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一、实验目的1. 学习植物抗冻蛋白的提取方法。
2. 探究不同植物中抗冻蛋白的活性差异。
3. 了解抗冻蛋白在低温胁迫下的保护作用。
二、实验材料1. 植物材料：冬黑麦、胡萝卜、女贞叶、黑麦草、苜蓿等。
2. 试剂与仪器：NaCl、蔗糖、抗冻蛋白提取液、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机等。
三、实验方法1. 抗冻蛋白的提取（1）取适量植物材料，用液氮速冻后研磨成粉末。
（2）将粉末加入适量提取液，室温下搅拌提取1小时。
（3）离心分离，取上清液即为抗冻蛋白粗提液。
2. 抗冻蛋白的活性检测（1）配制一定浓度的NaCl溶液和蔗糖溶液作为对照。
（2）将抗冻蛋白粗提液与NaCl溶液、蔗糖溶液混合，观察混合液的冰点变化。
（3）将混合液置于低温环境下，观察植物材料是否发生冻害。
四、实验结果与分析1. 抗冻蛋白的提取通过实验，成功提取了冬黑麦、胡萝卜、女贞叶、黑麦草、苜蓿等植物中的抗冻蛋白。
2. 抗冻蛋白的活性检测实验结果显示，不同植物中的抗冻蛋白活性存在差异。
冬黑麦和胡萝卜中的抗冻蛋白活性较高，能显著降低混合液的冰点，保护植物材料免受冻害。
3. 抗冻蛋白在低温胁迫下的保护作用将含有抗冻蛋白的混合液与植物材料共同置于低温环境下，实验结果表明，抗冻蛋白能显著提高植物材料的抗寒能力，降低低温胁迫对植物造成的伤害。
五、实验结论1. 成功提取了冬黑麦、胡萝卜、女贞叶、黑麦草、苜蓿等植物中的抗冻蛋白。
2. 不同植物中的抗冻蛋白活性存在差异，冬黑麦和胡萝卜中的抗冻蛋白活性较高。
3. 抗冻蛋白在低温胁迫下能显著提高植物材料的抗寒能力，降低低温胁迫对植物造成的伤害。
六、实验讨论1. 抗冻蛋白的提取方法：本实验采用液氮速冻和研磨法提取抗冻蛋白，该方法操作简单，效果较好。
2. 抗冻蛋白的活性检测：本实验通过观察混合液的冰点变化和植物材料是否发生冻害来检测抗冻蛋白的活性，该方法直观、简便。
3. 抗冻蛋白在低温胁迫下的保护作用：本实验结果表明，抗冻蛋白能显著提高植物材料的抗寒能力，为植物在低温环境下的生存提供了重要保障。
《抗冻蛋白序列与结构特征的研究》篇一一、引言抗冻蛋白（Antifreeze Proteins, AFPs）是一类具有独特功能的蛋白质，它们在低温环境下能够有效地抑制或延缓冰晶的形成和生长。
这些蛋白在各种生物体中广泛存在，包括微生物、植物和动物等，它们在维持生物体在寒冷环境中的生存和生长具有重要作用。
本文旨在研究抗冻蛋白的序列与结构特征，以揭示其抗冻机制。
二、抗冻蛋白的序列特征抗冻蛋白的序列特征主要包括氨基酸组成、分子量和等电点等。
首先，抗冻蛋白的氨基酸组成具有丰富的多样性，其中某些特定的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等在抗冻蛋白中占据较高比例。
其次，抗冻蛋白的分子量通常较小，这使得它们能够快速地与冰晶表面结合并发挥作用。
此外，抗冻蛋白的等电点也是其序列特征的重要参数，不同种类的抗冻蛋白具有不同的等电点。
三、抗冻蛋白的结构特征抗冻蛋白的结构特征包括一级结构、二级结构和空间结构等。
在一级结构方面，抗冻蛋白通常由几十到几百个氨基酸残基组成，通过α-螺旋和β-折叠等二级结构相互连接。
此外，部分抗冻蛋白还含有丰富的二硫键等特殊化学键。
二级结构主要形成的是蛋白质分子的基础骨架。
而空间结构则使这些分子能够折叠成特定形状并形成特定功能区域，例如冰晶生长抑制区或结合位点。
四、序列与结构的关联及抗冻机制研究表明，抗冻蛋白的序列与结构紧密相关。
