总胆红素测定试剂盒（重氮法）
一、胆红素的代谢
正常人血中胆红素来源有以下几种
（1）大部分来自于衰老RBC破坏后的Hb衍化而成
（2）小部分来自于非Hb的血红素蛋白质的血红素辅基分解，即分路胆红素
（3）极少部分来自于骨髓无效造血所产生的胆红素
胆红素与ALB结合后为肝细胞摄取并转变为水溶性的结合
胆红素，排至胆汁中，结合胆红素在肠道中被细菌作用还原成尿胆原，在肠道被吸收入门静脉，大部分肠肝循环，另一部分入体循环，经肾排泄入尿。
因此，在胆红素代谢的上述途径中有任一环节受阻，均可导致结合或非结合胆红素升高而产生黄疸。
二、胆红素测定的意义
测定胆红素有助于鉴别溶血性黄疸，肝细胞性黄疸及梗阻性黄疸
联合其它检测项目还可鉴别肝内淤胆和肝外梗阻性黄疸
溶血性黄疸肝细胞性黄疸梗阻性黄疸
血浆总胆红素（mg/dl）＜5 1-70 不完全梗阻10~15，完全梗阻20~30
未结合胆红素高度增加增加增加
结合胆红素正常增加高度增加
尿胆素定性阴性阳性强阳性
尿中胆素原增多不定或升高减少或消失
粪中胆素原增多减少减少或消失
三、测定原理
血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应产生偶氮胆红素，所以称为直胆，又称1min胆红素测定，非结合胆红素测定时要以咖啡因、苯甲酸钠为加速剂破坏胆红素氢键再与重氮试剂反应，抗坏血酸破坏剩余重氮试剂，加入碱性酒石酸钠使最大吸光度由530nm转到598nm，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度降至可忽略不计，使灵敏度和特异性升高，最后形成的绿色是由兰色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。
试剂：（1）咖啡因（2）碱性酒石酸钠液（3）亚硝酸钠液
（4）对氨基苯磺酸溶液（5）重氮试剂（将3、4混合）
（6）5g/L NaN3 （7）胆红素标准液
操作：
总胆管结合管对照管
血清（ml） 0.2 0.2 0.2
咖啡因-苯甲酸钠试剂（ml） 1.6 1.6
对氨基苯磺酸溶液（ml） 0.4
重氮试剂（ml） 0.4 0.4
混匀后，总胆管置室温10min，结胆管置37℃1min
NaN3（ml） 0.05
咖啡因-苯甲酸钠试剂（ml） 1.55
碱性酒石酸钠溶液 1.2 1.2 1.2
以对照调零，测各管A600，查标准曲线
正常参考值：血总胆红素 5.1~19umol/L(0.3~1.1mg/dl)
血清结合胆红素 1.7~6.8umol/L(0.1~0.4mg/dl)
四、方法与评价
本法稳定性好、灵敏度高、轻度溶血无影响
胆红素对光敏感，标本与标准品应避光，血脂会干扰测定，因此应取空腹血。
总胆红素（TBIL）测定试剂盒（重氮法） 适用范围：该试剂盒用于体外定量测定人血清中总胆红素的浓度。1.1 产品规格 1.2 组成成分 该试剂盒由试剂1（R1）、试剂2（R2）和校准品（选配）组成。
1.2.1试剂组成 试剂1: 对氨基苯磺酸≥10.0mmol/L 十六烷基三甲基溴化铵≥5.0mmol/L 试剂2: 亚硝酸钠≥1.0mmol/L 1.2.2 校准品组成 牛血清 总胆红素目标浓度：200μmol/L 该校准品为牛血清基质冻干品 2.1 外观 a) R1应为无色溶液，无混浊，无未溶解物。 b) R2应为无色溶液，无混浊，无未溶解物。 c) 校准品应为白色至淡黄色固体。 2.2 净含量 液体组分不少于标示值。 2.3 试剂空白 2.3.1试剂空白吸光度 应不大于0.050。 2.4 分析灵敏度 TBIL试剂盒测定浓度100.0μmol/L的被测物时，吸光度差值（ΔA）应不小于0.050。 2.5 准确度
