生态环境学报２０１ １，２０（１０）：１４１８—１４２３ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｅｅｓｃｉ．ｃｏｍ Ｅ・ｍａｉｌ：ｅｄｉｔｏｒ ｅｅｓｅｉ．ｅｏｍ
一株拮抗烟草青枯病菌的真菌的筛选与鉴定
周晓见Ｌ ，陈毓道 ，缪莉 ，董昆明１，２，董夏伟 ，靳翠丽Ｌ
１．扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州２２５１２７；２．扬州大学海洋科学与技术研究所，江苏扬州２２５１２７
摘要：为寻找烟草青枯病的生防微生物，研究采用平板涂布法从重庆烟田健康土壤中分离根际微生物，纯化后得到了５９株 真菌。用滤纸片法从中筛选出１株对青枯雷尔氏菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）有稳定拈抗效果的真菌，其抑菌圈为１０．０ ｍｉｌｌ。 其抑制活性优于或接近于近期发现的其他生防微生物。测定该株活性真菌的全细胞脂肪酸组成，进行菌落和分生孢子形态学 观察，以及ｒＤＮＡ ＩＴＳ区测序，结果表明：该菌株全细胞脂肪酸属性未被收录于ＴＳＢＡ６脂肪酸数据库，而根据形态学观察 结果，以及对所获ｒＤＮＡＩＴＳ区序列的分析，鉴定该株真菌为烟曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）。 关键词：抗菌活性；真菌；青枯雷尔氏菌；鉴定 中图分类号：￥４３５．７２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７４—５９０６（２０１ １）１０－１４１８—０６
烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的重要病
害，１８８０年该病首先在美国的北卡罗来纳州被发
现，此后，在许多产烟国家逐渐演变为烟草上的重 要病害，如日本、澳大利亚、韩国等。在中国，长
江流域及其以南烟区该病普遍发生，其中发病面积
较大、为害较重的有广西、广东、福建、湖南、浙
江等省（自治区）及安徽省的皖南烟区、四川省的宜 宾和泸州烟区等【１】。烟草青枯病病原为青枯雷尔氏
菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＳＯｌａｎａｃｅａｒｕｍ）。一旦发病即可造成 全株死亡，对烟草的产量和质量影响极大，是烟草
上一大毁灭性病害 Ｊ。
截至目前，仍然没有针对青枯病的特效方法【３Ｊ。
目前主要采用的防治方法包括农业防治、化学防治
和生物防治等。农业防治如轮作、培育和推广抗病
品种等，但是烟株的抗性有一定的局限性，品种的
抗性强弱受多方面因素制约，随着种植年限延长，
抗性将逐年丧失；化学防治是利用药剂抑制青枯 病，虽然能起到一定的作用，但是长期大量施用化
学药剂容易使细菌产生抗药性，引起土壤质地变
化，造成环境污染和烟草的药剂残留，严重影响人 体健康【４Ｊ。生物防治选择性强，无污染，不易产生
抗性，对人体无害，是一种具有广阔前景的绿色防
治方法，因此，近年来青枯病的生物防治越来越引 起国内外的重视ｐ曲Ｊ。
目前，运用于青枯病生物防治的因子主要集中
于青枯假单孢杆菌、链霉菌、假单胞杆菌、菌根真
菌和芽孢杆菌等 。其中，寻找既可以不妨碍植
物生长，又能防治青枯病等植物病害的植物根际促 生细菌（ＰＧＰＲ）已经成为生防热点之一【１ 。ＰＧＰＲ 原来是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促 进或对病原菌有拮抗作用的有益的细菌统称。而深
入的研究发现，不仅原核微生物的某些放线菌或者
细菌都可以起促生作用，而且作为真核微生物的许
多真菌也同样具有具有促生功能。但研究者仍用
ＰＧＰＲ来泛指包括细菌、放线菌和真菌在内的植物
根际促生微生物。根际促生微生物能够在根际土壤
中快速增殖，并能抑制有害微生物和位于根部表面
的土壤中的致病菌，一些根际促生微生物还有刺激 植物生长的作用ｌ１４Ｊ。但是，总体而言，促生真菌的
研究相对较少Ｌ１引。
本文的研究是从重庆烟区健康土壤中，从健康
烟草根际分离、筛选和纯化出能抑制青枯雷尔氏菌
的真菌，并对菌株进行分类鉴定。 １材料与方法