通过改变序列中某些关键氨基酸残基，可以改变其与冰晶的结合力，进而影响其抗冻能力。
另外，一级结构中的α-螺旋和β-折叠等结构为抗冻蛋白提供了与冰晶表面相互作用的基底。
而特定的空间结构则使得这些基底能够在冰晶表面形成特定取向，从而提高其抗冻效果。
具体来说，抗冻蛋白通过抑制冰晶生长和重结晶来防止生物体内水分的冻结，从而维持生物体的正常代谢活动。
五、研究方法与实验结果研究抗冻蛋白的序列与结构特征通常采用生物信息学、分子生物学和结构生物学等方法。
首先，通过生物信息学分析手段对已知的抗冻蛋白序列进行比对和分析，了解其序列特征。
植物抗寒性基因研究综述作者：王庆杰王立来源：《农村经济与科技》2018年第08期[摘要]综述了在低温胁迫下，植物不饱和酶基因，脯氨酸和甜菜碱的调节及其基因表达，Ca2+及钙依赖的蛋白激酶对植物抗寒性反应中的调节，抗氧化酶，植物冷诱导基因，植物抗冻蛋白基因工程的研究进展。
[关键词]植物；抗寒基因；表达[中图分类号]Q945.78 [文献标识码]A在低温胁迫下，植株的细胞结构会受到伤害，而且会引发物质代谢紊乱，甚至引起死亡，在农业以及林业生产中造成重大的损失。
据统计，世界每年因植物冻害造成的损失达2000亿美元左右。
随着分子生物学的发展，导入外源基因已经成为提高植物抗逆性的主要手段。
因此，对植物抗逆性基因的研究，无论在理论上还是实际生产中，都有广泛的应用价值。
本文综述了近年来抗寒性基因工程的研究进展。
1 植物不饱和脂肪酸酶及基因Levitt，Paha等以及Orvat指出，冷害首先发生在细胞膜和与细胞膜相关的过程。
在冷胁迫下，植物的膜系统会发生相变，膜脂从液晶相变为凝胶相，使膜发生收缩，使镶嵌于膜上的膜蛋白（酶）被固定，酶系统遭受到破坏，膜上出现孔道或龟裂，细胞膜的主动运输和选择透过的特性丧失，膜透性增大，因此使膜内可溶性物质、电解质大量向膜外渗透，破坏了细胞内外的离子平衡。
膜系统的稳定性直接影响光合和呼吸作用的活性。
因此，低温首先引起膜系统的透性和活性的变化，从而使光合作用减弱，体内的保护系统受到破坏，呼吸速率大起大落，同时细胞间冰晶对细胞膜和细胞壁产生机械损伤，水分平衡受到破坏，最终导致植物死亡。
影响植物膜质脂肪酸饱和性的酶主要有两类，一类是膜质脱饱和酶，另一类是脂酰转移酶。
在低温下，膜质脱饱和酶可以被诱导表达，从而提高植物在低温下的不饱和度，增加膜系统的稳定性。
在已研究的膜脂脱饱和酶基因中fad4、fad5、fad6、fad7、fad8、desC和des9有控制叶绿体中脂肪酸的脱饱和作用；fad2和fad3控制内质网的脂肪酸脱饱和作用。
植物抗冻蛋白的研究进展引言植物抗寒性是指植物在低温环境下存活和正常生长的能力，是植物适应环境的一种重要的适应策略。
随着现代生物技术的发展，研究植物抗寒性和冷冻伤机制的分子水平得以深入，许多与植物抗冻性相关的分子机制被逐渐揭示出来，其中植物抗冻蛋白的研究成为了热点之一。
本文就植物抗冻蛋白的研究进展作简要综述。
植物抗冻蛋白的分类植物抗冻蛋白（plant cold acclimation protein）是在低温适应过程中由植物细胞自行合成的保护蛋白，又称寒性蛋白。
植物抗冻蛋白主要分为结构型抗冻蛋白和调节型抗冻蛋白两种类型。
结构型抗冻蛋白结构型抗冻蛋白主要是指在低温环境下由植物细胞表达的一类蛋白质，它们具有空间结构稳定和抗冻性能强等特点。
目前已发现的结构型抗冻蛋白主要有以下类型：1.内源性结构性抗冻蛋白：如甘油、脯氨酸等小分子有机化合物，以及糖原、核糖体等大分子有机化合物。
2.外源性结构性抗冻蛋白：如外源性抗冻蛋白R101、超级冷冻素等。
调节型抗冻蛋白调节型抗冻蛋白（Regulatory Cold Acclimation Protein）通常指在低温适应过程中由基因表达调节的一类蛋白质，它们通常不会直接参与到细胞的代谢过程中，而是通过调节基因表达和信号转导途径来提高植物的低温适应能力。
