溶菌酶综述
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1. 溶菌酶简介溶菌酶,又称细胞壁水解酶,广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。
1922年Fleming等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶。
它能够水解N一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁酸之间的β一1,4糖苷键,因此可以溶解大多数革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用,溶菌酶本身是一种蛋白质,安全性能高,在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。
2. 溶菌酶的理化性质(可要可不要)溶菌酶是一种糖苷水解酶,是由129个氨基酸残基组成的小分子碱性球蛋白,相对分子质量为14 300,分子中富含碱性氨基酸和芳香族氨基酸,其多肽链经盘绕折叠形成二级和三级结构,形成一个椭圆形的外形结构,溶菌酶纯品为白色粉末结晶,无臭、甜味,易溶于水和低浓度的盐溶液,不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。
正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45--50℃,最适pH为5~7,在低温干燥条件下可长期保存,热稳定性强,耐酸性强,pH为4—7时,100℃下处理45 min仍能保持其酶活性,但在碱性条件下化学性质不稳定,易变性。
3. 溶菌酶的作用1.抗菌消炎2.抗病毒:溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用。
与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。
3.增强免疫力:溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一,参与机体多种免疫反应,在机体正常防御功能和非特异免疫中,具有保持机体生理平衡的重要作用。
4.其它方面的药理作用:溶菌酶还具有激活血小板的功能。
可以改善组织局部血液循环障碍,分泌脓液,增强局部防卫功能,从而体现其止血、消肿等作用。
它还可以作为一种宿主抵抗因子,对组织局部起保护作用。
5.促进双歧乳酸杆菌增殖:溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖,促进婴儿消化吸收,可以促进人工喂养婴儿肠道细菌的正常化。
4.溶菌酶的应用在乳制品中的应用:人乳中溶菌酶的含量是牛乳的3000倍,溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白。
溶菌酶的作用
溶菌酶是一种具有溶菌活性的酶类,主要作用是溶解细菌细胞壁。
溶菌酶能够针对某些细菌的细胞壁进行特异性作用,使细菌细胞壁发生溶解和裂解,最终导致细菌死亡。
溶菌酶的作用机制主要是通过降解细菌细胞壁的关键组分——肽聚糖(peptidoglycan),即细菌细胞壁的主要构成成分。
溶
菌酶能够切割细菌细胞壁上的肽聚糖链,使其断裂,然后通过肽链的剪切和水解作用,使肽聚糖链上的化学键断裂,导致肽链的解结和肽聚糖的降解。
在溶菌酶的降解作用下,细菌细胞壁失去了支撑作用,细菌内外压力差异失衡,导致细菌细胞壁的断裂和细菌细胞膜的塌陷。
细菌细胞膜的塌陷会导致细菌细胞内外物质的交换失去正常调控,最终导致细菌细胞的溶解和死亡。
溶菌酶作为免疫系统中的一种重要防御分子,在人体免疫反应中发挥着重要的作用。
它可以通过特异性地识别和作用于细菌细胞壁,而不会对周围的人体细胞产生损伤。
同时,溶菌酶也是细菌感染治疗中的重要药物,可以用来治疗一些细菌感染性疾病,如肺炎、葡萄球菌感染等。
总之,溶菌酶通过针对细菌细胞壁的特异性降解作用,对细菌细胞壁进行溶解和裂解,最终导致细菌死亡。
它在免疫系统中发挥着重要的防御作用,并且可以用于治疗某些细菌感染性疾病。
