犬瘟热诊断方法研究进展dd

山地农业生物学报２３（１）：７８～８２，２００４　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　

・文献综述・　犬瘟热诊断方法研究进展木　

徐在品，张登祥，鲜思美，陶玉顺，吴彤　（贵州大学动物科学学院动物医学系，贵州贵阳５５００２５）　摘要：概述了犬瘟热的细胞生物学与分子生物学诊断方法。在细胞生物学方面，对犬瘟热的诊断主要依靠病　毒分离培养、动物回归实验、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查、包涵体检查等。随着分子生　物学的发展，对犬瘟热的诊断从细胞水平发展到分子水平，国内外相继建立起ＣＤＶ核酸杂交和ＲＴ－ＰＥＲ诊断法，　这些方法比传统诊断法具有更高的敏感性和特异性，尤其在犬瘟热的发病早期，机体尚未产生免疫应答时ＲＴ—　ＰＥＲ诊断法便能够作出早期诊断。　关键词：犬瘟热；细胞生物学诊断；分子生物学诊断；核酸杂交；ＲＴ－Ｐ（　诊断法　中图分类号：￥８５８．２９２．２６５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８—０４５７（２００４）０１—００７８—０５　

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃａｎｉｎｅ　ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ　ＸＵＺａｉ－ｐｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｄｅｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＸＩＡＮ　Ｓｉ－ｍｅｉ。ＴＡＯ　Ｙｕ－ｓｈｕｎ，ＷＵ　Ｔｏｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｙＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００２５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ￣Ａｔｎｉｎｅ　ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ（ＣＤ）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ＷａＳ　ｓ－ｍｍ￣ｆｉｚｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｓｐｅｃｔ，ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ＣＤ　ｗａｇ　ｍｌ，ｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｄ　ｏｎ　ｖｉｒｕｓ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　＿ｐｌｉｃ丑　０Ｉｌ　ｅｘｐｅｄｍｅｍ，ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｅｘａｍｉｎａ－　ｔｉｏｎ。ａｎｄ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｏ　ｏｎ．Ａｌｏｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ’８　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆＣＤ　ｈａｓ　ａｄｖａｎｃｅｄｔｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｆｒｏｍ　ｃｅｌｌｌｅｖｅ１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄＲＴ—ＰＥＲｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ￣ｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒ　Ｙｉｒｕ８　（ＣＤＶ）ｈａｖｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｓｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｈａｖｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈ—　ｏｄｓ　ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅ￣ｉｅｒ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ＣＤＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌ　ｂｏｄｙ　ｃａｎ’ｔ　ｄｅｖｄｏｐ　ａｎ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．　Ｋｅｙｗ删ｎｄｓ：ｃａｎｉｎｅｄｉｓｔｅｍｐｅｒ；ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ；ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ；ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＲＴ—　ＰＣＲ　

犬瘟热（ｃａｎｉｎｅ　ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ，ＣＤ）是由副黏病毒科麻疹病毒属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｍｓ）的犬瘟热病毒（ｃａｎｉｎｅ　ｄｉｓ－　ｔｅｍｐｅｒ　ｖｉｒｕｓ，ＣＤＶ）引起的一种急性高度接触传染性疾病。该病毒为一种嗜神经、嗜白细胞性单股负链　ＲＮＡ病毒。伴随生态环境的改变、动物和病毒的进化以及对犬瘟热诊断技术的日益完善，发现ＣＤＶ自然　感染的动物范围不断扩大，危害也越来越严重，致病地位日益突出，但在Ｉｆ缶床上犬瘟热的诊断很困难，易与　上呼吸道感染、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染等相混淆，因此，本文就犬瘟热的诊断方法进行综述。　