目前已发现的调节型抗冻蛋白主要有以下类型：1.内源性调节性抗冻蛋白：如去甲基化酶1、DNA结合转录因子CBF1等。
2.外源性调节性抗冻蛋白：如链球菌外毒素等。
植物抗冻蛋白的合成及机理研究低温适应下植物抗冻蛋白的合成及其机理研究对揭示植物在低温环境中保护机制具有重要意义。
早期研究表明，一些外源性抗冻蛋白能够激活细胞的代谢过程并促进与低温适应相关的基因的表达。
后来研究发现，在低温适应过程中，植物会自行合成并积累各种类型的抗冻蛋白，其中结构型抗冻蛋白是通过转录和翻译过程来完成合成的，而调节性抗冻蛋白主要是通过激活特定的信号转导途径来促进其基因表达的。
植物抗寒基因研究进展
王多佳;苍晶;牟永潮;曾俨;许平;于晶
【期刊名称】《东北农业大学学报》
【年(卷),期】2009(040)010
【摘要】寒害严重影响植物的生存和分布,提高植物抗寒性,对农业具有十分重要的意义.文章从抗冻蛋白、冷诱导、脂肪酸去饱和、渗透调节物质等方面对植物抗寒基因进行归纳和总结,并对未来工作重点进行了展望.
【总页数】5页(P134-138)
【作者】王多佳;苍晶;牟永潮;曾俨;许平;于晶
【作者单位】东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;邹城市林业局林业站,山东邹城,273500;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030
【正文语种】中文
【中图分类】Q945.4
【相关文献】
1.有关园艺植物抗寒基因工程研究进展 [J], 刘红洁
2.园艺植物抗寒基因工程研究进展 [J], 陈延惠;连红可;马海旺;李洪涛;李跃霞;胡青霞
3.植物抗寒基因工程研究进展 [J], 李璨;杨天杰
4.植物抗寒基因研究进展 [J], 刘文英;张永芳;张东旭
5.植物抗寒基因表达调控研究进展 [J], 王俊峰;孔维国;张煜;马玉敏;李娜娜;丁汉凤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物抗冻蛋白及其基因工程研究的新进展抗低温蛋白（LowTemperatureProtein，LTP）是抗低温的主要基因类别，是植物通过调节生理机制来应对不同环境温度变化的重要标志物质，是植物逆境胁迫下存活和繁衍生息的重要因素。
近年来，随着基因工程技术的发展，人们逐步发现植物抗冻蛋白的分子特性，并在其基因组学与转录组学研究中发掘更多植物抗冻蛋白的新种类，这给植物发育环境的研究和利用抗冻蛋白建立分子育种提供了重要科学参考依据。
抗冻蛋白在植物细胞内发挥着重要的保护作用。
蛋白质通过两种主要的方式来应对低温胁迫：上调表达内质网内尔蛋白质，以及调节糖代谢。
其中，蛋白质上游机制中参与的蛋白质主要有热休克蛋白，抗氧化蛋白，抗蛋白酶，抗病毒蛋白，内质网蛋白，转录因子，叶绿素蛋白，糖原蛋白等。
而糖代谢机制已经被认为是植物抗寒响应的细胞和分子机制，其中以抗冻果糖、抗冻氨基酸和抗冻脱水酶等水溶性抗冻生物参与调节活性最为重要。
由此可知，植物抗冻蛋白的研究不仅对植物的发育有重要的意义，同时也拉开了胁迫下植物的基因表达调控，揭示了抗冻基因的分子机制。
近年来植物抗冻蛋白的研究迅速发展，经过多年的研究，科学家们已经发展起各种基因工程技术，例如转基因技术、敲除技术、抗低温蛋白编码基因克隆技术。
这些技术对于植物抗寒反应调控和分子育种都有重要的意义。
在使用基因工程技术研究和开发抗冻品种方面，科学家们发现，植物可以通过将多种抗冻基因从其他植物中引入，或是通过基因融合技术将多个抗冻基因放入同一细胞内，以提高植物的耐寒性，从而达到杂交育种的目的，这种基因工程研究也可以用于改变植物的形态、根系、或抗害性。