用纯品测定回收率，应在85%-115%之间。 2.6 精密度 2.6.1重复性 变异系数应不大于5%。 2.6.2批间差 批间相对极差（R）应不大于10%。 2.6.3校准品批内瓶间差 测试校准品，所得结果的批内瓶间差应不大于5%。 2.7 线性 在（0,427.0]μmol/L范围内，TBIL试剂盒的线性相关系数r应不低于0.9900；在（0,50.0]范围内绝对偏差应不超过5.0μmol/L，在(50.0,427.0]范围内相对偏差应不超过±10%。 2.8校准品溯源性 依据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品控制物质赋值的计量学溯源性》及有关规定提供总胆红素校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容。校准品溯源至国家参考物质GBW(E)090002。 2.9稳定性 2.9.1校准品复溶稳定性 校准品复溶后，在2℃～8℃密封保存24小时，测试试剂盒准确度，应符合2.5的要求。 2.9.2 试剂盒稳定性
总胆红素测定试剂盒(重氮盐法) 适用范围：用于体外定量测定人血清中总胆红素的浓度。 1.1 规格 试剂1:1×60 mL，试剂2:1×20 mL； 试剂1:1×60 mL，试剂2:1×15 mL； 试剂1:1×60 mL，试剂2:1×12 mL； 试剂1:4×60 mL，试剂2:4×15 mL； 试剂1:2×40 mL，试剂2:2×10 mL； 试剂1:3×28 mL，试剂2:3×7 mL； 试剂1:1×4L，试剂2:1×1L； 试剂1:2×4L，试剂2:1×2L。 1.2主要组成成分 试剂1主要组分： 试剂2主要组分： 2.1 净含量 应不低于试剂瓶标示装量。 2.2 外观 试剂1为无色或浅色澄清液体，试剂2为无色或浅色澄清液体。外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。
2.3 试剂空白 在546nm处测定试剂空白吸光度，应≤1.0。 4.4 分析灵敏度 测试100umol/L的被测物时，吸光度变化（ΔA）应不低于0.01。 2.5 准确度 在样品中加入一定体积的纯品，计算回收率，应介于90%-110%之间。 2.6 重复性 批内变异系数（CV）应不超过7％。 2.7 线性 2.7.1在[1，400]umol/L区间内，线性相关系数r应不低于0.990； 2.7.2 [1，28）umol/L区间内绝对偏差不超过±1.96umol/L；[28，400]umol/L 区间内相对偏差不超过±7%。 2.8 批间差 对同一份样品进行重复测定，相对极差不大于7％。 2.9 稳定性 取在2℃～8℃条件下贮存达到12个月后的试剂进行检测，应符合本标准2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7之规定。
◆许可证号：浙食药监械生产许20090029号 ◆产品注册号： ◆产品标准号: -2009 3.4~21.7μmol/L （参照《全国临床检验操作规程》，建议各实验室建立自己的参考范围） 检验结果的解释 本法的检测范围为0~400μmol/L ，当样品测定值超过上限，应将样品用生理盐水进行稀释，重新测定，结果乘以稀释倍数。 检验结果的局限性 1、当样品中抗坏血酸浓度≥1704μmol/L ，血红蛋白浓度≥4.0g/L ，甘油三酯浓度≥20mmol/L 时对测定结果又干扰。 2、血清中TBIL 的测定只是临床医师对患者进行诊断的指标之一，临床医师还要根据患者的体症、病史以及其他诊断项目、诊断手段进行综合判断。 产品性能指标 1、线性范围：0~400μmol/L （相关系数r ≥0.99） 2、重复性：测量精密度CV ≤4%、批间差≤8% 3、准确度：相对偏差＜10% 注意事项 1、试剂盒样品用量可因仪器要求不同，按比例增减，计算公式不变。 2、本试剂仅供体外诊断用，试剂产生的废液及使用后难以降解的包装材料应集中收集后交当地废物处理站处理。 3、试剂使用后立即盖紧瓶盖，避免污染。 4、不同方法学试剂的质量控制结果之间会存在差异，使用时请确保质控选择与试剂的方法学保持一致。 5、不同批号的试剂不建议混用，如混用应重新校准。 参考文献 1、叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M],3版.南京:东南大学出版社.,2006:452-457. 2、德田邦明，古本和仁：临床化学22（2），116-122（1993）。 总胆红素检测试剂盒说明书 （氧化法） 企业名称：温州市维日康生物科技有限公司 生产地址：温州市瓯海区娄桥工业园园一路 邮政编码：325000 电话：0577- 86585999 86585666 传真：0577- 86581858 网址：https://www.doczj.com/doc/b219114321.html, 邮箱：weirikan@https://www.doczj.com/doc/b219114321.html, 感谢您使用我们的产品，使用前请仔细阅读此说明书
