多粘芽孢杆菌检测方法

多粘类芽孢杆菌分类解释说明以及概述1. 引言1.1 概述多粘类芽孢杆菌（Multicellular Sporogenic Bacilli）是广泛存在于自然环境中的一类细菌。

它们具有独特的生态角色和功能，对各个领域包括医学、农业和环境等都有重要的应用价值。

对多粘类芽孢杆菌进行正确的分类研究，不仅有助于深入了解它们的分类学特征和系统发育关系，还能揭示其对生物多样性和环境影响的作用机制。

1.2 文章结构本文主要围绕多粘类芽孢杆菌分类展开论述。

首先介绍了文章的整体结构，包括引言、多粘类芽孢杆菌分类、解释说明多粘类芽孢杆菌分类意义、现状与挑战以及结论五个部分。

在每个部分中，会详细描述相应内容并提供相关研究和发展现状。

1.3 目的本文旨在全面阐述多粘类芽孢杆菌分类的重要性，并深入讨论其生态角色、应用价值以及对于环境和生物多样性的影响。

同时，对多粘类芽孢杆菌分类研究的现状和挑战进行回顾，并对未来的发展方向提出建议和展望。

以上为文章“1. 引言”部分的内容，旨在概述论文的主题、结构和目的。

2. 多粘类芽孢杆菌分类2.1 定义与特征多粘类芽孢杆菌（viscous spore-forming bacteria）是一类革兰氏阳性细菌，它们具有形成气囊状芽孢和薄层黏液的特征。

这些细菌通常在土壤、水体和动植物体表等环境中广泛存在，并且对于生态系统的平衡和功能发挥着重要作用。

在形态上，多粘类芽孢杆菌呈长杆状或丝状，其表面覆盖着黏液层，使得它们能够吸附并固定在环境中的不同介质上。

2.2 分类方法与标准多粘类芽孢杆菌的分类主要依据其生理学和生化学特征进行。

常见的分类方法包括形态观察、生长条件和代谢产物分析等。

其中，最常用的鉴定手段是通过16S rRNA基因序列分析进行系统发育研究，从而确定其亲缘关系和进化演化。

2.3 分类系统与进化关系根据现有研究成果，多粘类芽孢杆菌可分为多个属，如黏杆菌属（Viscillium），蓝杆菌属（Cyanobacterium）等。

芽孢杆菌检测试验方法所用的分析天平，移液管，滴定管，容量瓶等玻璃器皿按有关检定规定定期校正。

所用的水，在未注明其他要求量，均指蒸馏水或去离子水，所用的试剂，在未注明规格时，均为分析纯(A.R)4.1 感官指标：4.1.1 感官特性：从抽取的样品中，取适量倒在白纸或玻璃板上，在光线充足的条件下，观察颜色和状态，并品尝滋味，闻其气味。

4.1.2 过筛率：随机抽取500 g样品，取40目和20目的筛子，将样品取出100g 称重，过筛，再次称重，计算过筛率。

过筛后的总质量过筛率=-----------------×100%过筛前的总质量4.2菌种鉴别4.2.1菌落形态：培养24小时，暗白色或浅黄色圆形菌落，中央有小突起，不透明，表面干燥，菌落易挑起。

4.2.2 镜检菌体形态：0.5-0.6*2.5-3.5微米，杆状，中生芽孢、即使孢囊膨大、也不显著。

4.2.3 革兰氏染色：革兰氏阳性菌。

4.3 芽孢杆菌活菌总数4.3.1仪器、设备、试剂和培养基a.分析天平，感量为0.01g；b.恒温水浴锅；c.震荡器；d.高分辨力相差显微镜；e.湿热灭菌锅；f.超净工作台；g.研钵；h.血球计数板，XB-K-25；i.血球计数板专用盖玻片，20mm×20mm；j.加样枪；k.各类玻璃器皿。

9ml0.85%的无菌生理盐水试管，80ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，30ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，空的500ml三角瓶（内装10～15颗玻璃珠），空的20ml的刻度试管，1ml吸管，培养基配方：营养琼脂粉38g，蒸馏水1000ml。

上述物品，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。

在超净工作台上将灭好菌的营养琼脂倒平皿，每个大约20ml，放在紫外灯下吹风1小时，然后放在工作台面过夜，第二天备用。

4.3.2 预处理：准确称取样品 1.00克，将其全部转入一只已消毒的直径约10厘米的研钵中，从上述30ml 0.85%的无菌生理盐水三角瓶中取出约5ml水加入研钵，研磨10分钟，然后使用无菌生理盐水将其全部转移到空的20ml的刻度试管中，定溶至20ml，用振荡器震荡2分钟，将其全部震荡均匀。

芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变的研究（可编辑）芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变的研究福建农林大学硕士学位论文芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变研究姓名:刘国红申请学位级别:硕士专业:植物检疫指导教师:林乃铨;刘波20090401中文摘要采用稀释涂布法从我国15个省15份土样标本中分离出322株芽孢杆菌。

