α-淀粉酶概述
陈国威 2011-11-13
摘要：α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。本文概述了α-淀粉酶的发现和应用发展史、分离纯化及结构的研究史、催化机制及其研究史、工业化生产和应用现状与发展趋势等。
关键词：α-淀粉酶发现应用分离纯化结构催化机制研究史发展趋势
Overview of α-amylase
Abstract:α-amylases are well distributed throughout microorganisms and other biological. α-amylases are one of the most popular and important form of industrial enzymes，which are used extensively for grain processing，food processing, brewing, fermentation, textile industry and pharmaceutical industry. This article outlines the discovery of α-amylase and application history, purification and structure of history, catalytic mechanism and its research history, industrial production and application status and development trends.
Keywords:α-amylases; discovery; application; purification; structure; catalytic mechanism; research history; development trends.
α- 淀粉酶( α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中, 是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。
1 α-淀粉酶的发现和应用史
1.1 α-淀粉酶的发现
啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖。这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚，直到淀粉的发现。
在19世纪早期，许多科学家都在研究谷物提取物中淀粉的消化机理。Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Kirchhoff（1815年）做了一个巧妙的实验。他将4份的
冷水加入到2份的淀粉中，并边加边搅拌。之后加入20份的沸水使其形成一层厚厚的淀粉糊。在淀粉糊还是余温的时候，加入被粉碎的麸质（或麦芽），然后在40－60°列式温度下水浴。1－2小时后发现，淀粉糊开始缓慢液化。8－10小时后，淀粉糊被转化为一种甜的溶液。之后，他将其通过过滤和蒸发浓缩得到了糖浆，品尝后发现，其和发酵液一样甜。在操作的过程中，他注明了实验过程中仅添加了非常少的麸质，并且得到的糖浆与淀粉的量成正比。此外，如果在加入麸质前加入几滴高浓度的硫磺酸，最终就没有糖生成。从这个实验中他得到结论1）麸质是一种能够使温水中的淀粉粉末转化为糖的物质。2）作为种子发芽的结果，相比种子内的物质而言，麸质能过将更多的淀粉转化为糖。至此,Kirchhoff奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。
另一个研究进展是由Payen和Persoz（1833年）发现。他们发现在发酵液的酒精析出物中含有一种对热不稳定的物质，它能使淀粉转化为糖。他们将其称为“diastase”，它就是现代所说的淀粉酶。
1886年，Lintner发现了两种淀粉酶-淀粉液化酶和淀粉糖化酶。1924年，Kuhn 将淀粉水解酶归为两类。将发酵过程中能够将淀粉水解为β－淀粉酶，其能够将淀粉水解为β型麦芽糖。将能够液化和糊化淀粉的酶称为α－淀粉酶，其作用于淀粉的产物表现为低旋光性，这一点为α型麦芽糖和相关糖的特性[1]。
1.2 α-淀粉酶的应用史及现状
早在1833年payen从麦芽抽提液中用酒精沉淀出白色沉淀,可以使200倍的淀粉液化, 取名为“diastase”，并出售用于棉布的退浆。1894 年tadamin用麸皮培养米曲霉制造淀粉酶作为消化剂, 建立了高峰制药厂―现miles公司的前身。1913年法国Bioden与Effront 发明用枯草杆菌生产α－淀粉酶, 以其耐热性取代了麦芽淀粉酶用于棉布的退浆, 创建了rapedase工厂(现并入了gist brocades 公司)。从此酶制剂工业揭开序幕。
第二次世界大战后, 随着抗生素工业的发展,微生物的培养技术、发酵工艺和发酵罐的革新, 酶制剂工业有了飞跃的发展, 进人了工业化大生产的阶段。1949年日本采用深层通风培养法生产α－淀粉酶。1959年, 日本采用淀粉酶和糖化酶进行淀粉的液化和糖化, 确定了酶法制造葡萄糖浆的工艺, 革除了沿用100年酸水解工业, 使淀粉出糖率由80% 提高到100% 。1973耐热性α－淀粉酶投人生产。从此淀粉酶的生产又进入了一个新阶段[2]。
据统计,α－淀粉酶和糖化酶是酶制剂的主要品种。如美国1975年酶制剂总产值
为5151万美元,淀粉酶类为1550万美元,1980年总产值是6681万美元,其中淀粉酶类约占20 %。在日本,1976年酶制剂总销售额为2999百万日元,α－淀粉酶为1530百万日元,占50%。
将淀粉用α-淀粉酶液化、糖化酶糖化进而提取葡萄糖的工艺奠定了果糖浆和淀粉糖浆生产的基础,因而改变了糖品种的结构, 开辟了淀粉加工的新途径。1980年, 美国果葡萄浆用量已达40 亿磅, 折合成湿淀粉为280万吨, 若加上未统计的数字, 估计实际可达500万吨。仅生产可口可乐每年则需用糖浆100万吨[3]。
目前, 除开展大量常规诱变育种工作外, 国外已初步搞清了α一淀粉酶的调控基因, 探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。将枯草芽抱杆菌重组体的基因引入生产菌株阴, 使α－淀粉酶产量提高7 －10倍, 并已应用于食品和制酒工业, 给选育高产α－淀粉酶菌株开创了新的途径[4]。