１．１供试病原菌
本试验采用青枯雷尔氏菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）作为指示病原菌进行拮抗实验，该 菌种由江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术
重点实验室提供。
１．２试验所用培养基
ＴＴＣ培养基：蛋白胨１０．０ ｇ，葡萄糖１０．０ ｇ，
牛肉膏３．０ ｇ，酵母膏１．５ ｇ，ＴＴＣ（２，３，５一氯化三苯基
四氮唑）Ｏ．０５ ｇ，琼脂１５．０ ｇ，蒸馏水１ ０００．０ ｍＬ，
ｐＨ７．０—７．２。
ＰＤＡ培养基：马铃薯２００．０ ｇ，葡萄糖２０．０ ｇ，
琼脂１５．０ ｇ，蒸馏水ｌ ０００．０ ｍＬ，自然ｐＨ。
孟加拉红培养基：蛋白胨５．０ ｇ，葡萄糖１０．０ ｇ，
Ｎａ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳ０４ ０．５ ｇ，孟加拉红０．０３３ ３ ｇ，
基金项目：国家自然科学基金项目（４ｌＯ７６０９７；４ｌ００６０９７；４１１０６１１３）；教育部科学技术研究重点项目（２１１０６５）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１０３２２）； 江苏省环境材料与环境工程重点实验室开放课题（Ｋ０９００２７；Ｋ０９００２５；Ｋ０９００２６；Ｋ０９００２８）；扬州大学‘嘶世纪’＇人才工程支持 作者简介：周晓见（１９７６年生），男，副教授，博士，研究方向为环境生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｘｉａｏｊｉａｎ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｃ ｉｎ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 收稿日期：２０１０—０６—
２４ 周晓见等：一株拮抗烟草青枯病菌的真菌的筛选与鉴定
氯霉素０．１ ｇ，琼脂１５．０ ｇ，蒸馏水ｌ ０００．０ ｍＬ，ｐＨ７．０。
１．３土壤真菌的分离、纯化与保存
选择重庆黔江未发青枯病的烟田的健康土壤，
拨开表土取３—１５ ｃｍ的根际土壤，每样约１００ ｇ，
采样后带回实验室４℃冰箱保存。土壤样品经过分 级稀释，涂布平板，接种至ＰＤＡ培养基和孟加拉
红培养基，２８℃恒温培养箱中培养。每个稀释度重
复３次。待平板上长出菌落后，挑取培养特征相异的
单个菌落，待纯化完全后，用２５％甘油保存于。８０℃
冰箱中。
１．４拮抗真菌的筛选 １．４．１ 真菌活性产物的粗提取
将分离到的菌株接种于ＰＤＡ培养基上，于２８
℃、１２０ ｒ・ｍｉｎ 发酵５ ｄ，然后在无菌操作台内用８ 层纱布过滤发酵液，取上清液。用乙酸乙酯萃取上
清液，再于旋转蒸发仪上４０℃浓缩，移入小离心
管，氮吹仪吹干，即可得到粗提物。
１．４．２滤纸片法测定粗提物的抑菌活性
采用滤纸片法【１ ５］进行抑菌活性的筛选。将粗提
物以乙酸乙酯配制成浓度为２５ ｍｇ・ｍＬ 的抑菌液，
并准备直径为７ ｉｎｌｎ的圆形灭菌滤纸片若干。用移
液枪吸取ｌ０ 抑菌液于滤纸片上，无菌风干，备
用；用棉签在ＴＴＣ平板上均匀涂布Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ
菌悬液，放置２ ｈ。镊子夹取已风干的滤纸片放在
接种过的平板上，每个平板放４片，呈正方形，放
入培养箱中，３０℃倒置培养。每组试验重复３次， 并设阳性对照（青霉素、链霉素代替粗提物，２５０
ｇ－片 ）和阴性对照（只加乙酸乙酯）。
１．５拮抗真菌的鉴定
１．５．１形态特征观察 参照《真菌鉴定手册》【ｌ ，观察真菌在ＰＤＡ
平板上的菌落形态，并采用压片法制片，在显微镜
下观察菌丝形态、产孢体结构以及孢子的着生方
式，进行分类学鉴定。
１．５．２全细胞脂肪酸分析
全细胞脂肪酸的提取：参照张建丽等【Ｉ ７Ｊ的方法
对活性菌株进行菌落收集、细胞皂化释放脂肪酸、
脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯抽提和洗涤。 气相色谱分析：升温自１７０℃起始，５℃・ｍｉｎ