总胆红素测定试剂盒（重氮法） 一、胆红素的代谢 正常人血中胆红素来源有以下几种 （1）大部分来自于衰老RBC破坏后的Hb衍化而成 （2）小部分来自于非Hb的血红素蛋白质的血红素辅基分解，即分路胆红素 （3）极少部分来自于骨髓无效造血所产生的胆红素 胆红素与ALB结合后为肝细胞摄取并转变为水溶性的结合 胆红素，排至胆汁中，结合胆红素在肠道中被细菌作用还原成尿胆原，在肠道被吸收入门静脉，大部分肠肝循环，另一部分入体循环，经肾排泄入尿。 因此，在胆红素代谢的上述途径中有任一环节受阻，均可导致结合或非结合胆红素升高而产生黄疸。 二、胆红素测定的意义 测定胆红素有助于鉴别溶血性黄疸，肝细胞性黄疸及梗阻性黄疸 联合其它检测项目还可鉴别肝内淤胆和肝外梗阻性黄疸 溶血性黄疸肝细胞性黄疸梗阻性黄疸 血浆总胆红素（mg/dl）＜5 1-70 不完全梗阻10~15，完全梗阻20~30
未结合胆红素高度增加增加增加 结合胆红素正常增加高度增加 尿胆素定性阴性阳性强阳性 尿中胆素原增多不定或升高减少或消失 粪中胆素原增多减少减少或消失 三、测定原理 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应产生偶氮胆红素，所以称为直胆，又称1min胆红素测定，非结合胆红素测定时要以咖啡因、苯甲酸钠为加速剂破坏胆红素氢键再与重氮试剂反应，抗坏血酸破坏剩余重氮试剂，加入碱性酒石酸钠使最大吸光度由530nm转到598nm，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度降至可忽略不计，使灵敏度和特异性升高，最后形成的绿色是由兰色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。 试剂：（1）咖啡因（2）碱性酒石酸钠液（3）亚硝酸钠液 （4）对氨基苯磺酸溶液（5）重氮试剂（将3、4混合） （6）5g/L NaN3 （7）胆红素标准液 操作： 总胆管结合管对照管
总胆红素测定试剂盒（重氮盐法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中总胆红素（TBIL）的含量。1、型号规格 试剂Ⅰ（R1）：40ml×4，试剂Ⅱ（R2）：10ml×4； 试剂Ⅰ（R1）：60ml×6，试剂Ⅱ（R2）：15ml×6； 试剂Ⅰ（R1）：80ml×2，试剂Ⅱ（R2）：20ml×2； 试剂Ⅰ（R1）：40ml×4，试剂Ⅱ（R2）：20ml×2； 试剂Ⅰ（R1）：80ml×4，试剂Ⅱ（R2）：20ml×4； 试剂Ⅰ（R1）：100ml×4，试剂Ⅱ（R2）：20ml×2。 2.1 外观 试剂盒外观应整洁，文字符号标识清晰；试剂均为澄清溶液，无未溶解物。2.2装量 用通用量具测量，液体试剂的净含量应不少于标示值。 2.3空白吸光度 用纯化水作样本，在波长A546nm，比色光径1cm,反应温度37℃下，试剂空白吸光度测定值，应≤0.60。 2.4分析灵敏度 测试浓度90μmol/L的总胆红素时，吸光度变化值应≥0.01。 2.5线性 在试剂盒分析范围[1，520]μmol/L内，线性相关系数r应≥0.990。 在试剂盒分析范围[1，100]μmol/L内，线性绝对偏差在±15μmol/L； 在试剂盒分析范围(100，520]μmol/L内，线性相对偏差不超过±15%。
2.6重复性 2.6.1批内重复性 用低、高二个水平的样本检测，检测结果批内变异系数（CV）应不超过10％。 2.6.2批间差 用三个批号的试剂盒测定同一血清样本，试剂盒批间相对极差≤10%。2.7 准确度 用40个在测定浓度范围内不同浓度的临床样本，以利德曼生化股份有限公司生产的总胆红素测定试剂盒作为比对方法，用线性回归方法计算两组结果的相关系数（r）应≥0.990，在试剂盒分析范围[1，100]μmol/L内，线性绝对偏差在±15μmol/L；在试剂盒分析范围(100，520]μmol/L内，线性相对偏差不超过±15%。 2.8 稳定性 试剂在未开瓶状态下，于2℃～8℃可保存12个月。有效后两个月内产品的性能应符合2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7的要求。