α-淀粉酶在动物、植物、微生物中均能产生，但大量生产还是主要靠微生物发酵。有关的属有：Bacillus ，Bacteroides，Clostridium，Thermomonospora，Acinetobacter，Thermophile，Pseudomonas，Streptomyces，Thermoactinomyces，Aspergillus，Mucor，Neurospora，Penicillium等。世界许多国家都以枯草杆菌（B.subtilis）生产的细菌淀粉酶和米曲霉（Aspergillus oryzae）生产的真菌淀粉酶为主要产品[5]。
下面仅以真菌α-淀粉酶的生产应用现状为例说明。目前国际上仅有诺维信、丹尼斯克和帝斯曼等少数几家大型酶制剂公司拥有真菌α-淀粉酶的先进的生产技术与产品，且一直处于国际领先水平，其发酵水平一般在2 000 U/g 以上( 固态发酵) 。虽然，我国早在1965 年就已在无锡建成我国第一个酶制剂厂—无锡酶制剂厂，并相继在国内实现了α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶及高温α-淀粉酶等生物酶制剂的生产和利用。但是，我国在很长一段时间内对真菌α-淀粉酶的生产却处于空白状态，或有少量的自主产品面市，仍然远不能满足市场需求，使得我国必须通过大量进口才得以满足国内食品或发酵等工业日益增长的使用需求。随着真菌α-淀粉酶需求量的日益增加及其相对较昂贵的价格，使得近年来越来越多的国内研究者开始关注真菌α-淀粉酶研究与开发工作。国内报道的发酵水平大多数为200-600 U/g。至2004年，河南省科学院生物研究所与郑州海韦力食品有限公司合作，以米曲霉为出发菌株，通过粒子束、60Co、r-射线、微波、紫外线、亚硝酸和硫酸二乙酯等6 种物理和化学诱变剂交替作用方法选育出了一株产酶水平较高菌株，其平均生产水平为1283 U/g，“整体技术达到了国内同类研究的领先水平”。时至今日，国内已有多家酶制剂公司拥有真菌α-淀粉酶产品，在一定程度上缓解了国内对该酶种需求的压力，然而因国内企业
的生产水平和产品多样性距国际领先水平仍有一定差距，所以国内市场供应的真菌α-淀粉酶大部分来自国外企业，使得在该酶种的市场占有中，中国企业一直处于劣势[6]。
2 酶的催化机制、空间结构及研究史
2.1 酶的催化机制
α-淀粉酶在结构上的相似性使人们相信他们具有相似的催化机制。McCarter、Davies均提出α-淀粉酶的催化过程包括三步，共发生2次置换反应。第一步，底物某个糖残基要先结合在酶活性部位的-1亚结合位点，该糖基氧原子被充当质子供体的酸性氨基酸（如GLU）所质子化；第二步，-1亚结合位点的另一个亲核氨基酸（如ASP）对糖残基的C1碳原子进行亲核攻击，与底物形成共价中间产物，同时断裂C1-OR键，置换出底物的糖基配基部分；第三步，糖基配基离去之后，水分子被激活（这可能正是被刚去质子化的GLU所激活），这个水分子再将ASP的亲核氧与糖残基的C1之间的共价键C1-ASP水解掉，置换出酶分子的ASP残基，水解反应完成。在第二次置换反应中，如果进攻残基不是水分子，而是一个带有游离羟基的糖（寡糖）ROH，那么酶分子的ASP残基被置换出去后，就发生了糖基转移反应而非水解反应[7]。
2.2 酶催化机制的研究史
α-淀粉酶的结构首先由MATSUURA (MATSUURA et al., 1979; 1984)发现。（KUSUNOKI et al., 1990）单斜晶体被提炼出。斜方晶系的天然形态(BOEL et al., 1990)和阿卡波糖混合形态(BRZOZOWSKI et al., 1997)被提炼出来。在单斜晶态分析中，在酶的活性部位发现了与麦芽糖的结合键。于是根据分子模型的研究，底物和酶键结合的假设被提出来。之后，根据阿卡波糖混合形态结构，证实了确实存在底物和酶键结合模型。抑制剂阿卡波糖也被用于其他和淀粉酶结构分析中，用于模拟想象底物和酶键结合的模型(QIAN et al., 1994; FUJIMOTO et al.; 1998, KADZIOLA et al.; 1998, BRAYER et al., 2000) 。它们的结构表明酶和底物可能有相互作用。催化残基和底物之间的氢键是Asp206-O1(-1),O6(-1), Glu230-O1(-1), and Asp297-O2,O3(-1)[8]。
2.3 酶空间结构及研究史
α-淀粉酶的三级空间结构是通过X衍射在3Ao溶液中应用多对同晶型置换法得
到（Mat- suur,Y;Kusunoki,M;Date,W;Date,W;Harada,S;Bando,S; el at 1979 J.Biochem. 86,1773-1 783; 1980J.Biochem .87,1555-1558)。其一级结构氨基酸排列顺序于1982年完成（Toda，H；Kondo，K et al 1982 Proc.Jpn.Acad.58B,208-212）。分子结构模型的建立是通过应用骨架模型配合电子密度分布的结果完成的，而电子密度分布是通过分子
置换技术而总结得到的（Bricogue，G 1976 Acta Cryst，A32,832-847）。
以下是关于α-淀粉酶（TTA）简要的空间结构的描述。α-淀粉酶是由478个氨基酸残基组成，它们折叠在三级结构的两大区域。其中，最初的380个残基组成了区域A，剩余的组成了区域B。区域A包括一个（βα）8的超二级结构。在（βα）8的超二级结构中，α螺旋和β折叠的空间分布与磷酸丙糖异构酶、丙酮酸激酶或醛缩酶类似。区域B是由8条反向平行的β-片层组成。这两个区域由一条单链多肽连接着。该多肽链有广阔的结合部位，该部位主要是由疏水残基组成。一个较大的裂缝位于区域A平行的β-barrel的羧基末端。
四个二硫键在电子密度分布图中被标出，它们分别连接着残基30-38,150-164,- 240-283和439-474。一个由共价键相连的碳水化合物基团在电子密度图中被发现，其是作为ASN197的大支链。在裂缝周围隐匿着一个电子密度孤峰，这是由钙离子产生的。钙离子被周围的残基连接，起到稳定裂缝结构的作用[9]。
3. α-淀粉酶分离纯化及活性测定方法
