腺相关病毒包装操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Gal actopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介13.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第二章应用重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5血清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠乙二胺四/二硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸乙酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化乙锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎牛血清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白小时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野生型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达shRNA或目的蛋白。

腺病毒是一种线性双链DNA病毒，由于其具有宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度制备、外源基因装载容量大等优点，重组腺病毒已越来越广泛地被应用于基础研究和临床试验中，并成为世界上最常用的基因治疗载体之一。

服务内容
重组腺病毒质粒的构建；重组腺病毒包装制备；制备重组腺病毒。

客户提供
所需包装的目的基因信息或者序列
我们提供
含有目的基因的重组腺病毒质粒；重组腺病毒液；详细完整的实验报告。

如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。

质粒产品说明书项目信息运输保存条件常温运输。

由于运输中温度无法控制，请客户收到菌液和质粒后首先检查样品，操作如下：1.菌液生长充分，如果不马上使用，请直接放在-80℃保存备用；2.菌液生长不充分，请先将菌液在37℃摇床活化，然后将菌液在固体培养基中划线、挑单克隆并保种备用；3.如果菌液生长充分，菌液可暂时放在4℃，但不要超过一周4.质粒请放在-20℃保存备用，可直接用于测序或质粒转化。

产品使用说明将甘油菌在新鲜配制的固体培养基（相应抗性）中划线，37℃培养箱培养过夜，挑取3个单克隆，分别接种于相应抗性的液体培养基中，37℃摇床培养过夜，然后进行质粒的提取和验证。

若划线未长，可尝试将200ul菌液接种于带相应抗性的2ml新鲜培养基中进行培养，待菌液生长充分后进行划线挑取单克隆，或直接用质粒进行转化。

产品质粒浓度在100-200ng/ul之间，若需要更精准的质粒浓度，请务必验证。

考虑到实验的严谨性，建议客户拿到产品后务必测序验证。

订购须知ViGene Biosciences的产品仅限用于研究，不可用于包括人类体外诊断和治疗在内的其他用途。

ViGene Biosciences的产品，不得修改和转售给任何第三方，未经ViGene Biosciences的书面批准，不得将产品用于向其他第三方提供服务或用于制造商品化产品。

ViGene Biosciences的全长cDNA克隆来自人类cDNA。

我们70％的克隆与RefSeq和GenBank 数据库中序列完全一致，部分cDNA克隆序列中含有SNPs，可能与RefSeq数据库的序列存在一个或多个核苷酸的差异。

建议购买者在购买前仔细核对克隆序列。

根据GenBank 2013数据库的序列信息，产品中每个克隆包含一个完整的开放阅读框（ORF），随着RefSeq序列的不断变化，GenBank的数据也在不断更新。

我们的全部克隆均已通过NestGen sequencing二代全长测序验证，并与我们网站上提供的序列完全一致。

腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。

第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。

第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。

2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。

局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。

注：此方法适用于临床。

(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。

特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。

miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。

MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。

MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。

MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。

MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。

ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。

microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。

腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。

首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。

第二，病毒滴度高。

第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。

第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。

ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。

E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。

由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。

pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。

microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。

为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。

腺病毒包装的原理和具体步骤及方法
腺病毒包装
1 特点：
1.1 几乎可以感染所有类型的细胞。

1.2 可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒。

1.3 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效地进行增殖。

1.4 腺病毒载体感染宿主的范围比较广。

1.5 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。

2原理：
腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

3 腺病毒包装简要流程
3.1 含有目的基因的腺病毒穿梭载体的构建和质粒纯化提取。

注：客户也可以提供构建好的重组腺病毒穿梭载体。

3.2 穿梭载体与腺病毒骨架质粒重组及鉴定。

3.3 重组腺病毒质粒的酶切线性化。

3.3 线性化的重组腺病毒质粒转染包装细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。

3.4 腺病毒扩增并纯化。

3.5 分装，- 80 oC保存。

3.6 滴度测定及无菌检测。

细胞中大量扩增腺病毒293在细胞中进行大量扩增。

本手册提供了递增培养规模和腺一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293由于一个细胞中按这一方法最终得到的病毒量约为病毒感染周期的基本方法，3×1011～3×1012。

病毒颗粒。

如果要把病毒用所含的病毒颗粒为1000～10000，因此10125×1L 培养细胞可得到约的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。

对于蛋白表达，则氯化铯梯度离心纯化，则必须至少×1083根据蛋根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(。

为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)步。

如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。

注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。

每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

操作步骤：细胞。

51 在100 培养皿或752培养瓶中加入10 5%培养×106293。

取2 0.5 首次扩增的病毒保存液，加入5%至1，混匀，这样稀释得到的5值约为孵箱中培3 3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动次，37℃2分钟。

养90。

4 加入9 5%测定以估计病毒个病毒颗粒，进行××这时在5 再培养72 小时，10 溶液中大约有5109～51010颗粒。

分钟沉离心5 600注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。

收集细胞，×g-200C /370C 1)病毒保存溶液重悬细胞。

即一般为原始体积的去上清后加入最小体积淀细胞，(1/10次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。

3 冻融次。

/37℃℃冻融3 1 -20℃。

-20 ℃或-80 转入215 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于细胞进行培养。

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则54.2.2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板64.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心175.7.2 连续密度梯度离心175.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法205.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。

Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。

重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。

GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。

人腺相关病毒(AAV)elisa试剂盒使用说明书Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置标准品稀释液：1.5ml×1瓶酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96）【人腺相关病毒(AAV) elisa试剂盒】本试剂仅供研究使用计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒组成：封板膜:2片（48）/2片（96）说明书:1份密封袋:1个标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人腺相关病毒(AA V) 水平。

用纯化的人腺相关病毒(AA V) 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入腺相关病毒(AA V) ，再与HRP标记的腺相关病毒(AA V) 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的腺相关病毒(AA V) 呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人腺相关病毒(AA V) 浓度。

腺相关病毒包装（AAV）介绍
腺相关病毒(AAV)是最初发现的作为腺病毒载体污染物的小型病毒。

利用AAV进行研究的一个主要优势是它的复制能力有限，并且通常不会导致人类疾病。

由于这些原因，AAV通常被包含在较低的生物安全水平，并引发相对较低的免疫效应在活生物体内。

虽然AAV可以在BSL-1处理，但表达癌基因或毒素的AAV应该在BSL-2处理。

AAV能够以低免疫应答和低毒性转导分裂和非分裂细胞。

尽管重组AAV不能整合到宿主基因组中，转基因的表达可以是长期的。

AAV 的效用目前受到其小包装容量的限制(包括ITRs在内为4.5 kb)，尽管人们对扩大这一容量有很大的兴趣和努力。

传统上，AAV要求存在另一种“辅助”病毒，如腺病毒或疱疹病毒，以便繁殖。

这是由于AAV依赖于某些介导AAV复制的外源基因产物。

这一要求已经被“无辅助病毒系统”所回避，该系统能够在不使用辅助病毒的情况下产生传染性AAV粒子。

相反，在AAV生产期间，特定的基因产物可以由辅助质粒(例如，pHelper)和特定的包装细胞系(例如，HEK293细胞)提供。

AAV质粒系统概述。

广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，公司网址：有需要请联系丘先生病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒( Lentivirus )是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

1.1.2 特点1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4) 无需任何转染试剂，操作简便。

5) 可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3 慢病毒包装简要流程：1) 含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

1) 2) 3) 4) 5)2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T 等。

3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

4) 病毒的纯化和浓缩。

5) 分装、-80 C 保存。

6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

1.2、 腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。