FISH实验标准操作程序(FISH实验资料一)

FISH实验标准操作程序

（成都新基因格实验室内部完整版）

一 实验目的

通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：

提高优生优育（产前诊断中的应用）、

提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、

对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导

用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融

合基因诊断等）。

二 实验原理

利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本

的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况

三 仪器设备及耗材

（一） 仪器设备：

①：全自动分子杂交仪

②：荧光显微镜及分析软件

③：恒温水浴箱3个以上（小型号）

④：冰箱2台（提供试剂和标本存放， 4摄氏度和-20摄氏度）

⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）

⑥：通风橱（配固定液，等操作）

⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。可离1.5ml管、0.2ml管）

⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）

⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。

10：震荡混匀器

11：计时器，温度计，温度湿度显示器。

12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）

13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。

（二） 耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被

乙醇洗掉。）

大盖玻片（方形，用于镜检）

小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片）

离心管（10ml，1.5ml，200ul）

3ml一次性吸管

个人防护用品,标签纸等。

四 实验样本及试剂

样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组织切片等。

试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075M Kcl、1M Hcl、PBS缓冲液、0.08mg/ml

胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、检测试剂盒等。

（二）各种溶液的配制

2.1：制NaOH溶液

a) 用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。

b) 用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。

c) 摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。

d) 然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用。

2.2：配制20XSSC溶液：

取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其

完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。

2.3：配制2XSSC溶液：

用20×SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0, 封口膜封好，4℃保存备用，

有效期6个月。

2.4：2×SSC/0.1%NP-40配制

50ml 20×SSC(pH 5.3)

0.5ml NP-40

449.5ml 双蒸水

500ml 调pH为7.0 ,封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月。

2.5：系列酒精的配制

取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成70%和85%的酒精，

与无水乙醇共同组成70%，85%，100%的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用；另配制一

上述系列酒精，封口膜封好，-20℃室温保存备用。

2.6：PBS缓冲液：

PBS 1L配方（pH7.4）：

磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，

磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，

氯化钠(NaCl)：8g，

氯化钾(KCl)0.2g，

加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高

温高压灭菌后室温保存。

2.7：0.075M Kcl低渗液：

钾5.59g加入1000ml去离子水中溶解（或Kcl 2.794g溶入500ml去离子水中），备用，

4摄氏度低温保存。

2.8：固定液：

按甲醇（AR）：冰乙酸(AR)=3:1的比例配制细胞固定液，细胞固定液现配现用。

2.9:1M Hcl：

取.9ml浓Hcl加去离子到100ml混匀，4℃保存备用。保存1个月。 2.10：0.08mg/ml胃蛋白酶工作液： A：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MLEP管中，加1ml去离子水溶解，分装到10个200ul离心管中。 B：次使用时，在考普林瓶中加50ml去离子水，加入500ul1M Hcl，加入一管分装的胃蛋白酶溶液（100ul）。 2.11:200ug/mlPK工作液： a PK储存液（20mg/ml）：称取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSC（PH=7.0）溶液中，轻轻摇动，直至PK完全溶解，不要漩涡混匀。-20℃保存。 b 蛋白酶K工作液（200ug/ml）：取0.4mlPK储存液溶于40ml2XSSC（PH7.0）溶液中。

五 实验步骤

（一）：羊水样本FISH实验SOP

一：标本预处理

① ：将新鲜收集到的羊水（10ml）细胞1500rpm离心8min。（转速可调至1500至2000范

围内）。

② ：去上清，加入5ml0.075M kcl低渗液。混匀，后放入37℃水浴30min。（作用：利用

渗透压差使细胞膜破裂，细胞核吸水膨胀。利于探针的杂交。）

③ ：加入2ml固定液预固定，（甲醇：冰乙酸=3:1），混合均匀后1500rpm离心8min。(固

定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性，有极强的细胞穿透能力，在瞬间杀死细胞，

使细胞固定在低渗后的膨胀状态，保证细胞中需要检测的物质不被破坏。)

④ ：去上清，加入5ml固定液固定，混合均匀后1500rpm离心8min。

⑤ ：去上清，加入5ml固定液，混匀后于-20℃保存。

二：样本处理：

① ：取出预固定好的羊水标本，1500rpm离心8min。去上清，加适量固定液（10ml的羊水

样本，根据细胞的多少，一般留1ML左右的固定液），

② ：吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片（滴片前一定要将细胞吹打散开，滴片时保证细

胞均匀散开，不要太密集，也要保证有足够计数的细胞）。自然晾干，56℃烤片30min。

（防止掉片）

③ ：将上步所得玻片置于37℃2XSSC溶液中浸泡10min。(洗涤玻片，增加细胞核的通透性，

模拟细胞的生理环境，保证细胞被检测物质的稳定性。)

④ ：将玻片置于37℃40ml胃蛋白酶工作液中15min。（消化细胞中的各种蛋白，增加组织

通透性，便于探针杂交）。

⑤ ：室温下将玻片于70%、95%乙醇中各脱水2min（梯度脱水）。自然干燥玻片，

三：变性，杂交：

① ：室温（暗室）下按探针：缓冲液=2:8的比例配制探针混合物，放入200ul EP管中，

充分混匀，离心1-3S.

② ：将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，用封片胶封片（保证杂交

环境湿润状态。 ③ 准备杂交仪，75℃5min变性，42℃16h杂交过夜。（杂交仪使用前添加去离子水到保湿

材料上。）

等二天：

① ：用镊子取下封片胶和盖玻片。（如果盖玻片不好下，可以先在2XSSC中浸泡下再去掉）。

② ：玻片洗涤（暗室环境）。将玻片于48℃2XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8min。DOUBLE。

③ ：于48℃0.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%、95%乙醇中脱水各3min。晾干。

（NP-40（乙基苯基聚乙二醇）是一种裂解液，去垢剂，非离子表面活性剂，根据浓度

不同，作用不同，可以看作是聚乙二醇(PEG)的衍生物，1%浓度时能很好地消化细胞膜，

但对核膜没有影响，作裂解液时是一种温和的裂解液，(相对于阴离子表面活性剂十二

烷基硫酸钠（SDS）而言。)）

④ ：复染：将15ulDAPI加入杂交区（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激

发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。

备注：a 加探针后所有操作均应该在暗室环境下，

b 杂交温度的选择。在37℃-45℃均可进行，选择42℃是因为37℃时杂交灵敏度高，但太多非

特异性杂交。45℃杂交特异性高，但灵敏度降低。选择中间42℃比较适宜。

c 在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探

针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH

的稳定性。所以同样的样本及探针在冬天更应该注意温度的控制，或者适当延长浸泡洗涤及消化时间。

d 直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？ 所谓的直标型探针是

指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或

地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合

物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。

e 在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样

的探针进行再次的杂交。

f 0.1%NP-40/2XSSC洗涤非特异性杂交信号时，也洗掉没有杂交上的探针。

g 用于实验的2 X SSC、.01NP-40/2 X SSC洗液、胃蛋白酶工作液、0.01M Hcl、 固定液、 酸

性亚硫酸钠和蛋白酶K工作液不可反复使用。