3.1 α-淀粉酶的分离和纯化
高纯度α－淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化α－淀粉酶的方法很多，一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度α－淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。
盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质分离纯化的主要方法。。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性α一淀粉酶进行纯化，得到电泳纯级的超耐热耐酸α一淀粉酶，纯化倍数为11．7，活力回收率为29.8%[10]。但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。
反胶团萃取具有选择性高、正萃与反萃可同时进行、分离与浓缩同步进行、操作简单和易于放大等优点，并能有效防止生物分子变性失活[11]。以CTAB /正丁醇/异辛烷构成反胶团系统, 通过反胶团萃取方式纯化精制α-淀粉酶。最佳反应条件为: 萃取温度40 ℃, 水相组成为NaCl 0.03 mol/L, pH 12.0, 有机相：无机相= 1：2, 振荡时间10min; 反萃取最佳条件为:温度60℃，水相组成为KCl 3 mol/L, pH 4.0,有机相：无机相= 2：1, 反萃取振荡时间10 min。在上述条件下, 经过一个萃取与反萃取循环后,淀粉酶的萃取率最高可达90. 78%[12]。
双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统PEG／磷酸盐分离纯化α－淀粉酶，增加PEG浓度有助于酶富集上相。同样用PEG／磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温α一淀粉酶，分配系数及回收率分别为4.8和87％[13]。采用PEG(聚乙二醇)／硫酸铵双水相体系，进行分离纯化α－淀粉酶，结果表明，在室温下由PEG和硫酸铵所组成的双水相体系，对α－淀粉酶的回收率可达94.84％，分配系数可达17.10[14]。双水相技术有着溶液粘度高、分相时间长，易造成界面乳化等缺点，给实际操作带来很多问题。
为了获得高纯度的α一淀粉酶,开始人们利用软基质的离子交换色谱和亲和色谱分离纯化了α-淀粉酶的粗酶提取液。但是,软基质色谱介质的机械强度小,受压易变形,分析速度慢,分离效率低,柱寿命短,固定相对PH、离子强度和压力非常敏感,反复使用时配体碎片容易脱落。由于以上缺点,软基质色谱有逐渐被硬基质色谱取代的趋势。在硬基质色谱应用方面,李华儒等首次合成一种对α一淀粉酶具有特异亲和能力的色谱介质,并成功地分离纯化了工业粗酶, 获得了高纯度产品, 其活性回收率>88%,Kato 等也用高效疏水色谱纯化了α-淀粉酶粗品,回收率为90%。之后其采用高效液相离子交换色谱纯化α一淀粉酶很好地分离了α一淀粉酶粗品, 其活性回收率高达96%,比
活性达388μ/mg蛋白质。此法的研究成功为大规模制备高纯度α一淀粉酶提供了一个新工艺路线[15]。
3.2 α-淀粉酶活力测定方法的研究
测定酶活力前，先了解酶的作用、动力学性质等，确定一种相应的方法进行酶的分离纯化，然后选择合适的底物、底物浓度、反应pH和反应温度等。测定α－淀粉酶活力的方法已不少于200种，其共同之处是，被测样品与某种多糖底物溶液保温反应后测之，很难标准化。下面给出了几种α-淀粉酶活性测定的方法。
一、碘-淀粉比色法
在所有α-淀粉酶测定的方法中，碘-淀粉比色法是使用的最多的，它具有操作简便，试剂便宜，比色精确、敏感的优点，因此，成为受推荐的淀粉酶活力测定方法。为保证碘一淀粉比色法测定α－淀粉酶活力的准确性，对试验条件进行优化，使其测定结果与酶法测定结果有可比性。染色淀粉法测定α－淀粉酶活力的优点是，重复性好，特异性强，显色稳定，操作简便，成本低廉。采用具有双反应基团的国产活性染料，即M一8B与马铃薯淀粉经共价结合制成的红色染色淀粉片，成功取代国外淀粉片剂检测工业用α－淀粉酶活力[16]。
二、3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法法
此法主要是基于还原性糖含量测定的3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法法，主要是在氢氧化钠和丙三醇存在下还原糖能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原为按氨基化合物，其在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色，在540nm处有最大吸收，其吸光度和还原性糖含量有线性关系。通过比较单位时间里水解样品生成单位质量还原性糖的酶量（活力单位）来比较酶活的大小[17]。
三、以β-极限糊精作为底物测定α－淀粉酶的活性
其原理为α-淀粉酶降解β-极限糊精底物溶液，在酶促反应进程中，分别在不同时间将反应混合物等分别加入到碘溶液中。随着反应时间的延长，反应混合物与碘液的显色强度降低，以测定酶活。现该方法已经作为测定谷物中α-淀粉酶的国标方法[18]，也可以测定植物粗提取液中α一淀粉酶的活力[19]。
由于一般在测定样品中α一淀粉酶与其他酶（如β淀粉酶）往往同时存在，而用淀粉一I2显色法测定的结果是这些酶的综合反应，因此测定的α-淀粉酶的活性并不准确。在此基础上研究人员又开发了通过特异性物质作为底物，测定α-淀粉酶活性的方法。
四、以对硝基苯麦芽庚糖苷（BPNPG7）作为底物测定α-淀粉酶活性
对硝基苯麦芽庚糖苷（BPNPG7），它在麦芽庚糖苷的还原性尾部有一个硝基苯基团，在低聚物的非还原性末端含有一个4,6-二氧基团。该低聚物能够特异性地作为内作用的α淀粉酶的底物，而不能作为外作用的酶的底物，如淀粉葡萄糖酶，α-葡萄糖苷酶或β-淀粉酶的底物。经过α-淀粉酶的水解生成对硝基苯酚和麦芽庚糖苷，而对硝基苯酚在410nm左右有最大吸光度，通过连续测定410nm处每分钟吸光度变化（△A/min）可反映对硝基苯酚的生产量，从而计算α-淀粉酶的活性。类似这些方法主要是用人工合成接上一个生色团如对硝基酚（PNP）或2-氯-4-硝基酚（CNP）的麦芽寡糖苷作为α-淀粉酶的特异性底物[20][21]。这种方法由于特异性好、准确、检测下限低的特点，成为IFCC批准的α-淀粉酶活性测定推荐方法。但是由于底物价格较高，工业上应用并不多，现主要用于血清和尿液淀粉酶( AMY )水平测定，从而可以急性胰腺炎诊断中去[20]。