溶菌酶的种类及其应用溶菌酶是一类能够降解细菌细胞壁的酶,它主要作用于细菌细胞壁上的胆甙酸和穿梭肽链,从而导致细菌细胞壁的破裂和细菌的死亡。
溶菌酶存在于许多生物中,包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、昆虫和微生物等。
溶菌酶被广泛应用于医药、食品、农业和环境等领域。
1. 甲氧西林酶 (lysostaphin)甲氧西林酶是一种由金黄色葡萄球菌产生的溶菌酶,主要作用于革兰阳性细菌的细胞壁。
甲氧西林酶具有很高的特异性,可以高效地杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,对于治疗金黄色葡萄球菌相关感染具有重要意义。
2. 心脏溶菌酶 (lysozyme)心脏溶菌酶是一种常见的溶菌酶,存在于多种生物中,包括人类、鸡、蛋白和昆虫等。
心脏溶菌酶主要对细菌细胞壁的N-乙酰葡萄糖胺聚糖链起到溶解作用。
它具有广谱的抗菌活性,对于控制和预防细菌感染具有重要意义。
3. 乳酸菌溶菌酶 (lactic acid bacteria bacteriocin)乳酸菌溶菌酶是一类由乳酸菌产生的溶菌酶,主要作用于肠道中的细菌。
乳酸菌溶菌酶对于调节肠道菌群平衡、维持肠道健康具有重要作用。
此外,乳酸菌溶菌酶还具有抗菌活性,可以用于食品工业中的食品防腐和保鲜。
4. 枯草杆菌普查酶 (Bacillus gastrointestinal enzyme)枯草杆菌普查酶是一种由枯草杆菌产生的溶菌酶,具有广谱的抗菌活性。
枯草杆菌普查酶对于治疗和预防呼吸道和消化系统感染具有重要意义。
此外,枯草杆菌普查酶还可应用于食品工业中,用于防治食品中的致病菌。
溶菌酶的应用:1.医药领域:溶菌酶可以用于制备抗菌药物,例如利用溶菌酶破坏细菌细胞壁,从而导致细菌死亡。
此外,溶菌酶还有助于治疗耐药菌感染,如利用甲氧西林酶治疗金黄色葡萄球菌感染。
2.食品工业:溶菌酶可以用于食品防腐和保鲜。
例如,乳酸菌溶菌酶可以用于发酵食品的防腐,从而延长其保质期。
此外,溶菌酶还可以用于优化食品的风味和口感,提高食品的品质。
溶菌酶的功能主治1. 概述溶菌酶是一种可以溶解细菌细胞壁的酶,它在生物体内起着重要的保护作用。
本文将介绍溶菌酶的功能主治,包括溶菌酶的作用机制、主要途径、应用领域以及注意事项。
2. 溶菌酶的作用机制溶菌酶主要通过以下两种机制发挥作用: - 溶解细菌细胞壁:溶菌酶通过酶解作用,将细菌细胞壁中的多肽聚糖连接断裂,导致菌体的溶解和破坏。
- 促进溶菌酶释放:溶菌酶可以刺激宿主细胞产生和释放更多的溶菌酶,从而增强免疫系统对细菌的防御能力。
3. 溶菌酶的主要途径溶菌酶的主要途径包括以下几种: - 自然分泌:某些细菌可通过主动分泌将溶菌酶释放到周围环境中,以攻击潜在竞争者。
- 细菌感染:当细菌感染宿主时,机体会产生溶菌酶来对抗细菌入侵。
- 化学合成:人工合成的溶菌酶也可以应用于治疗感染性疾病。
4. 溶菌酶的主要功能溶菌酶具有以下主要功能: - 抗菌作用:溶菌酶可溶解细菌细胞壁,破坏细菌结构,从而抑制细菌生长和繁殖。
- 免疫调节:溶菌酶可以增强机体的免疫力,促进免疫细胞活性,提高抗菌能力。
- 抗炎作用:溶菌酶具有一定的抗炎效果,可减轻炎症反应,促进伤口愈合。
5. 溶菌酶的应用领域溶菌酶在医学领域有广泛的应用,包括以下几个方面: - 感染性疾病治疗:溶菌酶可以用于治疗细菌引起的感染性疾病,如肺炎、乳腺炎等。
- 食品工业:溶菌酶可用于食品工业中的细菌检测和控制,确保食品质量和安全。
- 生物工程:溶菌酶可以应用于生物工程领域,用于基因组研究、DNA提取等。
- 医药研发:溶菌酶在药物研发过程中可以用于筛选和测试抗菌药物。
6. 注意事项在使用溶菌酶时需要注意以下事项:- 剂量控制:使用溶菌酶时需要控制剂量,避免过量使用产生不良反应。
- 药物相互作用:溶菌酶可能与其他药物发生相互作用,导致药物疗效降低或产生不良反应,应避免与其他药物同时使用。
- 过敏反应:部分患者可能对溶菌酶过敏,使用时需密切观察患者的体征和症状,如有不适应立即停用并咨询医生。
溶菌酶结构溶菌酶是一类广泛存在于细菌、真菌和病毒中的酶类物质,其作用是破坏细菌细胞壁,导致细菌溶解死亡。
溶菌酶的结构与功能一直是科学家们关注的焦点之一。
本文将从溶菌酶的结构特点、作用机制以及应用领域等方面进行介绍。