通过表型特征、脂肪酸成分、ITS测序等手段将322株菌鉴定为3个属，芽孢杆菌属Bacillus11个种，类芽孢杆菌属Paenibacillus属2个种，短短芽孢杆菌属Brevibacillus属2个种。

本文对芽孢杆菌的生物学特性进行了研究，观察了枯草芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌的细胞形态，并对几种常见芽孢杆菌的菌落形态进行了描述，也对枯草芽孢杆菌的生长特性做了相关的研究。

根据鉴定结果，统计分析了我国部分省芽孢杆菌的多样性，研究结果表明每个样点分离到芽孢杆菌的数量差异很大，每个采样点的优势种群的种类和数量也有很大差异。

15个采样点土样分离到的芽孢杆菌丰富度在2(8之间。

其中，青海采样点的芽孢杆菌丰富度最小，只分离到2种;新疆、内蒙古和宁夏芽孢杆菌的丰富度最大，为8。

新疆采样点的丰富度和多样性指数最高，其均匀度指数较高，生态优势度指数较低。

西藏的芽孢杆菌丰富度较低，多样性指数和均匀度指数最低，生态优势度指数最高。

因此物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与物种间数量差异程度有一定关系。

本文还初步研究了芽孢杆菌对香蕉枯萎病病原菌和青枯雷尔氏菌的拮抗作用，筛选到22株对香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用，15株对青枯雷尔氏菌有拮抗作用。

从空间分布来看，具有拮抗作用的菌株大部分是从北方各省分离到的。

(最后，本文讲述了芽孢杆菌属属水平上的分类变化现状，叙述了芽孢杆菌属相关属的分类依据种有112个。

本论文还根据IJSEM上发表的文章对112个芽孢杆菌种的特征进行整理，记录了每个种的特征、16SrRNA序列号和菌株编号。

多粘芽孢杆菌颗粒剂检测方法1、检测仪器、设备分析天平净化工作台磁力搅拌器微型漩涡振荡器超声波水浴器水浴锅恒温培养箱磁性棒250mL蓝口瓶5mL移液枪、枪头100mL刻度量筒1000μL移液枪、枪头100μL移液枪、枪头涂棒90mm培养皿2、培养基、试剂和溶液配制（1）检测培养基：土豆200g蔗糖20g 琼脂粉15g 蒸馏水1000mL 分装、灭菌、倒平板备用。

（2）10%吐温80溶液：准确移取10ml吐温80于100ml容量瓶中，用水定溶，分装、灭菌备用。

（3）生理盐水：9gNaCl用水定溶1000ml，分装400ml每瓶，灭菌备用。

3、测定步骤3．1 样品的预处理试样按照相同的方式处理，重复检测3次。

a)稀释液的配制：按照1‰的比例在无菌生理盐水中加入灭好菌的10%吐温80溶液，混合均匀，待用。

b)样品的称取：称取0.99—1.01g（准确至0.0002g）的试样倒入无菌蓝口瓶中。

c)试样母液的处理：（1）准确量取稀释液100ml，加入已经称好试样的蓝口瓶中后放在磁力搅拌器平台上，混合15分钟时剧烈摇动1分钟，再次混合15分钟，一共混合30分钟。

（2）将已混合好的试样母液放入超声波水浴器中（超声波水浴器水平面必须等同于试样液面试样瓶应放在超声波振源处），超声15分钟（7分钟时停止，猛烈摇动试样瓶，然后再超声8分钟）。

（3）在超声之后，再次用磁力搅拌器混合60分钟。

3．2 样品的稀释a) 向4支无菌试管分别加入4.5ml稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样。

操作在超净工作台中进行。

b)吸取0.5ml已处理好的试样母液于加入第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5ml稀释液于第2支试管，依次进行到第3支试管（每次加液后，需混合均匀，再进行下一次操作）。

c）将已混好的第3支试管放入70℃水浴锅中水浴30分钟后放入冰水中冷却至常温，然后准确吸取0.5ml该试管中的稀释液于第4支试管，混匀，备用。

4．3 稀释样品的平板培养准确移取0.1ml的第4支试管中的稀释液到每个营养琼脂平板中（共5个平板），各平板均标上分析号、日期、稀释度。

芽孢杆菌检测方法及注意事项枯草、地衣芽孢杆菌检测方法及注意事项一、检测方法1.试剂和培养基1.1 样品稀释液：准确移取1mL吐温80，9gNacl用水定溶1000mL，分装400mL每瓶，灭菌备用。

1.2 芽孢杆菌培养基：蛋白胨：10g酵母浸粉：5gNaC1盐：10g琼脂粉：15gPH值：7.0～7.2蒸馏水：1000mL分装，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。