目录 1. 检测原理 2. 标本采集与处理 2.1 受检者的准备 2.2 静脉采血 2.3 抗凝剂 2.4 标本处理 3. 试剂 3.1 试剂 3.2 校准血清 3.3 试剂与校准血清的稳定性 4. 仪器 5. 操作 6. 计算 7. 操作性能 7.1 精密度 7.2 准确度 7.3 灵敏度 7.4 可报告范围 7.5 特异性 7.6 干扰 8. 参考值 9. 临床意义 附录A: 参数 1. 检测原理 对氨基苯磺酸+ HCl + NaNO2 --------- 氯化重氮苯磺酸+ NaCl 胆红素+ 氯化重氮苯磺酸-------偶氮胆红素
2. 标本采集与处理 2.1 受检者的准备： 病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。体检对象抽血前应有两周的的正常状况记录。注意有无应用影响测试项目的药物。此外，对于体检者，采血的季节都应做相关记录，因为样本中各项目的含量有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。应嘱体检对象在抽血前24小时内不做剧烈运动。 2.2 静脉采血： 除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。 2.3 抗凝剂： 血浆多主张用EDTANa2（1mg/mL）抗凝。 2.4 标本处理： 血标本室温放置30min～45min后离心分离血清或血浆，在两小时内检测完毕；如两小时内不能检测完毕，将离心分离血清或血浆置洁净试管加盖2-8℃保存。 3．试剂 3.1 试剂： 本科使用湖南永和阳光科技有限责任公司DBIL试剂盒，为液体双试剂，各组分如下： 标准液：64.5umol/L (3.75mg/dL) 3.2 校准血清： 使用湖南永和阳光科技有限责任公司提供的40项校准血清。 校准频次： 空白定标：每日需做试剂空白定标。 全点定标：试剂换批号使用时或质控结果超过规定的2SD范围，需要全点定标。
总胆红素重氮法检测操作规程 产品注册号：国食药监械（准）字2004第3400400号 产品执行标准：YZB/国2221-2003 原理： 总胆红素在二甲亚砜等加速剂作用下，在酸性溶液中与重氮苯磺酸作用生成紫色的偶氮胆红素，与经过同样处理的校准液比较，即可计算出样品中总胆红素的含量。 样品准备： 样品为新鲜空腹无溶血的血清或血浆。样品应在低温条件下运输保存，样品中总胆红素2-8℃密闭避光保存可稳定3天，冰冻保存可稳定3个月。 测定步骤： 1.基本参数： 方法：终点法 波长：560nm 反应温度：37℃ 光径：10mm 反应时间：5min 2.操作： 根据测定所需试剂量，取R1和R2按50：1比例混合，即为工作液。根据以上参数按下表操 计算： 1. 因素法：用本试剂盒操作，测得偶氮胆红素参考摩尔吸光系数为74290（波长=560nm，光径=10mm，样品/试剂=1/15），其相应的F值为215.经严格检定标化的仪器，可按以下公式计算结果： 样品Tbil含量（umol/L）=(Au-AuB)×215 例：Au=0.080 AuB=0.040 则 样品Tbil含量（umol/L）=（0.080-0.040）×215=8.6 2. 比例终点法： 样品Tbil含量（umol/L）=Au-AuB/Ac-AcB×Cc 例：Au=0.040 Ac=1.095 AcB=0.030 Cc=230umol/L则 样品Tbil含量（umol/L）=【（0.090-0.040）÷（1.095-0.030）】×230=10.8 校准及质控： 1.建议使用本公司的胆红素校准血清进行校准。 2.推荐使用本公司的生化质控血清进行室内质控。 性能指标： 1.线性范围：0.4～34 2.0umol/L,r≥0.99