目前，科学家们已经开发出多种抗冻的基因，这些基因可以提高植物的耐寒性，从而更好地保护植物免受冻害。
然而尽管植物抗冻蛋白的研究取得了较大进展，但其基因工程研究仍面临许多挑战。
由于植物抗冻性涉及多种基因分子，因此基因工程技术的构建需要保证每个基因的有效表达，以及维持抗冻蛋白的稳定表达。
河北农业科学,2008,12(2):14-16Journal of Hebei Agricultural Sciences 责任编辑 李布青植物抗冻蛋白及其基因工程研究任 敏,毛雪飞 (新乡学院应用生物系,河南新乡 453000)摘要:抗冻蛋白(AFP )是一种适应低温的特异蛋白质,它能阻止体液内冰核的形成与生长,维持体液的非冰冻状态。
了解其特征和抗冻生理机制对农作物抗冻品种选育有重要意义。
以动物方面的研究资料及近年发表的有关植物AFP 的文献为基础,进行分析归纳,籍以阐明植物AFP 的生化特性、作用机制、基因工程研究进展等,并展望了植物AFP 的应用前景。
关键词:植物;抗冻蛋白;基因工程中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:100821631(2008)022*******Stud i es i n Plan t An tifreeze Prote i n s and The i r Geneti c Eng i n eer i ng REN M in,MAO Xue 2fei(App lied B i ol ogy Depart ment of Xinxiang College,Xinxiang 453000,China )Abstract:Antifreeze p rotein is one kind of s pecial p rotein adap ted t o low temperature 1A t first,it was found fr om the sea fish in polar regions 1It could p revent ice nucleati on from for m ing and gro wing within fluid 1It als o could keep body fluids maintaining non 2fr ozen state 1In recent years,the discovery p rocess,basic characteristics,and p r ogress of genetic engi 2neering of p lant antifreeze p r otein were analyzed according to the related documents 1The app lication p ros pect of antifreeze p rotein was summarized 1Key words:Plant;Antifreeze p rotein;Genetic engineering收稿日期:2007211214作者简介:任 敏(1962-),女,河南新乡人,副教授,主要从事生物技术专业教学与研究。
冻害对大多数的细胞是有害的,有时甚至是致死性的,它可以使细胞内环境脱水、结晶,从而造成细胞物理性损害或死亡。
在农业生产中,低温冻害是一种严重的自然灾害,查明植物抗寒性的生理机制及其遗传因素,不仅在基础理论研究上有重要意义,在解决生产实际问题上也有广泛的应用价值。
一个世纪以来,植物冻害机理的研究受到世界各国学者的重视。