4 淀粉酶的工业应用
4.1面包焙烤工业，作为保鲜剂
酶应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史，最近几十年，麦芽α－淀粉酶和微生物α－淀粉酶被广泛用于焙烤工业，这些酶用于面包工业，使
这些产品体积更大、颜色更好、颗粒更柔软。真菌α-淀粉酶可水解面粉中的受损淀粉生成小分子糊精，通过酵母的进一步发酵产生醇类物质和二氧化碳，从而使面包体积增大[22]。在此过程中产生的还原糖在面包烘焙过程中可参与美拉德反应，有助于改善面包的外表色泽。因此，真菌α-淀粉酶的添加，不仅可以加快生面团的发酵速率、改善面包的结构和体积，同时其产生的糖类物质对面包的口感、色泽及品质等也都具有明显的促进作用[23]。
4.2 淀粉的液化和糖化作用
α－淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆(HFCS)。由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α－淀粉酶。α－淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟，而且有很多相关报道。目前，欧美各国大多采用真菌α-淀粉酶作为糖化剂生产高麦芽糖浆，得到的麦芽糖浆其组成中麦芽糖占40%-60%，麦芽三糖约10%-20%，其他为葡萄糖、低聚糖和糊精等。工业生产中往往与β-淀粉酶和普鲁兰酶等脱枝酶配合使用，用以生产超高麦芽糖浆，其麦芽糖含量超过70%，甚至更高[24]。
4.3淀粉脱浆
现代纤维制造工艺在编织过程中会在纱线中产生大量的细菌，为防止这些纱线断裂，往往会在纱线的表面加一层可去除的保护层。这些表面层的材料有很多种，淀粉是非常好的一个选择。因为它便宜、容易获取，并且可以很容易去除。淀粉脱浆可以利用α－淀粉酶，它能有选择性的去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机的使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉。早期是用麦芽产生的一种内生酶来退浆, 近期则使用真菌或细菌淀粉酶。细菌淀粉酶尤其适用, 因为它们能够耐高温, 在碱性的环境里有一定的稳定性, 具有一个中性的最适pH 值( pH5-7.5) 。酶的催化效率高, 有利于提高生产效率。如用碱分解淀粉退浆需要10 h-12 h, 而用α- 淀粉酶只要20 min-30 min 即可完成退浆过程。淀粉酶退浆的另一原因是比其它退浆剂(如酸或氧化剂)更利于环保。在退浆浴中添加钙盐, 可提高淀粉酶的稳定性, 从而可用较高的温度或较低的酶剂量来达到退浆的目的[25]。
4.4 造纸中改变粘度
淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉。不同的纸张施胶，对淀粉分子量、粘度有不同的要求。粘度太高，不利于淀粉很好地均布铺展。通过水解成为短链分子，可以降低淀粉的粘度。一种方法是稀酸水解，二是用α-淀粉酶水解[26]。
相比而言，酶的催化速率高，应用少量即可达到效果；同时其为生物活性物质，不会产生污染。
4.5 除垢剂中的使用
酶是现代高效除垢剂的成分之一。酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。早期的自动洗碗机的除垢剂非常粗糙，容易在进食时对人体造成伤害，而且对陶瓷、木质餐具也会造成损害。α－淀粉酶从1975年就被应用于洗衣粉，现在90%的液体除垢剂都含有α－淀粉酶，而且自动洗碗机的除垢剂对α－淀粉酶的需求也在不断增长。α－淀粉酶对Ca2+过于敏感，在低Ca2+的环境下稳定性很差, 这限制了α-淀粉酶在除垢剂中的应用，并且大多数野生型菌株所产生的α－淀粉酶对作为除垢剂原料之一的氧化剂也过于敏感。在家用除垢剂中，这个局限可以通过增加一些工艺步骤得到改善。现在两家主要除垢剂酶的生产厂家诺维信和杰能科已经利用蛋白质工艺改善淀粉酶的漂白稳定性。他们用亮氨酸替代地衣芽孢杆菌α－淀粉酶蛋白第197 位上的蛋氨酸，导致酶对氧化剂成分的抵抗能力大大增强，提高了其氧化稳定性，使酶在储存过程中的稳定性更好。并已经在市场上推出了这些新产品[27][28][29]。
4.6 医药行业中的应用
在医药行业，为了弥补乳酸脱氢酶(LDH)、α-淀粉酶(α-Amy)、癌胚抗原(CEA)各单项检查在卵巢血清学诊断中灵敏度较低的不足，黄琛等对LDH、α-Amy、CEA 三者进行了联合检测。经临床试验证实：三者联合检测，以其中任意两项为联检阳性，均可提高卵巢癌的阳性检出率，并有助于卵巢癌与卵巢良性肿瘤的鉴别诊断。分析血链球菌群中的细菌与α-唾液淀粉酶的结合能力，可有效鉴定不同血链球菌群中各菌株。研究唾液α一淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系，为龋病的病因学研究和预防提供了理论依据[30][ 13]。麦角隐亭是具有药理活性的生物碱，能用于治疗高血压和处理外周血管组织障碍。用一淀粉酶对淀粉的水解液作为碳源，发酵培养麦角菌ATCC- 20019，麦角隐亭产量较高。黑曲霉α一淀粉酶因具有耐酸性，适用于制造助消化的药物，开发适合于胃酸性环境(pH2．0左右)的耐酸性α一淀粉酶，用于制备消化助剂，将会使医疗效果更为有效[13][31]。
5 启发
从α-淀粉酶的发现和研究过程中，可以看到科学家探索科学本质而孜孜不倦的精神，同时也知道了一般酶发展的过程：先是通过通过各种方法知道其催化机理、结构和空间构象，然后就是如何获得高活性的酶产品以及将它应用到工业中去。在结构
和空间构象上，现使用的方法为用X衍射、光谱学方法（如紫外差光谱、荧光光谱、旋光色散谱及圆二色谱）、核磁共振、扫描隧道显微技术等等，从而建立空间结构构象模型。对于催化机理上，主要同位素平衡交换动力学方法、分子印迹法、量子与经典动力学配合空间结构等方法进行研究。而对于酶的工业化应用，其首要的任务就是找到高产菌株。现得到高产菌株的方法有诱变育种、遗传物质转导和转化、基因工程的方法。