2.检测步骤2.1样品处理（每个样品至少重复检测2次）a) 称取1～3g(准确至0.0002g)的试样或标样于250 mL内置磁性棒的中性瓶中（1000亿称1 g左右，2000亿称3 g左右，3000亿称2 g左右，5000亿称1.2 g左右，称样量视具体芽孢数而定）。

b) 加100 mL稀释液到已称样的中性瓶内。

c) 把上述中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min；之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。

d) 将已混合好的试样放入超声波水浴器中（超声波的水平面与试样液面平齐，试样瓶应放在超声波振源处），共超声20min（10min 时停止，猛烈摇动试样瓶1 min，然后再超声10min）。

e)超声之后，再次用磁力搅拌混合60min.2.2样品的稀释a）向无菌试管分别加入4.5mL稀释液(1000亿6支，2000亿、3000亿、5000亿7支)。

b)吸取0.5mL已处理好的试样溶液于第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依此进行到倒数第二支试管(每次加液后,需混合均匀，再进行下一次操作)。

c) 将已混好的倒数第二支试管放入70℃水浴锅中水浴30min。

冷却至室温后准确吸取0.5mL该试管试样溶液于最后一支试管，混匀、备用。

每次操作必须使用无菌枪头，枪头不可重复使用。

2.3 涂平板及培养从最后一支试管中准确移取0.1 mL的试样到每个营养琼脂平板中（共4个平板），各平板均标记上分析号、日期、稀释度。

使用1支涂棒，将已放在平板中的试样扩展开（从中心往外移，成辐射状扩展）；在扩展完4个试样平板后，涂棒在1个空白营养琼脂平板上进行涂布（保证涂棒上沾附的活芽胞数也能进行培养、计数）。

多粘类芽孢杆菌1.基本特性1.1中文通用名称：多粘类芽孢杆菌1.2英文通用名称（或拉丁名称）：Paenibacillus polymyxa1.3毒性：低毒1.4应用作物：棉花、玉米、水稻、花生、马铃薯、黄瓜、青椒1.5防治对象：棉花黄萎、黑根腐、炭疽病、赤霉病；玉米全蚀病；水稻白叶枯病；花生青枯病；马铃薯软腐病；黄瓜角斑；青椒疮痂1.6生防特点：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对植物黄萎病、鹰嘴豆枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害均具有一定的控制作用。

美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一。

无论是采用HY96-2（P. polymyxa）发酵液，还是由HY96-2制成的细粒剂(KDLD)，在温室内和田间都取得了稳定的防治效果，并且KDLD细粒剂在田间表现的效果更为突出。

2.定性鉴别试验2.1菌株的形态及培养特征类芽孢杆菌属。

菌株接种于 LB固体培养基上，28ºC培养 18～24 h，观察其菌落形态。

利用光学显微镜观察在LB培养基上生长菌体形状和革兰氏染色情况，利用电镜观察菌体大小、荚膜和鞭毛着生情况。

菌体大小为(0．6～ 0．8) μm ×(2．0～5．0) μm，革兰氏阳性、阴性或可变，兼性厌氧，杆状，产芽孢，芽孢椭圆形，端生，膨大，有荚膜，鞭毛侧生或周生。

在 PDA平板上，菌落较小、白色或淡黄色、圆形、菌面稍凸或不凸起，边缘整齐，表面有光泽、光滑、湿润、半透明到不透明；在肉汁琼脂培养基上生长菌落较薄，无菌膜，液体澄清；在斜面培养基上生长良好，菌苔线状、扁平，表面光滑、半透明。

最适合生长温度30-35 ºC表1 菌株在不同培养基中的培养特征（30ºC ，2天）培养特性LB琼脂营养琼脂酵母浸膏琼脂牛肉汁琼脂菌落颜色乳白色杏仁白色淡黄白色灰白色菌落形状湿润光滑粘稠状有小突起，粘性湿润光滑菌落直径mm 2.5 2.8 3 2.62.2生理生化特征由表2可知，菌株的接触酶、厌氧生长、酪朊水解、淀粉水解、V—P反应和硝酸盐还原均为阳性；氧化酶、酪氨酸水解、脲酶、卵黄卵磷脂水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D葡萄糖、D一木糖、D一甘露醇、甘油，且均产酸、产气。

多粘类芽孢杆菌标准多粘类芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌，属于杆菌科，可以产生多种有益物质和酶。