一、溶菌酶的结构特点溶菌酶属于酶的一种,其结构主要由氨基酸组成。
一般而言,溶菌酶的分子量较小,通常在10-20千道尔顿之间。
溶菌酶分子主要由一个或多个结构域组成,其中最常见的是催化结构域和结合结构域。
催化结构域负责溶菌酶对细菌细胞壁的降解作用,而结合结构域则负责与细菌表面的配体结合,从而实现定位和识别的功能。
二、溶菌酶的作用机制溶菌酶的作用机制主要涉及其与细菌细胞壁的相互作用。
细菌细胞壁主要由多糖和肽聚糖组成,而溶菌酶能够特异性地降解这些成分。
具体而言,溶菌酶作用于细菌细胞壁的聚糖链,通过切断β-1,4-糖苷键导致细胞壁的断裂,进而引起细菌细胞的溶解。
三、溶菌酶的应用领域由于溶菌酶具有高度特异性和高效性的特点,因此在医学和食品工业等领域具有广泛的应用前景。
在医学领域,溶菌酶可用于治疗细菌感染性疾病,如肺炎、骨髓炎等。
此外,溶菌酶还可以用于检测和鉴定细菌的种类和数量,对于临床诊断和疾病预防具有重要意义。
在食品工业中,溶菌酶可用于食品中细菌的去除和灭活,从而提高食品的安全性和质量。
总结:溶菌酶作为一类能够破坏细菌细胞壁的酶类物质,具有广泛的应用前景。
其结构特点主要包括催化结构域和结合结构域,作用机制则是通过与细菌细胞壁的特定成分相互作用,导致细胞壁的断裂和细菌的死亡。
溶菌酶在医学和食品工业领域的应用也是十分重要的,可以用于治疗感染性疾病以及提高食品的安全性。
未来,随着对溶菌酶结构和功能的深入研究,相信溶菌酶的应用领域将会更加广泛,为我们的生活带来更多的便利和健康。
溶菌酶的研究进展溶菌酶概述溶菌酶,也称为裂解素,是一种在细菌、真菌、动物和植物中都存在的水解酶。
它们可以降解细胞墙材料,使细胞变为裸露状态。
溶菌酶广泛应用于医学、食品和制药等领域。
溶菌酶的来源溶菌酶存在于多种微生物和真菌中,如链球菌、金黄色葡萄球菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、支原体和放线菌等。
通过培养和发酵技术,可以大规模制备纯净的溶菌酶。
此外,许多动植物也拥有溶菌酶,如人类唾液中的溶菌酶可以消化细菌、口腔扁桃体中的溶菌酶可以抵御病毒和细菌。
植物中的溶菌酶则是一种抗病毒和抗真菌的重要保护因子。
溶菌酶的作用溶菌酶的主要作用是降解细胞壁,使细胞膜完整性受到破坏,导致细胞死亡。
此外,溶菌酶也能辅助免疫反应,促进抗菌作用,调节免疫细胞的活动,增强自身的抵抗力。
在食品和制药领域,溶菌酶可以作为肉制品厌氧菌的灭菌方法,促进乳制品中的凝乳和定型,同时也可用于生产肝素和生物制剂等。
溶菌酶的研究进展溶菌酶研究的重点在于其抗菌作用和免疫调节作用。
近年来,溶菌酶的研究进展主要集中在以下两个方面。
溶菌酶与细菌感染溶菌酶可以降解细菌细胞壁,对于抗菌作用具有重要的意义。
近年来,科学家发现溶菌酶与多种细菌感染相关联,如肺炎球菌感染、链球菌感染等。
溶菌酶的研究有助于了解病原菌与免疫细胞之间的互动机制,为治疗细菌感染提供新的思路。
溶菌酶的免疫调节作用溶菌酶不仅有着明显的抗菌作用,还可以调节免疫细胞的活动,增强自身的抵抗力。
最新研究发现,溶菌酶还具有降低过敏反应和抗肿瘤等作用,将为临床治疗提供新的方向。
,溶菌酶具有广泛的应用价值和研究前景。
通过深入研究溶菌酶的结构、功能和作用机制,可为疾病的治疗和疫苗的研发提供新的思路,并推动溶菌酶在医药和食品等领域的应用。
溶菌酶m基因一、引言溶菌酶(Lysozyme)是一种具有广泛生物活性的酶类,能够水解细菌细胞壁的肽聚糖,从而破坏细菌细胞壁的结构,达到杀菌的目的。
溶菌酶在生物体内发挥着重要的生理功能,如参与免疫调节、抗菌消炎等。
近年来,随着生物技术的不断发展,溶菌酶m基因作为溶菌酶家族的重要成员,受到了广泛关注。
本文将对溶菌酶m基因的研究进展进行综述,并探讨其应用前景。
二、溶菌酶m基因的结构特点溶菌酶m基因位于生物体的染色体上,其编码的蛋白质具有溶菌酶的活性。
溶菌酶m基因的结构特点主要表现在以下几个方面:1. 基因序列:溶菌酶m基因的序列在不同物种之间具有一定的保守性,但也存在种间差异。
这些差异可能导致不同物种溶菌酶m的活性、稳定性等性质有所不同。
2. 基因表达:溶菌酶m基因的表达受到多种因素的调控,如转录因子、表观遗传修饰等。
这些因素共同作用,使溶菌酶m基因在生物体内实现时空特异性的表达。