通过对α-淀粉酶的学习可以看到，现如今α-淀粉酶已经被研究的很透彻了，其空间结构、蛋白质序列、催化机制等等都应经被发现。而对于工业化应用，由于对于不同的环境对酶的要求不同，现如今普通的α-淀粉酶适用的范围比较窄，主要应用的是耐高低温、耐酸碱的α-淀粉酶。但是由于技术水平的限制，我国的α-淀粉酶的活性相比较国外较低，因此必须加强该菌种选育的水平，获得产酶活性更高的菌株。
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实验六十淀粉酶产生菌株的筛选 实验项目性质：设计性 所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时 一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。 二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养） 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。 初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三、实验用品 1．器材 （1）小铁铲和无菌纸或袋。
产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
α-淀粉酶综述 佚名2013-10-06 摘要：α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。本文概述了α-淀粉酶的发现和应用发展史、分离纯化及结构的研究史、催化机制及其研究史、工业化生产和应用现状与发展趋势等。 关键词：α-淀粉酶发现应用分离纯化结构催化机制研究史发展趋势 α- 淀粉酶( α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中, 是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。 1 α-淀粉酶的发现和应用史 1.1 α-淀粉酶的发现 啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖。这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚，直到淀粉的发现。 在19世纪早期，许多科学家都在研究谷物提取物中淀粉的消化机理。Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Kirchhoff（1815年）做了一个巧妙的实验。他将4份的冷水加入到2份的淀粉中，并边加边搅拌。之后加入20份的沸水使其形成一层厚厚的淀粉糊。在淀粉糊还是余温的时候，加入被粉碎的麸质（或麦芽），然后在40－60°列式温度下水浴。1－2小时后发现，淀粉糊开始缓慢液化。8－10小时后，淀粉糊被转化为一种甜的溶液。之后，他将其通过过滤和蒸发浓缩得到了糖浆，品尝后发现，其和发酵液一样甜。在操作的过程中，他注明了实验过程中仅添加了非常少的麸质，并且得到的糖浆与淀粉的量成正比。此外，如果在加入麸质前加入几滴高浓度的硫磺酸，最终就没有糖生成。从这个实验中他得到结论1）麸质是一种能够使温水中的淀粉粉末转化为糖的物质。2）作为种子发芽的结果，相比种子内的物质而言，麸质能过将更多的淀粉转化为糖。至此,Kirchhoff奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。
实验一淀粉酶产生菌的筛选 一、实验要求： 1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤； 2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量； 3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株； 4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养 条件和培养时间。 二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌 三、实验材料： 1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等, 2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ; 3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。 四、实验步骤： 1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过 菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、培养基的配置，(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀 粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。 3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土 壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于27℃培养1-2天，等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。将水解圈直径与菌落直径之比较大菌株,即产酶能力较强的菌株的进行编号。 4、纯化; 将保存的菌株用接种环沾取少量培养物至平板上, 并进行2-3次划线分离, 挑取单菌落至平板上, 培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。将纯化后产酶能力较强菌株保存至斜面培养基中培养.