由于其对环境友好、易于培养和培养基制备成本低等优点，多粘类芽孢杆菌已成为许多研究领域和应用领域的重要模式生物和工业微生物。

一、基本信息多粘类芽孢杆菌的形态特征为直杆状，大小约为1-2微米×4-8微米。

菌体质地坚韧，具有黏附作用。

芽孢是其最典型的特征之一，芽孢具有抵抗外界环境的能力，在极端条件下也能存活。

二、培养条件1. 基本培养基：以肉汤-蛋白胨培养基为基础，可加入适量的葡萄糖、淀粉等碳源，适量的无机盐和适宜的pH值。

2. 温度：多粘类芽孢杆菌为嗜温菌，适宜生长温度为30-40℃，最适温度为37℃。

3. pH值：多粘类芽孢杆菌能适应较宽的pH范围，但最适pH为6-8。

4. 氧气条件：多粘类芽孢杆菌为厌氧菌，对氧气耐受能力较强。

三、生物学特性1. 产孢性：多粘类芽孢杆菌产孢能力很强，芽孢可以在环境中长时间存活。

2. 生长速度：多粘类芽孢杆菌生长速度较快，平均每递增20分钟分裂一次。

3. 酶的产生：多粘类芽孢杆菌可以产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等。

4. 干旱抗性：多粘类芽孢杆菌对干旱有很强的抵抗能力，能在干燥环境下存活。

四、应用领域1. 农业领域：多粘类芽孢杆菌在农业生产中有广泛应用，可用于提高作物的营养吸收、防治植物病害、增强植物抗逆性。

2. 生物农药制备：多粘类芽孢杆菌对许多农业害虫有杀灭作用，可制备成生物农药用于害虫防治。

3. 饲料添加剂：多粘类芽孢杆菌可以促进动物的消化吸收能力，提高饲料利用率，可作为饲料添加剂使用。

4. 工业微生物：多粘类芽孢杆菌可以产生多种酶和有益物质，可用于食品、医药、生物燃料等工业领域。

五、实验操作1. 菌体培养：将多粘类芽孢杆菌接种于含有适宜培养基的培养皿中，经过适当的培养条件，利用摇床或恒温培养箱进行培养。

第51卷第1期2022年1月福建农林大学学报(自然科学版)Journal of Fujian Agriculture and Forestry University ( Natural Science Edition )一株拮抗性多粘类芽抱杆菌的鉴定及其对小麦赤霉病的田间防效邓云(福建省南平市农业科学研究所，福建南平354200)摘要：采用平板对峙法从长期开展小麦赤霉病抗性鉴定的鉴定圃土壤中分离筛选出一株具有广谱抗真菌活性的微生物菌 株DY04.结合菌落形态观察和16S rDNA 基因序列分析，将其鉴定为多粘类芽抱杆菌.通过灌根、穗部喷洒原菌液和穗部喷 洒发酵液等3种施药方法研究多粘类芽抱杆菌菌株DY04对小麦赤霉病的防效和小麦产量的变化.结果表明：将该菌株灌 根处理可有效防治小麦赤霉病，防治率达58.43% ；同时，小麦籽粒千粒重比对照增加&83%,理论产量增加45.21%.关键词：多粘类芽抱杆菌DY04；小麦赤霉病；生物防治中图分类号：S482； S481.9文献标识码：A文章编号：1671-5470( 2022) 01-0021-06DOI ：10.13323/ki.j.fafu( nat.sci.) .2022.01.003开放科学(资源服务)标识码(OS1D )Identification of Paenibacillus polymyxa as antagonist to Fusarium head blightof wheat and its field control efficacyDENG Yun(Nanping Institute of Agricultural Sciences , Nanping , Fujian 354200, China )Abstract : A microbial strain DY04 with broad-spectrum antifungal activity was isolated and screened using plate confrontation meth ­od from nursery soil where long-term study on the resistance of Fusarium, head blight ( FHB) of wheat was carried out. The strain was identified as Paenibacillus polymyxa by colony morphology analysis and 16S rDNA gene sequencing. Three field application methods , namely root irrigation , spraying with viable bacteria on panicle and spraying with fermented liquid on panicle , were used to assess the control effect of DY04 on FHB and wheat yield. The results showed that root irrigation can effectively control FHB, resulting in a maximum control rate at 58.43% ； thousand-grain weight of wheat was 8.83% higher in root irrigation group than that of the con ­trol, leading to 45.21% increase in the theoretical yield.Key words : Paenibacillus polymyxa DY04 ； Fusarium head blight ； biocontrol小麦赤霉病是世界性病害［|-2］,广泛分布于我国温暖潮湿或半潮湿地区,多发于长江上、中、下游及黄 淮南片区，对小麦生产的危害甚大.该病不仅会造成小麦严重减产，而且其产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒 性强,食用后会引起眩晕、发烧、恶心、呕吐、腹泻等急性中毒症状,同时会降低免疫能力和生育能力等,危 害人畜健康.目前，施用化学杀菌剂是农业生产上控制真菌性病害的主要方法⑶,但是化学农药容易导致 农药残留、环境污染、植物病菌产生抗药性等问题.因此，迫切需要更加安全环保的新型生物农药代替传统 的化学杀菌剂［4-6］.