3. 蛋白质结构:溶菌酶m基因的编码产物——溶菌酶m蛋白质具有特定的三维结构,这是其发挥生物活性的基础。
溶菌酶m蛋白质的结构特点包括活性中心、底物结合位点等,这些结构特点决定了溶菌酶m对底物的选择性和催化效率。
三、溶菌酶m基因的表达调控溶菌酶m基因的表达调控是生物体内复杂调控网络的一部分,涉及多个层面的调控机制。
以下是溶菌酶m基因表达调控的主要方面:1. 转录水平调控:转录因子通过与溶菌酶m基因启动子区域的特定序列结合,调控基因的转录过程。
不同转录因子的作用可能导致溶菌酶m基因在不同组织、不同发育阶段的表达差异。
2. 表观遗传调控:表观遗传修饰如DNA甲基化、组蛋白修饰等,可以影响溶菌酶m基因的转录活性。
这些修饰在生物体发育和环境适应过程中发挥重要作用,使溶菌酶m基因的表达更加灵活和多样。
3. 转录后调控:溶菌酶m基因的转录产物——mRNA在转录后水平受到多种调控,如mRNA剪接、稳定性调控等。
这些调控过程可以影响溶菌酶m蛋白质的合成速度和数量。
溶菌酶解码介绍溶菌酶是一种能够溶解细菌细胞壁的酶类物质。
它能够通过水解作用将细菌细胞壁的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰穆拉敏酸之间的β-(1,4)糖苷键断裂,从而导致细菌细胞壁的破裂和溶解。
溶菌酶因其广泛的应用领域,特别是在食品工业和医药领域中的重要性逐渐被人们所重视。
溶菌酶的分类分类方法一根据其来源和产生方式,溶菌酶可以分为下列几种。
1.细菌源(细菌性溶菌酶):由细菌分泌产生的溶菌酶,例如溶血素、溶葡素等。
2.哺乳动物源(动物性溶菌酶):由哺乳动物产生的溶菌酶,例如人类的溶菌酶。
3.植物源(植物性溶菌酶):由植物产生的溶菌酶,例如棉子病菌溶菌酶。
分类方法二根据其酶学特性和结构特点,溶菌酶可以分为几个亚类。
1.β-(1,4)-N-乙酰葡糖胺酶(T4型溶菌酶):这是最常见的一种亚类,其酶学特性和结构特点较为典型。
2.γ-葡糖苷酶(T7型溶菌酶):这种溶菌酶具有较高的溶菌活性和酶活稳定性,广泛应用于制药和食品工业。
溶菌酶的应用应用领域一溶菌酶在食品工业中具有重要的应用价值。
它可以用于食品的防腐和保鲜,并能够改善食品的质感和口感。
溶菌酶能够分解细菌细胞壁,抑制细菌的生长和繁殖,从而延长食品的保质期。
溶菌酶还可以作为食品添加剂,用于改善食品的纹理和质地。
例如,在面包制作中添加溶菌酶可以提高面包的柔软度和口感;在乳制品加工中添加溶菌酶可以改善奶酪的质地和口感。
应用领域二溶菌酶在医药领域中也有广泛的应用。
它被用于治疗细菌感染性疾病,如咽喉炎、扁桃体炎和肺炎等。
溶菌酶能够通过破坏细菌细胞壁,使细菌暴露在免疫系统的攻击下,从而促进细菌的清除和治愈。
此外,溶菌酶还可以用于制备医药产品。
例如,通过提取人类溶菌酶并进行纯化,可以制备用于治疗呼吸道感染的药物。
溶菌酶解码的意义溶菌酶解码是对溶菌酶基因进行分析和解码的过程。
通过解码溶菌酶基因,可以揭示溶菌酶的遗传特性和结构特点,进一步深入了解溶菌酶的作用机制和功能。
溶菌酶解码的意义在于:1.了解溶菌酶的基因序列和基因结构有助于我们理解其起源和进化。
溶菌酶的种类及其作用机理比较摘要:溶菌酶是一类对细菌细胞壁有水解作用的无毒、无害的蛋白质。
本文简单介绍了溶菌酶的结构、性质、来源及发展,并对各种不同种类的溶菌酶及其作用机理进行了比较综述。
关键词:溶菌酶、作用机理、动物源溶菌酶、植物源溶菌酶、微生物源溶菌酶1 溶菌酶的结构及性质[1]溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)又称胞壁质酶或N一乙酸胞壁质聚糖水解酶。
是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存,其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末,无嗅,味甜,易溶于水。
不溶于丙酮、乙醚[1]。
Phillips等人1965年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构,溶菌酶分子近椭圆形,大小为 4.5n m×3.0nm×3.0nm,其构象复杂ɑ-螺旋仅占25%,在分子的一些区域有伸展着的片层结构,研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用,其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,这是溶菌酶的活性部位。
