猪肉中瘦肉精的检测

猪肉中瘦肉精的检测摘要鉴于盐酸克伦特罗(瘦肉精)在动物性食品中的残留对人体和国民经济造成了巨大的危害，本文介绍了动物肌肉组织中残留盐酸克伦特罗(瘦肉精) 的几种分析检测方法，并对未来的发展方向作了展望。

关键词：瘦肉精GC-MS HPLC ELISA1 引言瘦肉精是一类药物，而不是某一种特定的药物，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。

在中国，通常所说的瘦肉精是指克伦特罗(Clenbuterol，CLB)【1】，而普通消费者则把此类药物统称为瘦肉精。

当它们以超过治疗剂量5—10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此，β—受体激动剂被大量非法用于畜牧生产，其中最常用的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。

长期食用含有β—受体激动剂残留的食品将对人体健康产生极大的危害，可诱发和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、脸、颈部骨骼肌震颤；另外还能引起代谢紊乱，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒【2】。

盐酸克伦特罗(Clenbuteerol，CLB) ，又名克喘素、氨哮素、双氯醇胺，俗名瘦肉精，化学名为α—[ (叔丁氨基) 甲基]—4—氨基—3，5—二氯苯甲醇盐酸盐，分子式为C12 H18Cl12N2O•HCl ，相对分子质量为313.65。

目前，检测瘦肉精残留常用的色谱技术有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱—质谱联用法(GC—MS)、高效液相色谱—质谱联用法(HPLC—MS) 、毛细管电泳法(CE)等。

中国已将高效液相色谱法（HPLC）作为检测饲料中盐酸克伦特罗残留的半确证法，将GC—MS 法定为确证性方法，主要用于最后确认和仲裁。

对于动物性食品，GB/T 5009.192—2003 “动物性食品中克伦特罗残留量的测定”规定的第一法为气相色谱—质谱法，第二法为高效液相色谱法，第三法为酶联免疫法。

下面将会对这三种方法逐一进行说明，并简单介绍毛细管电泳法（CE）【3】。

2 动物性食品（猪肉）中盐酸克伦特罗的检测方法2.1 气相色谱—质谱法(GC—MS)GC—MS法优点是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机结合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具更高的检测极限。

GC—MS法与HPLC法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低【4】。

下面将以岛津公司采用的GC—MS法检测瘦肉精为例，对仪器与试剂的选择、样品的处理方法等方面进行介绍。

2.1.1仪器与试剂仪器：岛津GCMS—QP2010 Plus；试剂：盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）标准品，内标（Clenbuterol—D9，CLB—D9），N ，O—双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA），C18固相萃取小柱（100 mg，3 mL）标准溶液的配制：准确称取盐酸克伦特罗和内标的标准品，用甲醇配成浓度为1 mg/mL的标准储备液，放置于4℃冰箱中避光保存，使用时用甲醇稀释成1μg/mL的标准使用液和内标使用液。

2.1.2 分析条件色谱柱：Rtx—5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)进样口温度：220℃柱温程序：70℃(0.6 min)—25℃/min—220℃(6 min)—25℃/min—280℃(5 min) 恒线速度方式，柱流量0.9 mL/min不分流进样，进样时间1 min接口温度：280 ℃离子源温度：200 ℃溶剂切割时间：8 min检测离子：CLB：检测m/z 86，187，243，262，CLB—D9：检测m/z 95，187，262以克伦特罗(m/z86) 与内标峰(m/z 95) 的峰面积比校准定量。

2.1.3 样品制备精密称取(2 ± 0.01) g 己绞碎的猪肉于具塞离心管中，加入4 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液，旋涡振荡5 min，超声10 min，12000 r/min 离心5 min后，倾出上清液，沉淀再分别用0.1 mol/L 盐酸4 mL，2 mL 两次提取，提取方法同上，合并上清液。

将上清液全部上样至C18柱，用5 mL 水清洗小柱后，使用0.8 mL 甲醇：20 mmol/L 磷酸溶液=1：1(v/v)的酸化甲醇解析，加磷酸缓冲液调至pH=7，定容至2 mL。

将该溶液以0.1 mL/min的流速推过聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛细管整体柱萃取后，用0.2 mL 的甲醇解析，加50 μL 的内标使用液后以氮吹仪浓缩至干。

加入100 μL 甲苯和100 μLBSTFA，涡旋混匀30 s，置于微波炉中小火衍生5 min。

衍生反应完成后取出冷却至室温后再加入300 μL 甲苯，充分混匀，待气质联用仪进样。

2.1.4 结论该法在样品提取后，用C18小柱和聚（甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯）整体柱进一步富集净化，经N ，O—双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA) 衍生，选择离子监测方式进行气相色谱质谱测定。

该方法具有检测限低、重现性好、回收率高、样品用量少等特点，适合于猪肉样品中盐酸克伦特罗的定性、定量测定。

但GC—MS的缺点是检测过程烦琐、检测时间长、需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。

2.2 高效液相色谱法(HPLC) 【5】HPLC适合测定热不稳定和强极性的β—激动剂及其代谢产物，而且HPLC 可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱(MS)等系统联用，容易实现分析过程的自动化。