多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa )为芽抱杆菌科(Bacillaceae )类芽抱杆菌属，是一类重要的根 际有益菌⑺少它的代谢产物中含有多种可利用的生物活性物质，如多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、核苷类似 物、毗嗪类、醇醛酸等,在农业、食品和环境等方面具有潜在应用价值•多粘类芽抱杆菌可通过产生的抗菌 物质和位点竞争的作用方式杀死和控制病原菌［宀⑸，且该菌是非致病性细菌，被广泛应用于微生物制剂 的研制•此外，该菌具有活性高、环境污染小以及不易产生抗药性等特点，具有巨大的生防价值［16一17］.收稿日期：2021-05-17 修回日期：2021-06-28基金项目：国家重点研发计划项目(2017YFD0101000).作者简介：邓云(1981-)，女，高级农艺师•研究方向：植物保护与抗病育种.Email ：25362663@ .-22-福建农林大学学报(自然科学版)第51卷目前,有关广谱抑制真菌的多粘类芽抱杆菌的报道不多，市面上可用于防治小麦赤霉病的多粘类芽抱杆菌的微生物农药菌种资源也不够丰富;有关多粘类芽抱杆菌的主要研究方向为其生物特性和对土壤及作物的作用机理[18-23].本研究从常年开展小麦赤霉病抗性鉴定的鉴定圃土壤中分离出一株具有广谱抑菌效果的多粘类芽抱杆菌DY04,研究其不同施用方法对防治小麦赤霉病和小麦产量的影响，以期为小麦赤霉病的生物防治提供种质资源,并为该生防菌的实际应用提供理论依据.1材料与方法1.1材料1.1.1生防菌菌株菌株DY04分离自福建省南平市建阳区童游街道南平市农业科学研究所试验基地的小麦赤霉病抗性鉴定圃土壤.1.1.2病原真菌菌株禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)A稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)由本课题组分离；玉米平脐蠕抱(Bipolaris sp.)、茶拟盘多毛抱(Pestalotiopsis theae)、玉米茎点霉属(Phoma sp.)、番茄尖抱镰刀菌(F.oxysporum)、香蕉枯萎病尖抱镰刀菌(F.oxysporum f.sp.)、黄萎病镰刀菌(F.verticillium)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)等由福建农林大学植物保护学院鲁国东教授提供;玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)由福建省农业科学院植物保护研究所陈福如教授、杜宜兴副研究员提供.1.1.3供试小麦品种供田间试验的小麦品种扬辐麦4号由扬州里下河农业科学研究所提供.1.1.4培养基红糖豆粉培养基(发酵液)[20]:红糖23.3g-L-',CaC034.9g-L\豆粉11.1g-L'1, KNO38g•L_i,KH2P040.5g-L_l,K2HP041.2g•L_l,MgS04-7H205g-L_l,NaCl3g-L_I.PDA培养基：马铃薯180~250g,葡萄糖15~25g,琼脂15~20g,水1000mL.1.1.5微生物菌液助剂添加剂配方为分散剂PVA(聚乙烯醇)7.2%、湿润剂D425(烷基磺酸缩聚物) 4.8%、稳定剂CMC-Na(羧甲基纤维素钠)2.0%、保护剂FWA(荧光增白剂)0.1%[24].1.2室内测定方法1.2.1染菌大麦粒诱导分离拮抗菌株DY04将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却至室温，向装有大麦粒的瓶中接种禾谷镰刀菌菌块，并在25~26弋条件下培养5~6d,其间摇动培养瓶2~3次，使大麦粒充分长满禾谷镰刀菌.使用若干块无菌纱布分别包裹数颗已长满禾谷镰刀菌的大麦粒，并逐份扎口、系好标签，将其掩埋在鉴定圃土壤10~20cm的深度诱导拮抗菌附着在染菌大麦粒上,20d后取出，并分别装入灭菌后的玻璃瓶内,做好标记待用.取出大麦粒洗净消毒后，置于PDA平板培养基上培养3 ~5d,观察染菌大麦粒菌丝发展情况.挑取没有明显菌丝扩张的培养皿内的拮抗菌,进行分离纯化培养,得到拮抗菌株DY04[25].1.2.2拮抗菌株DY04对病原真菌的防效测定采用平板对峙法[26]进行测定.将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却至室温，向装有大麦粒的瓶中接种拮抗菌DY04菌块，并在28弋条件下培养1~ 2d,让拮抗菌侵染全部大麦粒.将病原真菌的菌丝块接到PDA培养基(9cm培养皿)的中央，在距离中央2.5cm的左右两侧各嵌入一粒携带拮抗菌株DY04的大麦粒，以中央只接种真菌菌块的PDA平板为对照,所有培养皿封口后于28弋下培养5~7d,观察生长情况.每个处理3次重复，当对照菌丝长满整个培养皿时，测定每个培养皿真菌菌落直径，计算抑制率.抑制率/%=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径X100.1.2.3菌落形态特征鉴定挑取菌株DY04培养24h,用100咽无菌水制成菌悬液[20]，然后划线于PDA 平板上,28T恒温培养48h,观察菌落的形态特征.1.2.416SrDNA序列同源性测定提取拮抗菌株DY04的DNA,由生工生物工程(上海)股份有限公司提取并测序,琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,PCR所用的引物融合了Miseq测序平台的V3-V4通用引物341F(上游引物5，-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3，,下游引物5，-CCTACGGGNGGCWGCAG-3，)和805R(上游引物5，-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3,,下游引物5，-GACTACHVGGG-TATCTAATCC-3，).PCR反应体系：2xTaq master Mix15fiL,Bar-PCR primer F(10pimol•L-1)1»L,Primer R(10pmol-L-1)1pL,Genomic DNA10~20ng,H20加至30pL.PCR扩增程序:94T预变性5min；94弋第1期邓云:一株拮抗性多粘类芽抱杆菌的鉴定及其对小麦赤霉病的田间防效・23・变性30s,55°C退火20s,72°C延伸30s,共设置25次循环，最后72°C延伸5min.16S rDNA序列在核糖体数据库（/index.jsp）中进行BLAST比对.1.2.5拮抗菌株DY04发酵液的抑菌效果测定挑取DY04菌株在红糖豆粉培养基发酵液中培养2d后,在12000r・min-1条件下离心10min,两次收集上清，上清液过0.22^m无菌滤膜后分别稀释至2、4、8、16,32倍，取20^L发酵液采用牛津杯对峙法[26]观察抑菌效果.1.3田间试验方法1.3.1小麦播种试验于2020年11月16日一2021年4月15日在福建省南平市农业科学研究所试验基地进行.