2 溶菌酶的来源及发展[2]溶菌酶广泛分布于自然界各种生物体中。
它的研究最早起源于Nicolle (1907)发表的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)溶解因子。
1909年Laschtschenko 指出,鸡蛋清的强抑菌作用是由于酶的作用。
1922年,Fleming发现,人的鼻涕、唾液、眼泪等也有强的溶菌活性并将其溶菌作用因子命名为溶菌酶lysozyme)。
从此,便开始了对溶菌酶的研究,并不断有新的进展。
1959-1963年,Salton等人通过大量研究弄清了溶菌酶是一种能够切断N-乙酰壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间β-1,4糖甘键的酶。
1967年,英国菲利普集团发表了对鸡蛋清溶菌酶-作用底物复合体X-射线衍射的研究,介绍了其触媒的结构,成为近代酶化学研究中重大的成果之一。
1960年以后,有关微生物的溶菌酶的研究进展很快,溶菌酶已成为研究细胞壁结构的一种非常有力的工具酶,不仅有助于人们对细胞壁细微结构的认识,而且大大促进了对新的溶菌酶的开发研究。
溶菌酶的知识应用与临床诊断与研究前景 作者:林鹭 地址:广西医科大学 一:摘要:本文主要介绍了溶菌酶的理化性质及分类,分离纯化方法,酶活
力测定方法,还介绍了溶菌酶在食品﹑医药上的应用及其最新研究进展。 二:关键词: 溶菌酶 分离纯化 活力测定 临床应用 研究现状 三:前言: 溶菌酶又称脆壁质酶或N 一乙酰壁质聚糖水解酶,是英国细菌学家弗莱明于1922 年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质,此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质,抗菌、抗病毒、抗肿瘤、无毒性的优点,使得溶菌酶在食品上和医药上都有广泛的应用,在生物技术中, 溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶, 可以说溶菌酶的发现是近代酶化学研究的最大成果之一[2]。这里通过对溶菌酶理化性质、分离纯化方法和应用的介绍,使大家对溶菌酶有更加清晰全面的了解,以便于对溶菌酶更深入地研究和探索。 四: 溶菌酶概述 1.1 溶菌酶分布[3] 溶菌酶名称起源于1922 年,Alexander Fleming 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,就命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的外分泌液中。 1.2 溶菌酶分类[4] 国际酶学委员会根据其底物及作用特点又称其为酰胺酶或粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶,编号E C3.2.1.17,与常见的蛋白酶、淀粉酶一样属水解酶系列。 根据其来源不同一般可将溶菌酶分6 类:C型(chicken)、G型(goose)、无脊椎动物型(invertebrate-type)、噬菌体、细菌和植物来源溶菌酶。不同来源酶的分子量、氨基酸组成及酶特性各有不同,但三维结构显示来源于共同的进化
起源。目前对C型溶菌酶研究较多,它是由129个氨基酸残基组成的一条多肽链,含有4对二硫键,三维结构为较紧密的椭球形,它广泛存在脊椎动物如哺乳动物、鸟、爬行动物及鱼类和无脊椎动物如昆虫、甲壳类中。微生物来源的溶菌酶较多,广义上一般分以下几类:①内-N -乙酰己糖胺酶,与卵白溶菌酶一样,能分解构成细菌细胞壁骨架的聚糖;②酰胺酶,能切断连接聚糖和缩氨酸的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸键;③内肽酶和蛋白酶,能分解细胞壁缩氨聚糖的缩氨酸键;④ β-l,3、β-1,6-葡聚糖酶和甘露糖酶(葡甘露糖酶),能分解酵母菌细胞壁;⑤磷酸甘露糖酶,与β-1,3、β-l ,6-葡聚糖酶、甘露糖酶(葡甘露糖酶) 共同作用,能分解原生质;⑥壳多糖酶,与葡聚糖酶共同作用,能分解霉菌或酵母菌;⑦脱乙酰壳多糖酶,主要分解霉菌中的毛霉菌(Mucor) 和根(Rhizopus )。 