淀粉酶活性研究 宁加彬1，王文移2 （青岛科技大学） 摘要：淀粉酶主要用作果汁加工中的淀粉分解和提高过滤速度以及蔬菜加工、糖浆制造、葡萄糖等加工制造。淀粉酶活性的研究在淀粉催化分解工程中占有 重要地位。文中综述了淀粉酶活性及其热稳定性，电场对淀粉酶活性的影响。 pH值、温度、淀粉浓度和钙的添加量以及瞬时高压处理对α-淀粉酶的热稳定 性和活性的影响 关键词：淀粉酶酶活性热稳定性 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的 淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。对淀粉酶的研究，有利于我们 更好的理解其催化机理。淀粉是植物种子的主要贮存物质，淀粉酶的主要作用是催化淀粉的水解，淀粉被水解成简单有机化合物并提供细胞生长所需的能量。 1、淀粉酶的研究概况 淀粉酶研究经历了一个较长的奠定和发展时期。在中国知网依据主题—— 淀粉酶进行检索，结果显示在1979-2013年共涉及15840篇文献。其中，2005 年以前的总计5256篇，2005-2010年5256篇，也就是说2005年之前的研究篇 数仅占目前土壤酶研究总数的1／3。而从2005年开始我国对土壤酶活性研究 的论文以超百篇的速度增加，且增加趋势较为明显，仅2012年就有724篇。 针对我国淀粉酶活性研究的快速发展，该文就我国淀粉酶研究种类及研究 方法的资料进行归纳总结，旨在进一步扩宽我国淀粉酶活性研究的范围，为今 后淀粉酶的研究提供一些新的思路，同时也可促进我国淀粉酶研究方法的发展。 2、淀粉酶的分类 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称。按水解淀粉方式不同，把淀粉酶分 为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶四类。目前淀粉酶已广泛 地应用于食品、发酵、畜牧业生产、谷物加工、纺织、造纸、轻化工业、医药 和临床分析等领域 (Ashok et al．，2000；Lili，2000；柳辉等，2007；张剑等，2009)。其中，中温淀粉酶主要应用于饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精以及抗生素等行业，也可以用于高质量的丝绸人造棉、化学纤维的退浆。淀粉 酶广泛存在于微生物、植物和动物体中。现已有大量有关土壤微生物产淀粉酶 及酶学性质的文献报道(卢涛等，2002，四川大学学报(自然科学版)，39(6)：1131—1133；张应玖等。2002)。
实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定 指导老师：辛树权 生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆 同组人：xx xxx 摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园 2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 3、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、 0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
小麦中的淀粉酶及其研究进展 摘要：从各个方面来研究了小麦中淀粉酶的功能作用以及它的作用机理，通过研究可知，小麦中的а-淀粉酶和β-淀粉酶对食品的品质的影响起着重要的作用。并通过国内外的研究进展来进一步说明小麦中淀粉酶的研究是很有必要的。最后提到了淀粉酶的添加来弥补某些淀粉酶不足以满足食品加工的小麦。本文主要从小麦中的淀粉酶研究意义，国内外小麦中的淀粉酶的研究近况以及未来的发展方向进行了较为全面的综述。 关键词：小麦；淀粉酶；研究进展 在活细胞中进行着大量的化学反应的特点是速度很快，且能有秩序的进行，从而使得细胞同时能进行各种降解代谢及合成代谢，以满足生命活动的需要。生物细胞之所以能够在常温常压下以极高的速度和很大的专一性进行化学反应是由于其中存在一种称为“酶”的生物催化剂。而在小麦的生长，储存，加工等环节中，其中存在的酶就具有非常重要的作用，小麦中的酶会影响着小麦的储存，加工等品质。小麦粉中的淀粉酶主要有3类，即а-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。其中与面包烘焙有关的主要是а-淀粉酶和β-淀粉酶，而且а-淀粉酶与小麦的储藏品质也有着极其密切的关系。所以对小麦中的淀粉酶进行研究是十分有必要的。 1.研究小麦中的淀粉酶的意义 小麦中的淀粉酶主要有а-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶这三类。面粉有很多用途，可以制成各种不同的成品食品。而面粉大多数都是小麦面粉，可见要研究面粉就的研究小麦，并且小麦中的а-淀粉酶，β-淀粉酶与面包烘焙有关，而且а-淀粉酶与小麦的储藏品质也有着极其密切的关系。所以研究小麦中的淀粉酶是非常有意义的。通过研究可以更好地把握不同小麦品种的淀粉酶的性质，来改善淀粉酶，从而来改进食品品质。 1.1小麦中的а-淀粉酶对面包品质的影响 大量的研究已证实，由于淀粉酶在发酵过程中对淀粉分子进行了有益的修饰，进而改善了面包的质地、体积、颜色、货架寿命等方面的性质,具体影响如下[1,2]： 1.1.1 а-淀粉酶对面包品质的影响 ○1а-淀粉酶能增大面包体积。а-淀粉酶是通过适当阻止面筋的形成来使面包体积增加的，
产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选 一、实验目的： 1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2.巩固以前所学的微生物学实验技术。 3.学习淀粉酶活性的测定方法。 二、实验原理： 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其 是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初 步筛选、分离纯化和性能测定。 a)采样：即采集含菌种的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多， 然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土 壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分 解菌较多。 b)富集培养： 富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于 待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从 而便于我们从其中分离到这类微生物。 c)初步筛选： i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊 成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d)分离纯化： 通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中 的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线 分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e)性能测定： 分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须 要进行性能测定后才能决定取舍。 三、实验材料： 1.培养基配制： a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%； b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏 0.5%、pH7.0； c)分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、 NaCl 0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、 Na2HPO40.2%、pH7.0。 2.主要试剂和溶液的配制： a)2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 b)0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸
微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体