该基地为全国冬小麦国家区试赤霉病自然抗性鉴定点,赤霉病每年自然稳定发生,无需接种赤霉病菌.冬小麦于11月16日采用条播法播种,行距为26cm,畦宽1m,畦长20m，沟深30cm,基肥施用小麦专用复合肥900kg・hm-2、钙镁磷肥600kg・hm-2,播种后覆土并灌跑马水增加土壤湿度,保证小麦整齐出芽.灌水后立即施用丁草胺除草剂封闭除草，12月10日分蘖盛期施用二甲四氯钠防治双子叶杂草，12月25日人工培土除杂草，次年2月2日施用拔节肥.1.3.2试验设计共设置5个处理：（1）灌根，在小麦始穗期用拮抗菌株DY04的原液灌根处理一次；（2）穗部喷洒原液，分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒拮抗菌株DY04的原液（含助剂）各一次;（3）穗部喷洒发酵液，分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒拮抗菌株DY04的发酵液（含助剂）各一次；（4）农药对照，分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒60%戊唑多菌灵水分散粒剂（河北冠龙农化有限公司）各一次;（5）空白对照（CK）,分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒清水各一次.每个处理3次重复，共15个小区，每个小区20m2.穗部喷洒的拮抗菌原液（NB培养液培养）和发酵液（红糖豆粉培养液培养）有效成分含量为150000亿个・hm-2，灌根处理的有效成分含量为300000亿个・hm-2.1.3.3调查方法于小麦黄熟期病害稳定时采用5点取样法调查赤霉病发病情况.每点调查40穗，每小区调查200穗，记录小麦的病穗数和病小穗数，计算病穗率、病小穗率和防效，防效/%二（空白对照小区的病小穗率-处理小区的病小穗率）/空白对照小区的病小穗率x100[27].同时，于收获期调查有效穗数、每穗实粒数，测千粒重，计算理论产量和增产率.单位面积理论产量/（kg・hm-2）二平均每穗实粒数x千粒重（g）x每公顷有效穗数x10-3.1.4数据处理运用IBM SPSS Statistics19软件选择单因素方差分析处理数据.2结果与分析2.1菌落形态多粘类芽抱杆菌是一种革兰氏阳性菌,好氧或兼性厌氧生活⑻.显微镜（凤凰光学PH100-3A41L-EP）下观察到DY04菌体呈杆状，菌体大小为（0.5〜1.0）^mx（2.0〜8.0）^m,在PDA固体培养基上菌落呈白色透明、圆形,边缘整齐,表面湿润、光滑、微隆起（图1）.形态特征与多粘类芽抱杆菌相吻合.图1菌株DY04菌落(左)及菌体形态(右)(x1000)Fig.l Colony(left)and cell morphology(right)of strain DY04(x1000)・24・福建农林大学学报（自然科学版）第51卷2.216S rDNA序列比对结果菌株DY04的16S rDNA的序列长度为1490bp.经同源性鉴定，该菌株为类芽抱杆菌属（Paenibacil-lus）.由系统发育树（图2）可以看出，菌株DY04与Paenibacillus polymyxa（多粘类芽抱杆菌）聚为一个分支.结合形态特征,将其鉴定为多粘类芽抱杆菌.2.3菌株DY04的抑菌效果通过平板对峙法测定了菌株DY04对10种真菌的抑菌活性，结果（图3、表1）表明，该菌株对10种病原真菌均有不同程度的拮抗作用，表现出广谱抗病原真菌的特性.其中:对禾谷镰刀菌和稻瘟病菌的抑制率都达到80%以上;对茶拟盘多毛抱、番茄尖抱镰刀菌、灰霉病菌和玉米纹枯病菌的抑菌活性也较强，抑制率达到60%以上;对玉米平脐蠕抱的抑制率最低，为46.27%.94%]-----------------------------------------------------------------------Paenibacillusphoenicis NR108292.196%-----------Paenibacilluspolymyxa NR117732.2--------DY040.01图2菌株DY04的系统发育树图3菌株DY04对禾谷镰刀菌的抑制效果Fig.2Phylogenetic tree of strain DY04Fig.3Inhibitory effect of strain DY04on F.graminearum表1菌株DY04及其发酵液的拮抗谱i）Table1Antagonistic spectrum of strain DY04and its fermentation broth不同稀释倍数发酵液的抑菌效果病原真菌抑制率/%----------------------------------------------------2 4 81632禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)玉米平脐蠕抱(Bipolaris sp.)茶拟盘多毛抱(Pestalotiopsis theae)玉米茎点霉属(Phoma sp.)番茄尖抱镰刀菌(Fusarium oxysporum)香蕉枯萎病尖抱镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.)