1.3 溶菌酶基本理化性质及作用机理 ①溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白,化学性质非常稳定。当pH值为1.2~11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变。在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强;当pH值为4~7100℃处理1 min仍能保持原酶活性;当pH值为3时能耐100℃加热处理45min;在干燥条件下,溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末,无臭,味甜。易溶于水,遭碱易破坏,不溶于丙酮和乙醚[5]。 2 溶菌酶分离纯化 [7] 2.1 材料与方法 2.1.1 原料与试剂 鲜鸡蛋(市售)、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等,以上药品均为分析纯。 2.1.2 主要仪器 分光光度计(7230G型)、搅拌器(200~300rpm)、离心(4000rpm)。 2.1.3 菌种 藤黄微球菌(Micrococcus luteus) 2.1.4 培养基 液体培养基:牛肉膏0.5g,葡萄糖0.1g, 氯化钠0.5g,蛋白胨1g, 溶于1L水中, 分装于三角瓶中,121℃灭菌15min。 固体培养基:牛肉膏5g, 葡萄糖1g, 蛋白胨10g,琼脂20g,置于1L水中,加热溶解, 分装于三角瓶中,121℃灭菌15min。 2.2 工艺流程 溶菌酶分离纯化的工艺流程如下图所示: 2.3 操作步骤 2.3.1 蛋黄与蛋清的分离 取新鲜的鸡蛋,去壳,经分离器后,使蛋清与蛋黄分离。打破蛋壳时应避免蛋黄破散,使两者完全分离。 2.3.2 蛋清的预处理 将分离后的蛋清加入到搅拌器中,200~300rpm下搅拌10min, 再将蛋清搅拌稠度均匀即可,以不引起发泡为宜。最后用2~3层纱布过滤,以除去残余蛋壳和少量蛋黄。 2.3.3 吸附 将过滤后的蛋清冷至5℃后移入搪瓷捅中, 然后在搅拌下加入已处理好的树脂(14%加入),使其悬浮在蛋清中,在0~5℃下,搅拌吸附5h,然后在0~5℃静置20h以上,等分层后,弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗2~3次,以除去杂蛋白,最后晾干树脂,移入一个搪瓷缸中。 2.3.4 酶的洗脱 在上述树脂中加入同体积的0.15mol/L的pH6.5磷酸盐缓冲液,搅拌洗脱20min,过滤洗脱液,除去一部分杂质。再重复洗脱2次。将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液,搅拌洗脱30min,滤出洗脱液,重复洗脱3次,滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。 2.3.5 沉淀 在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32%固体硫酸铵,搅拌使其溶解, 在4℃放置过夜。第2天,用虹吸法取出上清,4000rpm离心10min分离沉淀物。 2.3.6 透析 将沉淀物用蒸馏水全部溶解,然后放入透析袋中,在10℃水中透析过夜,以除去沉淀中的硫酸铵,收集透析液。 2.3.7 盐析 将透析液移入一容器内,用0.1mol/L的NaOH调溶液pH至8.5~9.0, 有白色沉淀时,应立即离心除去沉淀。用2mol/LHCl调pH至3.5,搅拌, 并在0℃放置48h,同上离心收集沉淀物。 2.3.8 成品的干燥 将上述沉淀物加入到丙酮,搅拌,放置2h,收集沉淀,用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末,无臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。 