HPLC 法【6】中常用的检测器有电化学检测器、紫外检测器。

2.2.1 材料与仪器甲醇：色谱纯；试验用水：均为超纯水；其余试剂：均为分析纯；盐酸克伦特罗标准品：中国药品生物制品检定所；盐酸克伦特罗标准溶液：取盐酸克伦特罗标准品24. 98 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成含盐酸克伦特罗1 mg/mL的标准贮备液，贮于冰箱中，不同浓度的系列标准溶液由标准储备液稀释而得；Dionex AT330 (美国)高效液相色谱仪：由P680四元泵、UVD170U紫外检测器和AT330恒温箱组成；超声波提取器( SB25200BTD) ；离心机(6 000 r/min) ；DSY22型电热恒温水浴锅。

2.2.2 色谱条件色谱柱采用Diamonsil ODS2C18 柱( 5 μm，150 mm ×4. 6 mm I. D) ；检测波长为244 nm；流动相甲醇∶水=26 ∶74；流速1. 0 mL /min；柱温30 ℃；进样量20μL。

2.2.3 样品制备取10 g绞碎肉试样，加0. 1 mol/L高氯酸20 mL 匀浆，超声提取20 min，80℃加热30 min，冷却后离心(4 000 r/min) 15 min。

沉淀加0. 1 mol/L高氯酸5 mL洗涤、离心，将上清液合并，用1 mol/L氢氧化钠调pH至11，加入25 mL 乙醚，振荡提取20 min，回收有机相，再用20 mL乙醚重复萃取2次，合并有机相，蒸发至干。

用0. 1 mol/L HC1溶解，纯水定容至10 mL。

2.2.4 结论目前，中国已将HPLC法作为检测CLB残留的半确证性方法，最低检测限范围为1～15ng/g，其优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，而且假阳性率低，与GC—MS 法相比样品不必衍生【7】；缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，需贵重仪器，在实际应用中受到一定的限制【8】。

2.3 酶联免疫吸附法(ELISA）目前，检测CLB较高效的免疫分析技术是ELISA技术。

早在1992年，Oriundi 就通过ELISA法对尿液和血清中的β—兴奋剂残留进行直接分析，该方法既适于实验室大量样品的检测，也适于屠宰场地少量样品的迅速检测【9】。

目前，英国的Randox Laborato—ries Ltd和德国的r—biopharm公司均开发出了检测肉品、饲料中CLB残留的ELISA试剂盒。

中国在应用EIA检测CLB方面的研究起步晚，但近几年取得了明显的进展，目前已有几种试剂盒研制开发成功【10】。

2.3.1 测定原理“瘦肉精”（克仑特罗）竞争酶标免疫检测的基础是抗原抗体反应。

酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体【11】（第2抗体）。

加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第1抗体）与第2抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原），标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点【12】。

通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。

加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。

【13】在单波长450纳米处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。

2.3.2 样品制备取粉碎的肉样5克，与25毫升50 mmol/L HCl混合，振荡1.5小时。

称6克均质物，加入离心管中。

10~15℃条件下4 000转/分钟或更高的转速离心15分钟。

转移上清液到另1个离心管中，加300微升1摩尔/升氢氧化钠混合15分钟。

加入4毫升500毫摩尔/升磷酸二氢钾缓冲液（pH值3.0），简单混合，并在4℃保存至少1.5小时或过夜。

10~15℃条件下4 000转/分钟或更高的转速离心15分钟。

分离全部上清液，使其升至室温，然后用C18柱纯化【14】。

C18柱纯化样品必须在室温条件下，并严格控制过柱时流速。

用3毫升甲醇洗涤柱子，控制流速为1滴/秒。

用2毫升洗涤液（50毫摩尔/升磷酸二氢钾缓冲液pH值3.0）洗涤柱子。

将肉样的全部上清液进柱，控制流速为每4秒1滴。

用2毫升洗涤液，洗涤柱子，流速为1滴/秒。

用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2分钟，干燥柱子。

用1毫升甲醇洗脱样品，控制流速为每4秒1滴。

在50~60℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂【15】。

用1毫升蒸馏水溶解干燥的残留物，取20微升进行分析。

取10克饲料样品，用10毫摩尔/升盐酸溶解，连续震荡10分钟，用滤纸过滤，在滤液中加入120微升1毫摩尔/升氢氧化钠进行中和，检查pH值，用氢氧化钠控制pH值在6.5~7.5之间，取上清液20微升进行分析，稀释倍数为25。

2.3.3 测定步骤所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温，测定操作在20~24℃下进行。

用盒中缓冲液以体积1∶10的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液，稀释前混匀抗体，不要猛烈振荡。

取出试验需要数量的微孔板条，足够标准品和样品，标准品和样品做2个平行试验，记录标准品和样品的位置。