黄萎病镰刀菌(Fusarium verticillium)灰霉病菌(Botrytis cinerea)玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)81.50±1.30a+46.27±2.92f+64.44±1.01bc+58.83±3.32de+63.83±2.52bcd+55.66±1.76e+57.44±1.57e+66.78±1.84b+60.11±1.26cde+81.55±1.83a+++++--++-++++++++-++-++-++-1）数据为各处理3个重复的平均值±标准差，数据后附不同字母者表示在0.05水平上差异显著，附相同字母者表示差异不显著•+表示有抑菌效果,-表示无抑菌效果.2.4菌株DY04发酵液的抑菌效果采用牛津杯对峙法测定了菌株DY04发酵液对10种真菌的抑菌活性，结果（表1）表明：菌株DY04发酵液稀释至4倍时对10种真菌都有抑制作用;稀释至16倍时仅对禾谷镰刀菌、玉米茎点霉属、番茄尖抱镰刀菌和稻瘟病菌等4种真菌具有抑制效果.2.5施药方法对菌株DY04防治小麦赤霉病的影响表2显示,戊唑多菌灵对小麦赤霉病的防效最高，达到83.46%.多粘类芽抱杆菌菌株DY04的3种表2菌株DY04对小麦赤霉病的田间防治效果】）Table2Field control effect of strain DY04on head blight of wheat%处理病穗率病小穗率防效灌根92.5±2.04b12.22±4.82b58.43±4.63b穗部喷洒原液100.0±0.00c15.40±1.54b47.63±5.23c穗部喷洒发酵液97.5±2.88bc12.42±0.63b57.76±2.15b戊唑多菌灵57.5±5.40a 4.86±0.84a83.46±1.81a清水对照100.0±0.00c29.39±7.74c】）数据为各处理3个重复的平均值±标准差，数据后附不同字母者表示在0.05水平上差异显著，附相同字母者表示差异不显著.第1期邓云:一株拮抗性多粘类芽抱杆菌的鉴定及其对小麦赤霉病的田间防效-25-施药方法中:灌根处理的防效最高，达到58.43%；穗部喷洒发酵液的防效次之，为57.76%；穗部喷洒原液的防效为47.63%.2.6菌株DY04施用方法对小麦产量的影响表3显示,小麦经3种方法施用多粘类芽抱杆菌菌株DY04后，穗实粒率、穗实粒数、千粒重与对照相比均有显著增加.灌根处理、穗部喷洒原液和穗部喷洒发酵液处理的千粒重分别比对照增加&83%、5.93%和7.21%；理论产量增产率分别为45.21%、25.29%和29.10%.表3菌株DY04施用方法对小麦产量的影响“Table3Effect of strain DY04application method on wheat yield处理有效穗数穗实粒率/%穗实粒数/粒千粒重/g理论产量kg•hm-2万个•hm-2灌根329.55±6.15a90.30±0.46b36.81±0.10b39.69±0.35ab4814.85穗部喷洒原液326.25±11.70a83.23±0.92d32.95±0.37c38.63±0.12c4154.25穗部喷洒发酵液324.90±6.30a85.87±0.45c33.69±0.56c39.10±0.36bc4280.55戊唑多菌灵326.10±3.75a95.70±0.83a40.03±0.33a40.00±0.37a5220.60清水对照326.55±9.75a71.27±0.96e27.85±0.59d36.47±0.61d3315.75 l)数据为各处理3个重复的平均值士标准差,数据后附不同字母者表示在0.05水平上差异显著，附相同字母者表示差异不显著.3讨论多数研究者认为,多粘类芽抱杆菌为土壤中的活跃菌,容易在土壤中定殖和繁殖，在土壤的物资和能量循环中发挥重要作用，其代谢产物能够有效抑制病害；同时，该菌具有溶磷和固氮作用，能够增加土壤肥力和调节土壤微生态，促进植物生长,进而增强植物抵抗力[28-33].本试验中的多粘类芽抱杆菌DY04为土壤中筛选出的微生物菌.本研究表明,与穗部喷洒原液(防效为47.63%)或发酵液(防效为57.76%)相比,田间采用灌根方式施用多粘类芽抱杆菌DY04,对小麦赤霉病的防效较好，达58.43%.虽然在穗部施用时添加了保护剂等抗紫外线的助剂，且设置了连续施药3次的处理，但是防效持续性仍不够强，原菌及其代谢产物对紫外线敏感，且原菌不易定殖于植株穗部,导致穗部喷施的效果不及灌根处理.针对穗部喷药持效性弱的问题，今后可尝试炼化该菌的抗紫外线能力后进一步验证其持效性;灌根处理虽然防效较好，但与化学农药相比仍存在很大的差距,本试验中灌根处理只在抽穗初期进行了一次，今后可以通过在分蘖初期至扬花期增加灌根次数测试其是否能够提高药效，同时观察该菌在土壤中的定殖能力，为进一步分析其控制赤霉病发生的机理奠定基础.赤霉病菌会造成小麦穗部空瘪、籽粒发红发黑、千粒重低，从而降低结实率.本研究表明，与穗部喷洒原液或发酵液相比，灌根处理后小麦产量的增幅最大，千粒重比对照增加8.83%,理论产量增产率为45.21%.笔者田间观察发现，用多粘类芽抱杆菌DY04灌根处理后，灌浆期小麦籽粒外壳部分虽然有红褐色病斑,但后期受到控制并未影响内部健康籽粒；而穗部喷洒原液或发酵液后,灌浆后期外壳带菌麦粒并不能被有效控制，赤霉病菌仍向内部发展,从而降低了籽粒品质.有关灌根处理对小麦赤霉病的防治机理值得深入研究.致谢:衷心感谢苏妍、黄继平、洪红升、葛桂梅、刘友等同事对该试验给予的帮助.参考文献[1]李正辉，向晶晶,陈婧鸿，等.小麦赤霉病拮抗菌的分离与鉴定[J].麦类作物学报,2007,27(1):149-152.[2]韩青梅，曹丽华.小麦赤霉病的生物防治研究进展[J].麦类作物学报,2003,23(3):128-131.[3]成丽霞，彭兵，李天金，等.一株具有广谱抗真菌活性细菌菌株的分离鉴定及拮抗物的理化特性[J].微生物学通报,2009,36(3):365-370.[4]STURZ 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30(4)489-496 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2014年8月一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定郭芳芳1,2，谢镇3，卢鹏1，郭岩彬4，张立钦2，王勇军1,2*（1. 浙江农林大学林业与生物技术学院，临安311300；2. 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，临安311300；3. 浙江省桐庐县林业局，桐庐311500；4. 中国农业大学资源与环境学院，北京100193）摘要：菌株CF05是从浙江天目山柳杉中分离得到的1株细菌，经形态、16S rDNA序列、生理生化指标检测，鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa。