升至２６０℃，随后４０℃・ｍｉｎ 升至３ｌ０℃，维持９０
Ｓ；进样口温度２５０℃，载气为氢气（０．５ ｍＬ・ｍｉｎ ），
分流进样模式（分流比１００：１），进样量２ ；检
测器温度３００℃，氢气流速３０ ｍＬ・ｍｉｎ～，补充气（氮
气）流速３０ ｍＬ・ｍｉｎ～。在上述条件下平行分析待测
样本和脂肪酸甲酯混合物标样（由美国ＭＩＤＩ公司 提供，其中包括９—２Ｏ碳共１２种直链饱和脂肪酸甲
酯、２一羟基ｌ０碳、３．羟基ｌ０碳、２．羟基１４碳、２． 羟基ｌ６碳脂肪酸甲酯）。运用ＳｈｅｒｌｏｃｋＭＩＳ４．０软
件，将所得各组分的等链长（ＥＣＬ）值、相对含量 与系统谱库中的标准菌株进行数值匹配，计算两者
的相似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｉｎｄｅｘ，ｓｉ）。
１．５．３ ＩＴＳ ｒＤＮＡ序列分析
基因组提取及电泳检测：ＤＮＡ提取参考
ＳＤＳ—ＣＴＡＢ方法 。
ＩＴＳ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增：采用真菌ＩＴＳ ｒＤＮＡ 的 通 用 引 物 ＩＴＳＩ（５＇－ＴＣＣＧＴＡＧＧ
ＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３ ｆ１ 和
ＩＴＳ４（５ 一ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ．３ 进 行 ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系为：１０ ｐｍｏＬ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（基
因组），１ Ｐｒｉｍｅｒ ｕｐ（１ｏ ），ｌ Ｐｒｉｍｅｒ ｄｏｗｎ（１０
ｍ），１ ＩｘＬ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１０ ｒａｉｎ ｅａｃｈ），５ Ｌ １０￣Ｔａｑ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ，０．２５ Ｌ Ｔａｑ（５ Ｕ・｝ＬＬ ），力Ⅱｄｄ Ｈ２ｏ
至５０ 。 ＰＣＲ反应条件：９８℃５ ｍｉｍ变性，３５个扩增
循环（９５℃一３５ Ｓ、５５℃～３５ Ｓ、７２℃￣４０ Ｓ），延伸
８ ｍｉｎ。反应结束后，取反应液以ｌ％琼脂糖凝胶电 泳检测。
测序：检测后的ＰＣＲ产物经纯化后测序。然后，
将所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库序列进行ＢＬＡＳＴ分
析，并选取相似性较高的菌株与拮抗真菌以Ｃｌｕｓｔａｌｘ
软件进行多重序列比对。通过ＭＥＧＡ ５．０软件，以
邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ—Ｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统进化树。 ２结果与分析
２。１ 拮抗真菌的分离与筛选
从５份（不同烟田）的样品中采用稀释法和平
板涂布法，分离菌株，得到不同形态的单菌落，纯
化后得到５９株真菌并编号保存。依次对分离到的
５９株真菌的胞外活性产物进行粗提取，滤纸片法筛
选出了１株拮抗效果较好的真菌，编号为３Ｆ０３。在 粗提物的浓度为２５０ ｇ・片。时，菌株３Ｆ０３的抑菌
圈直径为１０．０ ｍｉｌｌ。同样浓度的链霉素的抑菌圈直
径为３２．３ １ＴＩＩＴＩ，青霉素和阴性对照无抑制作用。由
于实验中使用的是真菌发酵液粗提物，相较于链霉
素活性稍低，但若经纯化则活性必然升高。且经反 复平板拮抗试验，抑菌圈直径无明显差异，表明菌
株３Ｆ０３的活性产物对病原菌有稳定的抑制作用。
采用连续继代培养的方法，未发现菌株发生变异、
退化以及抑菌活性降低的现象。
２．２拮抗真菌的分类鉴定
２．２．１ 形态特征及培养性状
菌株３Ｆ０３在ＰＤＡ培养基上的菌落形态见图１，
菌株在ＰＤＡ培养基上生长迅速，绒毛状，开始为白 色，２～３ ｄ后转为绿色且不断加深，反面为黄色或
紫色；分生孢子的顶囊呈烧瓶状，小梗单层，布满