3: 酶活力测定方法[9] 3.1 底物的制备 将微球菌接种于液体培养基扩大培养(28℃,24h),再接种于固体培养基培养( 28℃,48h),用无菌水将菌体洗涤, 4000rpm 离心10min, 弃上清,再洗菌体数次, 最后用少量无菌水制成悬液, 冷冻干燥即得干菌粉。取干菌粉5g,加入少量0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液置于匀浆器或研钵中研磨2min, 倾出并稀释至20~25mL,悬液的光密度OD450在0.5~0.7范围为宜。 3.2 酶液的制备 准确称取干溶菌酶粉5mg,用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成0.05mol/L酶液。 3.3 酶活力测定 将酶液与底物悬液分别置于25℃水浴中保温10~15min, 测底物悬液的OD450 值,作为对照。然后加入酶液0.2mL(约10μg酶蛋白)迅速摇匀。从加酶时开始记时, 每30s测1次OD450值,共测3次。 3.4 酶活力的计算 以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为1个酶活力单位。溶菌酶活力=ΔOD450/(0.001×W)(U/mg) 式中, ΔOD450 为450nm 处每分钟吸光度的变化;W为加入的酶量(mg)。 五:小结与讨论 关于酶的纯化上, 蛋清中溶菌酶的等电点在pH=10.8 左右, 在偏酸性和偏碱性溶液中, 其稳定性都比较好, 蛋清中其他蛋白杂质的等电点约在pH4.6~5.0 左右, 适量酸的添加既不会破坏溶菌酶, 又便于蛋白杂质的沉淀, 使溶菌酶得到分离纯化。对于酶活力的高低, 温度对其影响比较大, 温度低时产品纯度低, 导致酶活力降低; 而温度过高时, 可导致酶蛋白发生不可逆变性, 同样造成酶活力下降。所以温度控制要适当。除此之外, 酶活力还与酶的纯度相关。因此, 可在透折后用超滤工艺使酶液得到浓缩, 从而提高酶的比活力, 同时又可除去大部分蛋白杂质[10]。 六:溶菌酶在医药领域上的应用 溶菌酶可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。氯化溶菌酶医疗效果更广,有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用,因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药. 七: 溶菌酶应用的最新研究进展 7.1 溶菌酶固定化 将溶菌酶固定化在食品包装材料上, 生产出有抗菌功效的食品包装材料, 以达到抗菌保鲜功能。将溶菌酶固定化在HEPA(空气过滤器)上, 作为空调的空气净化系统, 使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时, 先滤集捕捉尘粒和细菌,然后将捕捉到的细菌杀灭[15]。 7.2 生产低聚壳聚糖 用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖, 使其成为能被人体吸收的低分子量具有独特生理活性和功能性质的低聚壳聚糖[16]。 八: 参考文献: [1] 罗晓薇.火焰原子吸收光谱法测定茶叶中的铅铜[J].现代仪器,2004,(03):30-32. [2]GB2757-1981 蒸馏酒及配制酒卫生标准[S]. [3][4] 马立保,程时军,张 伟.溶菌酶应用研究概况[J].新进展,2010(1):26-30. [5] 何金花,刘誉,刘冠杰.溶菌酶在医药中的应用及其研究进展[J].药展,2008(2):02-04. [6] 李鹤,马力,王维香.溶菌酶的研究现状[J].食品研究与开发,食品研究与开发,2008(1)12-14. [7] 史小利,李宗谦,徐淑霞.蛋清溶菌酶提取工艺研究[J].现代农业科技,2008(6)166-168. [8] 林亲录,马美湖.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J].食品科学, 2002,2(23):43-46. [9]刘源岗,邓倩莹, 廖问陶.溶菌酶的活性测定[J].食品科技, 2005(10):71- 73. [10]张灏,赵玉萍,杨严俊.超滤法提取蛋清溶菌酶[J].无锡轻工大学学报,2002,6(21):607-612.