高产淀粉酶菌株的筛选 一：前言 1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。 3. 学会筛选高产淀粉酶菌株。 关键词：产淀粉酶、芽孢杆菌、酶活力、筛选 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。 a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。 b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。 c) 初步筛选： i. 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii. 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。 二、实验材料：接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱载玻片可见分光光度计显微镜紫外操作台 实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液 培养基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉 三：实验步骤 1培养基的制备及其仪器的灭菌
β-淀粉酶 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称,按水解淀粉方式不同,淀粉酶可分为α- 淀粉酶、β-淀粉酶、脱枝酶及葡萄糖淀粉酶4 大类.按照结构的差异,又可将其分为α、β型两大类.β-淀粉酶是一种外切酶,其作用于淀粉时,从α- 1,4糖苷键的非还原性末端顺次切下一个麦芽糖单位,产物为麦芽糖和大分子的β-界限糊精.因为该酶作用于底物时,发生沃尔登转化（Waldeninversion）,使产物由α型变为β型麦芽糖,释放的β-麦芽糖在C1位上有一个自由H基,为β型,故名β-淀粉酶.近年来,β-淀粉酶的研究引起了酶制剂行业的广泛关注.本文对β-淀粉酶的来源、性质、分离纯化及应用等方面的研究进展进行了综述,最后对β-淀粉酶在酶制剂行业的研究及应用进行了展望。 一、来源 β—淀粉酶广泛存在于大麦、小麦甘薯、大豆等高等植物中，目前商品β—淀粉酶绝大部份均是从植物中提取的，芽孢杆菌β—淀粉酶生产量极低。很多微生物通过发酵能产生β-淀粉酶,如蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、假单胞菌等.但通过微生物发酵生产的β-淀粉酶耐热性差,且成本较高,要达到工业化生产还需一定距离.植物中β-淀粉酶酶活力高、耐热性好、作用 pH 范围较广,适合于高麦芽糖浆的生产要求.植物体中的β-淀粉酶主要存在于质体内,而在其他亚细胞区域内β-淀粉酶的分布都较少.甘薯
在自然栽培的条件下,只有块根中存在β-淀粉酶,其余的部位几乎检测不出β-淀粉酶的存在,但是只有存在于质体外的β-淀粉酶才具备活性.Zieglar认为β-淀粉酶在液泡中也有所分布,并且在多糖代谢中起到作用.单子叶植物中β-淀粉酶存在于胚乳细胞中,在其他器官中很少有分布,当种子萌发时,β-淀粉酶与其他相关酶一起协同完成淀粉的降解.而在高等植物中,存有两种不同酶活力的β-淀粉酶,它们分别存在于植物的不同组织器官中：一种是以高活力存在的β-淀粉酶,主要存在于禾本科植物的胚乳中,当这类植物的种子开始发芽时,β-淀粉酶的酶活力会显著升高；而另一种则是以相对酶活性较低的形式,普遍存在于植物的各个组织器官中的β-淀粉酶.这两种形式的β-淀粉酶虽然在抗原性上较相似,但在其他方面存在着较大的区别,而且它们的生成方式也不尽相同,推测得出,前一种β-淀粉酶可能是由后一种β-淀粉酶的基因转变而来的。β-淀粉酶在高等植物体内是以游离态和结合态两种形式存在的,用水提的方法可以将植物中游离态的β-淀粉酶提取出来,而以结合态形式存在的β-淀粉酶的提取还需要添加还原剂或蛋白水解酶,这种结合态的β-淀粉酶由于与种子中的其他蛋白结合会成为复杂的不溶物质.这两种形态的β-淀粉酶在大麦种子中占所有蛋白含量的1%左右。 二、β—淀粉酶性质 β—淀粉酶能将直链淀粉分解成麦芽糖的淀粉酶。可耐酸。将麦芽汁调节pH值为3.6，在0℃下可使α-淀粉酶失去活力，而余下β-淀粉酶。β-淀粉酶的唯一产物是麦芽糖，不是葡萄糖。β-淀粉酶水
南昌大学实验报告 淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。 淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下
降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1、培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾,氯化钠,硫酸镁,硫酸亚铁,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到～。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 2、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、L乙酸、%生理盐水。 3、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。 四、实验步骤：
The effects of protein content to starch’s enzymolysis character ZhongDong Liu Henan University of Technology ZhengZhou, China liuzhongdong@https://www.doczj.com/doc/b27876910.html, LiZheng Bi Henan University of Technology ZhengZhou, China bilizheng123@https://www.doczj.com/doc/b27876910.html, Guojin Yan Henan University of Technology ZhengZhou, China yanguojin@https://www.doczj.com/doc/b27876910.html, Shijie Yang Henan University of Technology ZhengZhou, China lzd@https://www.doczj.com/doc/b27876910.html, Chao Yang Henan University of Technology ZhengZhou, China drlzd@https://www.doczj.com/doc/b27876910.html, Liu Boxiang Illinois Wesleyan University IL, USA jollier.liu@https://www.doczj.com/doc/b27876910.html, Abstract：The research studied the best condition for protein purification in the wheat starch , for preparation of the wheat starch and the influence of the starch grain protein in the structure and properties when the starch is hydrolyzed . Firstly, we ensured the optimum condition for the Wheat protein purification by orthogonal test, at the same time , we obtained different protein content of wheat starch ,the next step is to measure the protein content by the Kjedahl determination. Contrast between the SDS and protease in nitrogen function before setting-out the Enzymatic hydrolysis degree and the crystallinity in the starch samples of different nitrogen.It can be concluded from those experiments that compared with the SDS, the Protease is more effectively to remove the starch grain protein, which is useful to hydrolyze starch particles. Keywords：The wheat starch ; Protein purification; The Enzymatic hydrolysis degree 淀粉中蛋白含量对淀粉酶解性质的影响 刘钟栋1，毕礼政 1 ,阎国进1,杨士杰1，杨超1，Liu Boxiang2 1.