在植物冻害的成因,植物在抗寒锻炼过程中的代谢途径,细胞结构(膜磷脂含量、膜脂脂肪酸不饱和度、细胞骨架的冷稳定性等)的变化,以及已经对农业生产产生良好的经济效益的水稻育秧抗寒剂的研制等诸多方面都取得了很大进展。
许多研究表明,植物要抵抗冰冻的危害,需要具备2个最基本的要素:一是避免细胞内结冰;二是细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物质的低温稳定性。
大量研究表明,细胞外结冰和细胞液的过冷却是植物避免细胞内结冰伤害的最主要和最普遍的2种适应机制。
抗冻蛋白(antifreeze p r otein,AFP )是一种适应低温的特异蛋白质,它能阻止体液内冰核的形成与生长,维持体液的非冰冻状态。
Guy 推测植物体内可能存在能够阻止冰核形成的物质,即AFP,这种可以改变水结冰性质的物质在植物中的含量随季节温度起伏而消长。
AFP 最先是从动物中获得的,近年来,在植物中也发现了AFP 。
了解AFP 的特征和抗冻生理机制对农作物抗冻品种选育有重要意义。
以动物方面的研究资料及近年发表的有关植物AFP 的文献为基础,进行分析归纳,籍以阐明植物抗冻蛋白的生化特性、作用机制等,并对植物抗冻蛋白的应用前景进行了展望。
1 抗冻蛋白的发现111 动物抗冻蛋白的发现AFP 是一些生活在极地、高山以及深水域等寒冷环境的生物抵御冰冻的一种有效方式。
AFP 最早由Dever 2ies 于1969年在南极Mcmurdo 海峡的一种Not o 2theneniid海鱼血液淋巴中发现的,后来各个实验室又陆续将抗冻蛋白的研究扩展到昆虫,以及其他的无脊椎动物和脊椎动物,现在抗冻蛋白在鱼类(尤其是深海鱼类)方面的研究已较成熟。
目前,在鱼类的研究中,将鱼类的抗冻蛋白分为6类:抗冻糖蛋白(AFGPs )(最早被提取的抗冻蛋白),I 型抗冻蛋白(APF I ),II 型抗冻蛋白(APF II ),III 型抗冻蛋白(APF III ),I V 型抗冻蛋白(APF I V )和Hyperactive 2AFP 。
112 植物抗冻蛋白的发现自20世纪60年代抗冻蛋白在鱼类、昆虫中被陆续发现后,研究对象陆续扩大到细菌、真菌、无脊椎动物和脊椎动物,而植物抗冻蛋白的研究则较晚,曾经用于研究的植物材料多达30余种,但是真正被分离纯化获得AFP 的不多,直到1992年,加拿大Griffith 等[1]第1次明确提出获得了植物内源AFPs,他们从经过低温锻炼的可以忍受胞外结冰的冬黑麦(Secale cereale )叶片第2期任 敏等:植物抗冻蛋白及其基因工程研究质外体中得到并部分纯化了抗冻蛋白。
同年,美国圣母大学的Duman实验室在多种植物中发现了具有热滞效应的蛋白质[2]。
1994年我国学者费云标等[3]从常绿抗冻植物沙冬青(Ammop ip tanthus monglicus)叶片中分离得到了抗冻蛋白。
随后卢存福[4]在高山植物唐古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得具有抗冻活性的蛋白质。
到21世纪初,已经检测到含有热滞活性蛋白的植物有26种。
1998年英国York大学Dawn Worrall等[5]在胡萝卜中发现了第一个植物AFP基因。
2001年尹明安等成功克隆出中国胡萝卜(Var1sativus)和英国胡萝卜(Var1autumn)的AFP基因。
2 植物AFPs的结构模型 关于植物AFPs的结构模型报道甚少。
Kuiper等[6]在多年生黑麦草中发现的AFPs的冰晶抑制活性高,热滞活性低,一级结构中含有重复性序列。
基于这个特点,他们从理论上提出一个3维结构模型:黑麦草AF2 Ps是由118个氨基酸组成的多肽,在这个多肽中每14～15个氨基酸组成一个环,8个环组成一个筒状结构,筒状结构的一端是保守的缬氨酸疏水核,另一端是由内部天冬酰氨酸组成的梯状结构。