总胆红素（Ｔ－Ｂｉｌ）试剂盒检验方法的讨论目的：考察目前市场上常用总胆红素试剂盒的检验方法。方法：选取5个 厂家生产的试剂盒(均为重氮法)，按其说明书要求分别用带血清空白的终点法或不带血清空白的终点法检测其线性和准确性。结果：各试剂盒线性r＞0.99，准确性在1%～10%波动。结论：使用终点法测定总胆红素试剂盒，应使标准规范化。 标签：总胆红素试剂盒；线性；准确性 人红细胞的寿命一般为120 d，红细胞死亡后变成间接胆红素（I-Bil），经肝脏转化为直接胆红素（D-Bil），组成胆汁，排入胆道，最后经大便排出。间接胆红素与直接胆红素之和就是总胆红素（T-Bil）。上述的任何一个环节出现障碍，均可使人发生溶血性黄疸、肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸。肝炎患者的黄疸一般为肝细胞性黄疸，也就是说直接胆红素与间接胆红素均升高，而淤胆型肝炎的患者以直接胆红素升高为主。总胆红素的正常值为1.71～17.1 μmol/L(1～10 mg/L)，直接胆红素的正常值为1.71～7 μmol/L(1～4 mg/L)。因此，临床上对于用测定血清总胆红素来鉴别黄疸有较大意义，它对肝脏疾病诊断、治疗和愈后判断有重要价值。我们对总胆红素试剂盒中试剂的线性和准确性进行研究，不仅可以有效的节约原材料、降低生产成本、规范行业，对临床检验的准确性，也大有帮助。 1 仪器与试药 半自动生化分析仪（SECOMAM公司生产，型号：BASIC）；总胆红素测定试剂盒（选用五个厂家生产的，编号依次为1～5号，在这5个厂家生产的试剂盒中，只有两个试剂盒即1号试剂盒和2号试剂盒中自带标准品，其浓度分别为171 μmol/L和20 μmol/L）；总胆红素标准液（中生北控生物科技股份有限公司，批号：070032，浓度：280 μmol/L）；多项液体生化质控血清（四川省迈克科技责任有限公司，批号：0807041，浓度：24.8 μmol/L）。 2 方法 2.1 实验原理 重氮法：总胆红素在二甲亚砜等加速剂作用下，在酸性溶液中与重氮苯磺酸作用生成紫色的偶氮胆红素，与经过同样处理的标准液比较，即可计算出样品中胆红素的含量。 2.2 试验方法 2.2.1 线性关系取总胆红素（T-Bil）高浓度样本，通过采用样品量加倍模式（高值血清低于线性范围上限时）或用生理盐水稀释成一系列浓度，最高浓度应大于或等于标准规定线性范围上限值（5个试剂盒的加样量及加样方法详见表1~
总胆红素应用重氮法和钒酸盐氧化法测定的对比 摘要】目的：分析总胆红素应用重氮法和钒酸盐氧化法的测定差异情况。方法：选择两类具有代表性的试剂,首先检测其基本性能，其次检测四十五份血清样品(所有样品的浓度均匀分布)，将检测结果进行对比。结果：就选取的试剂来看， 均具有良好的精密度，各检测项目的方差齐，配对t检验DBIL(直接胆红素)结果P ＜0.05；TBIL(总胆红素)结果P＞0.05；根据方法学来比较的相对系统误差（%SE）, DBIL(直接胆红素) X1=8.81%，DBIL(直接胆红素)X2=5.69%； TBIL(总胆红素) X1=8.28%，TBIL(总胆红素)X2=1.16%。结论：对比以上两种测定方式，其结果间并没有具备良好的一致性，钒酸盐氧化法的测定结果略低于重氮法的测定结果，但 是二者的系统误差均在临床可接受范围内。 【关键词】总胆红素；重氮法；钒酸盐氧化法；测定差异 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）35-0360-02 胆红素属于一类对人体有害的毒素[1]，在一般情况下人们希望胆红素的浓度 越低越好，有资料显示，当人体内出现一定的胆红素时，它可以帮助人体抵抗氧化，减少氧化损伤、抑制蛋白和脂类过氧化、并有效清除自由基。胆红素由于在 人体内存在保护与伤害的双层作用以及一些疾病与胆红素的存在有着密切关系等 因素，导致当前临床医学对胆红素测定法较为关注。近几年来，无论是国内还是 国外都在研究如何将胆红素准确测定出来的方法以，并研究了一些方法，如色谱法、重氮法、化学氧化法、钒酸盐氧化法等，而钒酸盐氧化法与重氮法这两种方 法使用得最为广泛。 1.材料与方法 1.1 一般材料 试验中所采用的仪器为生化分析仪（上海科华ZY-1280），而选用的钒酸盐 氧化法胆红素试剂及重氮法胆红素试都上海科华生物公司提供[2]，检测样本主要 来自我院住院以及门诊的患者，所提供的样品为血清样品。 