河南工业大学，郑州，中国，450052 2. Illinois Wesleyan University ,1312 Park Street Bloomington, IL, USA 【摘要】本文主要对小麦粉洗淀粉过程中影响淀粉蛋白含量的因素及淀粉颗粒蛋白对淀粉酶解性质的影响进行了研究。首先对洗淀粉过程中影响其蛋白含量的条件进行了单因素试验，再用SDS溶液和蛋白酶除去其中的蛋白质成分，得到不同蛋白含量的小麦淀粉，以凯氏定氮法测定其中蛋白质含量。然后对除去蛋白的小麦淀粉样品进行定氮，对比两种除蛋白方法之间的优劣，然后以不同蛋白质含量的淀粉样品同时做酶解度测定试验，讨论蛋白质对淀粉在酶解过程中性质和结构的影响。试验表明，蛋白酶比较有效地除去淀粉颗粒蛋白，而颗粒蛋白确实有助于淀粉的水解。 【关键词】小麦淀粉；蛋白纯化；酶解 1 引言 淀粉中含有少量的蛋白质，但是这少量的蛋白质在淀 粉的水解和参与其他化学反应中起到重大作用，然而关于 这方面的研究却至今没有准确的答案，从整个研究淀粉及2010 First International Conference on Cellular, Molecular Biology, Biophysics and Bioengineering (CMBB) 978-1-4244-9158-2/10/$26.00 ?2010 IEEE CMBB2010
发酵工程实验报告产淀粉酶菌株的筛选 姓名：×× 班级：生物技术 学号：×× 指导老师：×××
产淀粉酶菌株的筛选 ×× （长春师范大学生命科学学院生物技术） 【摘要】为筛选产淀粉酶的高产菌株, 利用淀粉水解圈作为筛选模型, 从学校附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌。对其酶活力进行测定, 最终得到产淀粉酶的高产菌株。 【关键词】淀粉酶;水解圈;酶活力;高产菌株 Screening of Strains Producing Starch ×× (Technology of Biological Life Science College of Changchun Normal University) [Abstract] for the high-yield strains were screened for amylase, the starch hydrolysis circle as a model for screening, screening from the school near the soil produced amylase ability of the bacteria. Determination of the enzyme activity, high yield strain eventually produced amylase. [Key words] Amylase;Hydrolysis circle;Enzyme activity;Producing strain 前言：生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中, 是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化, 淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50% 以上。微生物的许多种类都能产生淀粉酶。淀粉酶种类繁多,特点各异且用途广泛。因为淀粉酶的用途广泛, 各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260 U /mL左右。虽然不少微生物能产生淀粉酶,但适合商业生产需要的菌株仍然很少, 在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件。本文以土壤作为原料, 从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行酶活力测定,使其给工业生产带来经济效益做大量的准备工作。 1. 材料与方法 1.1器材 ①培养皿、量筒、试管、滴管、吸水纸、烧杯、移液管、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、天平、滤纸、pH试纸、试管架、容量瓶等。 ②恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、控温摇床、分光光度计、离心机。 ③棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、称量纸、试管架、药匙、吸耳球、镊子、酒精棉、废液瓶、胶塞、火柴。 1.2试剂 ①牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、NaCl、蒸馏水、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、无菌水、95%乙醇、75%酒精、酵母膏、KH2PO4、碘液、淀粉溶液（0.5%）、蔗糖溶液（1%）、3,5
根据淀粉酶对淀粉的水解方式不同，可将其分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶等。其中，α-淀粉酶（α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。 α-淀粉酶来源广泛，主要存在发芽谷物的糊粉细胞中，当然，从微生物到高等动、植物均可分离到，是一种重要的淀粉水解酶，也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取。不同来源的α-淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌α-淀粉酶。 目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。如在淀粉加工业中，微生物α-淀粉酶已成功取代了化学降解法；在酒精工业中能显著提高出酒率。其应用于各种工业中对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。相对地，关于α-淀粉酶抑制剂国内外也有很多研究报道，α-淀粉酶抑制剂是糖苷水解酶的一种。它能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，降低人体糖份吸收、降低血糖和血脂的含量，减少脂肪合成，减轻体重。有报道表明，α-淀粉酶可以帮助改善糖尿病患者的耐糖量。 α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。现在，α-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业和造纸工业。 在焙烤工业中的应用： α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期 在啤酒酿造中的应用： 啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加α-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场合，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含量，提高麦汁率，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊化时间。在酒精工业中的应用： 在玉米为原料生产酒精中添加α-淀粉酶低温蒸煮的新工艺，每生产1t酒精可节煤 224.42kg。又可减少冷却用水，提高出酒率8.8％，酒精成品质量也有显著提高。酒精生产应用耐高温α-淀粉酶。采用中温95℃～105℃蒸煮，既可有效地杀死原料中带来的杂菌，降低入池酸度和染菌机率，又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏，形成焦糖或其它物质而损失，从而提高原料利用率 在造纸工业中的应用： 当代造纸工业中，造纸用化学品在提高纸品质量、增加纸品功能、提高生产效率和降低生产成本等方面发挥着极为重要的作用。由于淀粉与造纸用植物纤维素结构相近，相互间有良好的亲和作用，资源广泛，廉价易得，尤其是经变性处理的淀粉，能赋予纸张优异的性能，因此各类变性淀粉在造纸中广泛用于湿部添加、层间喷雾、表面施胶和涂布粘合。α-淀粉酶可以生产涂布粘合用变性淀粉