平板拮抗结果表明，该菌对9种植物病原真菌和3种病原细菌具有显著拮抗效果。

室内生测结果表明，发酵液和菌悬液对番茄幼苗均具有明显的促生效果，其中发酵液处理最佳，鲜重增长272.0%，干重增长266.7%。

菌株CF05接种27 d后，番茄根际细菌浓度仍很高。

种子萌发测定结果表明，菌株CF05处理后发芽率提高11.7%，番茄猝倒病防治测定结果显示，发病率降低38.6%，效果均优于Bacillus subtilis 168处理。

综上结果，表明P. polymyxa CF05是1株生防性状优良的促生细菌。

关键词：多粘类芽孢杆菌；生物防治；促生；番茄猝倒病中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2014)04-0489-08Identification of a Novel Paenibacillus polymyxa Strain and Its Biocontroland Plant Growth-Promoting EffectsGUO Fangfang1,2, XIE Zhen3, LU Peng1, GUO Yanbin4, ZHANG Liqin2, WANG Yongjun1,2*(1. College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, China; 2. National Joint Engineering Laboratory of Biopesticide Preparation, Lin’an 311300, China; 3. Tonglu Forestry Bureau of Zhejiang Province, Tonglu 311500, China; 4. College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094, China)Abstract: Strain CF05 isolated from Cryptomeria fortunei in Tianmu Mountain, Zhejiang province was identified as Paenibacillus polymyxa on the bases of its phenotypical and biochemical characteristics as well as 16S rDNA gene sequence. The P. polymyxa CF05 exhibited highly antagonistic effects against 9 plant fungal pathogens and 3 plant bacterial pathogens in vitro. Furthermore, both cell-free fermentation and bacterial suspension promoted tomato seedlings growth in greenhouse assay. Cell-free fermentation increased the biomass with fresh weight and dry weight by 272.0% and 266.7%, respectively. It was demonstrated that secondary metabolites from this bacterium might perform a critical function in plant growth promotion. Tests of root-colonizing ability indicated that concentrations of the bacterium in tomato rhizosphere were 3.8, 3.6, 3.1 and 3.1 log CFU/g root after 27 days of inoculation of tomato seeds with the bacterial suspension at 108、107、106、105 CFU/mL, respectively. Seed germination ratio was increased by 11.7%, and the disease incidence of damping-off was reduced by 38.6% after seed treatment.Key words:Paenibacillus polymyxa; biological control; plant growth promotion; tomato damping-off disease多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa是一类具有广泛宿主的根际促生菌，对真菌、细菌、线虫等引起的植物病害具有防治效果。