1.2 方法 本次检测胆红素主要采用钒酸盐氧法和重氮法，方法如下： 钒酸盐氧法：采用上海科华生物公司生产的胆红素检测试剂，根据配备的校 准品进行校对，评估试剂的基本性能，然后对样品进行检测，样品分别测试两次，算出两次测试结果的平均数。方法原理：当Ph值为3时，钒酸会将胆绿素从血 清胆红素中氧化出来，这时，特有的花色便从胆红素中脱离减少[3]，因此，在加 入钒酸前后450nm处，其吸光度的下降与样品血清胆红素以正比的形式呈现而出。 重氮法：采用上海科华生物公司生产的胆红素检测试剂，方法与钒酸盐氧法 一样与产品配备的校准品来校对，再对试剂的基本性能进行评估，检测所选样品，同时，在测试样品时重复进行两次，选取平均值。方法原理：在Ph值处于1～2 之间时，重氮离子与胆红素出现耦联状态[4]，此时将会出来一些有一定色彩的偶 氮化合物，胆红素浓度与重氮胆红素显色的强度是以正比形势呈现而出的，光电 比色测定。 1.3 统计学方法 统计其数据，可采用统计学软件SPSS19.0对数据进行处理，两组数据间的数 据差用χ2检验。P＞0.05表明对比结果差异不明显，无统计学意义，P＜0.05表 明对比差异明显，有统计学意义。
总胆红素（重氮盐法）标准化操作程序文件 单位： 科室：检验科生化室 文件编号： 版本： 批准施日期： 有校期：一年 复审计划：每年复审，测定系统变化时需进行修订 发放部门：检验科生化室 编写者： 审批者： 保管者： 修订者
总胆红素（重氮盐法） 1:概述 血清中的［胆红素大部分来源于衰老红细胞被破坏后产生出来的血红蛋白衍化而成，在肝内经过葡萄糖醛酸化的叫做直接胆红素，未在肝内经过葡萄糖醛酸化的叫做间接胆红素，二者的和就是总胆红素。 2标本的收集 新鲜无溶血标本，血清或血浆样本均不溶血。血浆样本只能采用肝素或EDTA抗凝。样本在4摄氏度可稳定7天。采血前病人应禁食12小时，采集静脉3ml,待凝固后（最好放在37摄氏度水浴箱内45分钟）通常为加抗凝剂的血液在30-60分钟凝血析出血清。30r/min离心5-10分钟，分离出血清备用。不建议采用血浆标本。3：方法原理 本试剂采用表面活性剂作为增溶剂，样品中结合胆红素和经增溶的未结合胆红素与重氮对氨基苯磺酸反应，生成酸性偶氮胆红素，其在570nm处吸收值的增加与样品中胆红素的浓度成正比，通过测定570nm处吸光度值的变化，即可计算出样品中总胆红素的浓度。 4剂来源，配置及储存 试剂来源：迪瑞 试剂配置：。试剂一和试剂二按1:1的比例。即10ml试剂一加0.1ml试剂二，混合后即成工作液 试剂储存：试剂避光储存2-8摄氏度可稳定至标签所示失效期。 5分析仪器 CS-6B全自动生化分析仪 分析参数：样品量25 u/l试剂量：250 u/l 测光点0-41测定模式：1点终点法正反应 分析波长：570nm/660nm（主波长/副波长） 6计算方法 总胆红素浓度（vmol/D =样本管吸光度x校准液浓度（mol/D 校正管吸光度 7线性范围：本实验的线性范围：0---遇mol/L 8 参考范围成人1.7 21 N mol/L 新生儿20 2 N mol/L 9失控控理 1：立即重测同一质控品，如重测后结果仍不再允许范围，请进行下一步。 2：新开一瓶质控品，重测失控项目，如新开的质控血清结果正常，那么原来质控血清可能过期或在室温防止时间过长而变质，如结果仍不再允许范围，则进行下一步。 3：进行仪器维护，重测失控项目。检查仪器状态，查明光源是否更换，比色杯是否需要清洗或更换？对仪器进行清洗等维护。另外还要检查试剂，此时可更换试剂已查明原因。如果结果仍不再允许范围内，则进行下一步。 4：重新校准。重测失控项目。用新的校准液校准仪器，排除校准液的原因。
