ｓｅ ｎ ｎ ｌｚ ｓ ｙ Ｅ Ｓ ２ － ｓ ｐ ｒ ｔｌ ， ｔ ｈ ａ ｍｅ２ ａ ｅ ｆｓ ｎ ａ ｄ ｂ ｏ ｄ ｉ ｗｈ ｃ ｔ ｉ ｔ ｎ Ａｇ ｗａ ｅ ｔ ｄ ａ ｄ ａ ａｙ ｅ ＬＩ Ａ ｂ

判 断 ， 不 能 判 断 乙 肝 两 对 半 具 体 含 量 ， 能 完 成 ＨＢ 感 染 但 不 Ｖ
的 动 力 学 观 察 ， ＴＲ Ｉ 而 Ｆ Ａ是 ８ Ｏ年代 初 发 展 起 来 的 一 项 超 微 量 免疫 分 析 技术 ， 由于 采 用 了稳 定 的稀 土元 素标 记 和增 强 液 的 放
且 ＨＢ Ａｇ的 浓度 处 在 一 个 较 低 的 范 围 （． ～ １ ｇ ｍ１， 法 符 合 率 为 ９ ； 抗 乙 肝 病 毒 表 面 抗 体 （ 一 ｓ 的 ｓ Ｏ ５ ０ｎ ／ ） 两 ７ 对 抗 ＨＢ ） 检测 ，ＬＳ 法有 ２ Ｅ ＩＡ Ｏ例 阳性 ， 用 Ｔ Ｉ 法 检 测 有 ２ 而 ＲＦＡ ８例 阳性 ， 法 符合 率 为 ９ ； 乙 肝病 毒 ｅ 原 （ ｅ ｇ 的 两 ８ 对 抗 ＨＢ Ａ ） 检 测 ， Ｌ Ｓ 法 检 测 ３ 例 阴性 ， 用 ＴＲ Ｉ 法 检 测 为 阳性 ， 法 符 合 率 为 ９ ； 抗 乙 肝 病 毒 ｅ抗 体 （ ＨＢ ） Ｅ ＩＡ １ 而 ＦＡ 两 １ 对 抗一 ｅ 的 检测 有 ４ ４例 Ｅ ＩＡ 法 结 果 阴性 ， 用 Ｔ Ｆ Ａ 法 检 测 结 果 为 阳 性 ， 法 符 合 率 为 ８ ； 抗 乙 肝 病 毒 核 心 抗 体 ＬＳ 而 Ｒ Ｉ 两 ８ 对 （ 一 ｃ 的检 测 有 ５ 抗 ＨＢ ） ２例 Ｅ Ｉ Ａ 法 检 测 结 果 阴 性 的 患 者 ， 用 ＴＲ Ｉ 法 检 测 结 果 为 阳性 ， 法 符 合 为 ８ 。 结 论 ＬＳ 而 ＦＡ 两 ６ ＴＲ Ｉ 法灵 敏 度 明显 高 于 Ｅ ＩＡ 法 ， 于 一 些 弱 阳 性 标本 Ｅ ＩＡ 法 检 测 不 到 时 ， Ｆ Ａ 法 仍 可 以 检 出 。ＴＲ ＦＡ ＬＳ 对 ＬＳ ＴＲ Ｉ —

如何正确判读免疫检测灰区探讨摘要】目的：我们的实验室如何去规范操作酶联免疫检测，是我们实验室应该做的一件大事，不认真对待灰区的出现，就会引发和滋生错误的报告发生。

灰区应该有一个可操作性“规定”，在没有一个统一规定的情况下，实验室就无法做好工作。

方法：通过165296例酶联免疫检测，总结出来灰区出现如何处理的路子-方法。

结果：根据总结的方法完成制度管理和SOP文件，按照执行这些方法和文件，让我们在灰区出现时能够正确处理，近两年来，我们按照科室制定的制度执行操作，没有在灰区的问题上出现误差和失误。

【关键词】灰区；免疫；复检【中图分类号】R446【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）14-0354-02酶联免疫检测，这个定性试验，经过多年的实验室应用，为检验事业的发展、为免疫性疾病患者解决了不可磨灭的功劳，也为医务工作者争得了名誉。

但对于检验工作者，也带来了一些不好解决的难题—灰区[1] [2] [3]问题；酶联免疫检测结果报告，按照相关规定，只能出具阴性或者阳性报告，模棱两可的报告确实难倒了检验工作者。