已知缬氨酸是疏水性氨基酸,天冬酰氨酸是亲水性氨基酸。
筒状结构的亲水端与冰晶表面吻合互补,疏水端则有效地防止了水与冰的结合,阻止了冰继续生长。
这个模型很好地解释了植物AFPs热滞活性低、冰重结晶抑制活性高的现象。
但是与鱼类相比,植物抗冻蛋白要复杂的多,而且种类也是多种多样,并不能像鱼类那样用简单的一个或几个模式就能概括,所以Kuiper等所构思的模型只适用于极少数的植物,或者与某些植物的相类似,因此并未得到广泛认可。
但它为找出植物抗冻蛋白之间的一些共性提供了一条可以尝试的道路。
由该模型及其他植物的相关研究结果可以看出,抗冻蛋白大都富含甘氨酸,因为甘氨酸在蛋白质中大都出现在肽链转角的地方,由此可以推测,在抗冻蛋白中的折叠区域较多,应该形成一个封闭的或者是半封闭的结构。
而且大多数抗冻蛋白中还含有较多的天冬氨酸、天冬酰氨,谷氨酸、谷氨酰氨等酸性氨基酸和赖氨酸等碱性氨基酸以及一些含有羟基的氨基酸如丝氨酸、苏氨酸,这些氨基酸都是亲水性的,可以广泛的分布于蛋白质3级结构的外部,并且还含有较多的疏水性氨基酸,以包含在蛋白质的中间,通过疏水作用力来维持蛋白质的结构,进一步说明了植物抗冻蛋白应该是一个封闭的或者是半封闭的结构。
3 植物AFPs的生物特性311 植物AFPs属于冷诱导蛋白植物AFPs属于冷诱导蛋白(cold accli mati on induc2 tion p r otein,CA I P;cold regulatory p r otein,CORP)。
在美国北印第安那州研究的23种被子植物及常绿植物中,秋、冬季均可检测到AFPs,但夏季这种AFPs消失了[2],由该现象可以推测抗冻蛋白是一类低温诱导蛋白质,是抗冻植物对冬季低温较为普遍的适应机制。
胡萝卜的AFP基因在非冷驯化状态下不表达,而在冷驯化状态下表达水平迅速呈特异性地提高[7]。
转基因植物的AFPs通常只在低温(4℃)诱导下才能检测到其表达[8]。
更值得一提的是,AFPs有亲水性和热稳定性,这也与冷诱导蛋白相似[9]。
312 植物AFPs只在单子叶植物中有发现Antikainen等[10]近来的研究表明,经2～5℃低温驯化后,AFPs只在抗冻的单子叶植物(冬春黑麦、冬大麦、冬春小麦、春燕麦)叶片质外体中积累,而在不耐寒的玉米中则无AFPs积累。
在所研究的双子叶植物中无论抗寒性较强的菠菜、油菜、羽衣甘蓝等,还是不耐寒的烟草等,均未检测到AFPs的存在。
对此,可能有2种解释:一种可能的解释是双子叶植物AFPs可能定位在细胞内;另一种可能的解释是双子叶植物抗冻能力需在冰冻温度条件下才能被诱导,AFPs才能积累。
4 抗冻蛋白基因工程研究进展 1998年l0月,第1个植物抗冻蛋白基因—胡萝卜抗冻蛋白基因的发现,为抗寒基因工程注入了新的活力。
在此前的10多年中,通过抗冻蛋白基因改变动植物抗冻活性的研究都局限于鱼类抗冻蛋白基因。
为了提高作物的抗冻性,人们对鱼类AFPs基因的开发利用进行了不懈的努力,取得了一些有益的成果:1987年Da2 vies等将抗冻蛋白基因整合在Ti质粒上,用叶圆片法转化郁金香、烟草、油菜等,获得了一定的抗冻能力。
1989年Curler等用真空透析法将冬比目鱼抗冻蛋白基因导入马铃薯、拟南芥和欧洲油菜,使植物自然结冰温度降低118℃,证实了转抗冻蛋白基因可提高植物的抗寒性。
1990年Georges等用合成的冬蝶鱼抗冻蛋白基因构建了含35S启动子、抗冻蛋白基因和Cat(编码氯霉素酰基转移酶CAT)基因的载体PGC51,将该质粒通过电击导入玉米原生质体,通过CAT分析以及用抗冻蛋白和CAT的抗血清作的蛋白印迹检测到了融合肽的产生。