血清总胆红素和直接（结合）胆红素测定 目前测定血清胆红素的方法主要有重氮试剂法（包括改良J-G法、二甲亚砜法、二氯苯重氮盐法和2，5二氯苯重氮四氟硼酸盐法等）、胆红素氧化酶法、钒酸盐氧化法、高效液相色谱法、导数分光光度法、经皮胆红素测定法以及直接分光光度法等。 改良咖啡因（J-G）法： 一、实验原理 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成紫色的偶氮胆红素；在同样条件下，未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。咖啡因、苯甲酸钠作为加速剂，醋酸钠缓冲液可维持反应的PH值同时兼有加速作用。叠氮钠破坏剩余重氮试剂，终止结合胆红素测定管的偶氮反应。最后加入碱性酒石酸钠，在碱性条件下，紫色偶氮胆红素转变为蓝色偶氮胆红素，使最大吸光度由530nm转移到598nm，此时，非胆红素的黄色色素及其它红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加。最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。 二、实验方法 （一）器材 试管，刻度吸管，分光光度计，37℃水浴箱。 （二）试剂 1．咖啡因-苯甲酸钠试剂无水醋酸钠41g，苯甲酸钠37.5g，乙二胺四乙酸二钠EDTANa2 0.5g，溶于约500mL 的蒸馏水中，再加入咖啡因25g，搅拌至完全溶解(不可加热)，然后加蒸馏水稀释至1000mL，混匀，过滤后放置棕色试剂瓶中，室温保存可稳定6个月。 2. 5g/L 亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠5.0g，加蒸馏水溶解并稀释至100mL，若发现溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。 3. 5g/L 对氨基苯磺酸溶液：对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H20）5.0g，加于约800mL 蒸馏水中，加浓盐酸15mL，待完全溶解后，加蒸馏水至1000mL。 4. 重氮试剂临用前，取5g/L 亚硝酸钠溶液（试剂2）0.5mL 与5g/L 对氨基苯磺酸溶液（试剂3）20mL 混合。 5. 5g/L 叠氮钠溶液：叠氮钠0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100mL。 6. 碱性酒石酸钠溶液：氢氧化钠75g，酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O)263g，加蒸馏水溶解并稀释至1000mL，混匀，置塑料瓶中，室温保存可稳定6个月。 7.胆红素标准液可购买，也可按以下方法配制： （1）稀释血清：收集不溶血、无黄疽、清晰的血清过滤作为混合血清稀释剂。取过滤血清1.0ml，加生理盐水24ml，混匀。在分光光度计中，以比色杯光径1cm，波长414nm，用生理盐水调零，读取的吸光度应小于0.100，波长460nm 处读取的吸光度应小于0.040。（2）171umol/L胆红素标准液：称取符合标准的胆红素（MW:584.68）10mg，加入二甲基亚砜1ml，玻棒搅匀，加入0.05mol/LNa2CO3溶液2ml，使胆红素完全溶解。移入100ml 容量瓶，用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/LHCl溶液2ml（边加边缓慢摇动，切勿产生气泡），最后用稀释血清稀释至100ml。避光，4℃保存，三天内有效，最好当天绘制标准曲线。 （三）步骤 1. 取试管3支，标明总胆红素管、结合胆红素管和空白管，然后按下表操作： 试剂(ml) 总胆红素管结合胆红素管空白管 血清0.2 0.2 0.2
胆红素试剂的探讨 发布时间02年11月08日14时11分 四川迈克科技有限责任公司赵瑜周方银 胆红素测定是临床上常用的检测项目，作为肝功能诊断的重要指标，对临床胆红素分析的质量控制值得我们重视。但直到今天，国内总/直接胆红素测定的标准化依然是临床化学分析的一道难题，尤其是直接胆红素分析。分析原因除了目前国内尚缺乏合格的商品参考物或校准品外，还有一个重要的因素就是试剂。不同方法学的试剂其准确度、精密度、测定线性范围、稳定性及抗干扰性等直接决定了临床结果的可靠性。 目前胆红素测定方法根据类型可分为高效液相色谱法（HPLC）、导数分光光度法、直接分光光度计法、经皮胆红素测定法（TCB）、重氮法、氧化法等。临床常用商品试剂为重氮法及氧化法。