用ELISA方法检测的各种免疫试验，如乙肝两对半、丙型肝炎、艾滋病、丁肝、戊肝、ANA、甲肝等，都存在着灰区的问题，我们如何在工作上，对这个问题进行分析处理，我们做了这方面的研究分析。

1.对象与方法1.1 研究对象选择2012年至2014年，两年在我院的乙肝表面抗原58997例、丙型肝炎抗体检测49234例、艾滋病抗体检测49076例、丁型肝炎抗体581例、戊型肝炎抗体检测669例、甲型肝炎抗体检测4112例，ANA2597人次，检测样本共计165296例。

1.2 方法其中乙肝两对半是用达安的时间分辨检测的，灰区相对要少些；ANA采用欧蒙酶联免疫检测试剂盒；其他项目全部采用北京万泰的酶联免疫检测试剂盒。

2.结果通过两年的检测，共检测出灰区169例，其中乙型肝炎表面抗原39例，采用的是时间分辨检测，检测灰区值最高0.58，最低0.43。

电化学发光免疫法和酶联免疫法检测乙肝病毒标志物结果准确性的比较目的分析比较电化学发光免疫法（ECLIA）和酶联免疫法（ELISA）检测乙型病毒性肝炎（HBV）标志物检测结果的准确性。

方法选取2015年1月～2017年1月在我院就诊的160例乙型肝炎患者，随机分为观察组（80例）和对照组（80例）。

观察组使用ECLIA法，对照组使用ELISA法，比较两组的HBV 标志物阳性率，再在观察组中选取HBsAg/Ab和（或）HBeAg/Ab双阳性的患者，采用ELISA法检测，观察其检测结果。

结果观察组的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb阳性率分别为100.0%、52.5%、76.3%、78.8%，均高于对照组的92.5%、45.2%、52.5%、50.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）；ECLIA法对s和（或）e系统双阳性的患者检出76例，相比之下，ELISA法只检出9例。

结论ECLIA 法检测乙肝病毒感染的结果较ELISA法更准确，值得临床推广应用。

[Abstract]Objective To analyze and compare the accuracy of electrochemiluminescence immunoassay （ECLIA）and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）in the detection of hepatitis B virus （HBV）markers.Methods 160 patients with HBV treated in our hospital from January 2015 and January 2017 were selected as research targets，and were randomly divided into the observation group （n=80）and the control group （n=80）.The observation group was given ECLIA and the control group was given ELISA，the positive rates of HBV markers were compared between the two groups.Then in the observation group，HBsAg/Ab and/or HBeAg/Ab double positive patients were selected and detected by ELISA method，and the results were observed.Results The positive rates of HBsAg，HBsAb，HBeAg and HBeAb in the observation group were 100.0%，52.5%，76.3% and 78.8% respectively，which was higher than 92.5%，45.2%，52.5%，50.0% in the control group，with significant difference （P＜0.05）.The number of patients with the s and/or e system double positive detection results by the method of ECLIA were 76 cases，but the number by the method of ELISA were comparatively 9 cases.Conclusion Compared with ELISA，ECLIA is more accurate in the detection of HBV infection，therefore，it is worthy of wide clinical promotion and application.[Key words]Electrochemiluminescence immunoassay；Enzyme-linked immunosorbent assay；Hepatitis B virus我國的乙型肝炎发病率较高，约有12%为平时无自觉症状的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）携带者[1]，乙肝感染者如不及时治疗，可发展为肝炎、肝硬化、肝癌等重大疾病[2]，因而准确地诊断乙肝病毒（HBV）标志物，选取敏感度和特异度高的检测方法，对及时防治乙肝有着重要的意义。

时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：1、时间分辨原理：用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。

根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。

2、时间分辨原子标记物的特点：●发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性●长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度●半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性原子标记与大分子标记物的对比3、波长分辨：●标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。

●激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性。

4、时间分辨：●标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。

●每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值，有利于提高检测的准确性。

时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！RIA（放免）●放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消，如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。

●125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。

●由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准曲线无法保存备用。

ELESA（酶免）●灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。

酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。

与其它技术的相对优势：（1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的（2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的（3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的TRF技术与电化学发光的比较TRF与化学发光的比较时间分辨荧光免疫定量分析简介时间分辨荧光分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。