重氮法包括改良J-G法、二甲亚砜法（DMSO法）、二氯苯重氮盐法（DPD法）、2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法（2，5DCB-4FB法）、改良2，5DCB-4FB法等；氧化法包括氧化酶法、化学氧化法，其中化学氧化法又有钒酸盐氧化法、亚硝酸盐氧化法、过硫酸盐氧化法、综合氧化剂法、复合有机包结氧化法等之分。 HPLC法可从样品中同时分离出胆红素各组分，包括非结合胆红素（Bu）、胆红素单葡萄醛酸酯（mBc）、胆红素双葡萄醛酸酯（dBc）、δ胆红素（Bδ）、以及光照射后产生的光胆红素，并加以准确定量，该法灵敏度高、特异性强，是目前胆红素测定的最可靠方法。但该法仪器昂贵，技术要求高，在梯度浓度有机溶剂中各组分吸光系数的波动等问题也有待解决。导数分光光度法可消除血红蛋白、β-胡萝卜素的干扰，但该法不能测定Bc（结合胆红素或直接胆红素），样品和标准需预稀释，不适合临床大批量样品自动化分析。 直接分光光度计法是专用于新生儿血清总胆红素测定，采用双波长比色避免溶血干扰，方法简单，不需要样品空白，但该法不适合自动化大批量分析。 经皮胆红素测定方法（TCB）具有操作简单、非损伤性等优点，特别适用于婴幼儿及新生儿黄疸筛查，但该法影响因素多，不能完全代替血清总胆红素测定。 在各种重氮试剂法中，改良J-G法为推荐方法，其灵敏度、准确度和特异性均较高，但显色时间相对较长；测定直接胆红素时需要严格控制时间（1分钟），用手工或半自动分析仪操作相对误差较大是其不足，在一些自动分析仪上使用也不方便。目前J-G法国内外均有不少商品试剂盒，但所接触的商品试剂盒稳定性尚存在一些问题，血红蛋白＞3.5g/L时，干扰较明显，对严重脂血抗干扰性也较差。 DMSO法的最大优点为反应时间短，呈色后稳定性极佳（可稳定近2小时）、对脂血抗干扰
钒酸氧化法和重氮法检测胆红素的方法学评价目的:寻找一种精密、准确、使用方便且特异的检测血清总(直接)胆红素的 方法。方法:对钒酸氧化法和重氮法进行方法学评价,包括精密度、线性范围、准确度、方法比较和干扰因素。结果:两种方法检测总(直接)胆红素的精密度和准确度均符合要求,两种方法检测结果有良好的相关性(TBIL:r=0.997,DBIL:r=0.987,均符合r≥0.975)同时有极显著性差异(P＜0.01),钒酸氧化法检测直接胆红素的线性范围略窄于重氮法,但是它的精密度和准确度略优于重氮法,而且抗血红蛋白和三酰甘油干扰的能力明显强于重氮法。结论:钒酸氧化法是一种精密、准确使用方便且特异的、值得推广的、适用于血清总胆红素和直接胆红素日常测定的方法。 标签：钒酸氧化法;重氮法;胆红素;方法学评价 血清胆红素作为肝胆疾患等诊断的重要指标已广泛应用于临床[1-3],但长期以来,标本溶血对测定的干扰影响一直未能得到很好解决[4]。目前,测定血清总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL)的方法包括重氮试剂法(如改良J-G法和M-E法等),胆红素氧化酶法和化学氧化法(如钒酸氧化法)。重氮试剂法存在反应不专一、易受溶血和脂血干扰的弊端,使检测结果出现偏差,有时甚至出现直接胆红素高于总胆红素的错误结果,而且这种方法存在工作液不够稳定的缺点[5]。胆红素氧化酶法由于酶试剂成本昂贵,需要有高效热稳定的酶及其促进剂﹑抑制剂,影响了其在实际工作中的应用[6]。1993年日本学者Tokuda[7]建立了钒酸氧化法测定血清胆红素。建立一个新的分析方法,或引进新的方法、试剂和仪器,都应对它们的技术性能如精密度、方法比较、线性范围,以及干扰等作出评价[8]。为了寻找一种精密、准确、使用方便且特异的检测血清总(直接)胆红素的方法,本文对钒酸氧化法和重氮法进行了方法学评价,现总结如下: 1 材料与方法 1.1 仪器 日本日立公司HITACHI 7060型全自动生化分析仪,日本东亚公司Sysmex KX-21型全自动血细胞分析仪。 1.2 试剂盒 1.2.1钒酸氧化法试剂:由北京中生北控生物科技股份有限公司提供液体双试剂,直接上机使用。 1.2.2 重氮法试剂(选用酒精为加速剂):由波音特生物科技(南京)有限公司提供双试剂,临用前配成单试剂使用。 1.3 胆红素标准品