１　ＣＤＶ分离培养　ＣＤＶ分离培养是确诊本病最根本的方法，但工作量较大，加之ＣＤＶ对外界环境的抵抗力很弱，其脂　质囊膜结构较脆，易被光和热灭活，致使病毒分离成功率较低　¨。此外，病料采样的部位、时间、样品处　理、病程类型、发病动物的抗病毒抗体水平等因素对病毒分离成功与否有一定的影响，但最主要的是分离　

收稿日期：２００３—０６—０５；修回日期：２００３—０７—１５　基金项目：贵州省科技攻关资助项目【（２ｏ０ｏ）１１１１］　作者简介：徐在品（１９７０一），男，贵州织金人，贵州大学动物科学学院动物医学系讲师，硕士，重庆大学在读博士，主要从事家畜外科手术学、　

家畜外科学、生物医学工程的教学科研工作。　

维普资讯 http://www.cqvip.com 第ｌ期　徐在品。等：犬瘟热诊断方法研究进展　７９　病毒的细胞是否敏感和有效（如病毒的细胞受体蛋白在细胞中含量很少，且细胞在不同周期表达的受体　量有差异等）。　分离ＣＤＶ用的组织细胞有原代细胞及传代细胞系两大类。　１．１　ＣＤＶ原代细胞分离培养　原代培养细胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬细胞、肾细胞、胚胎细胞、外周血淋巴细胞、Ｔ淋巴细胞、犬脑　细胞（ＤＢ），犊牛的肾细胞和Ｔ淋巴细胞，牛胚胎肺细胞和鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）。ＣＥＦ应用最多，细胞病　变（ＣＰＥ）包括星芒状和露珠样病变或细胞颗粒变性和空泡形成，在覆盖的琼脂下可形成微小的蚀斑，Ｈａｉｇ　（１９４８）将适应于雪貂的ＣＤＶ株（Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ）培养于鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）上获得成功　Ｊ。本病毒可　在６～ｌ１日龄ＣＡＭ上发育　Ｊ，一般经过３～ｌ０代后，于接种后２～７ｄ出现肉眼可见的病变，ＣＡＭ水肿，形　成灰白色增厚的痘斑，但强毒在ＣＡＭ上的痘斑形成效率最低　Ｊ。最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺脏　巨噬细胞进行培养。Ｖａｎｔｓｉｓ（１９５９）用感染动物的肺巨噬细胞直接培养，可以频繁地分离出病毒【５　Ｊ。没有　母源抗体的易感幼犬的肺巨噬细胞对该病毒最易感，可形成典型ＣＰＥ，强、弱毒株都能使犬肺巨噬细胞培　养物发生细胞融合而形成巨细胞，用Ｈ．Ｅ．染色在合胞体巨细胞的胞浆内含有嗜酸性包涵体，通过免疫荧　光（Ⅱ＇）技术可检查到包涵体内存在着病毒抗原。钟志宏等【６　（１９９５）通过制备犬肺巨噬细胞（ＤＬＭ）及其　对不同毒力ＣＤＶ的敏感性比较，得出ＣＤＶ对犬和水貂的毒力并不总是与该病毒在ＤＬＭ上的感染和复制　能力相一致的结论。与犬巨噬细胞培养物相比，雪貂或犬肾细胞用于强毒分离的敏感性较低，因此，利用　肾细胞从ＣＤＶ感染犬分离病毒可能有限。　１．２　ＣＤＶ传代细胞培养　分离ＣＤＶ的传代细胞系有犬肾细胞系（ＭＤＣＫ）、狗肾细胞系（ＤＫ）、猫胚胎细胞系（ＦＥ）、猫肾细胞系　（ＣＲＦＫ）、乳仓鼠胎肾细胞系（ＢＨＫ一２１）、非洲绿猴肾细胞系（Ｖｅｒｏ）及其克隆株（Ｖｅｒｏ　Ｅ６）、ＢＧＭＫ（Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅｙ　Ｋｉｄｎｅｙ）细胞系、绒猴Ｂ淋巴细胞系（Ｂ９５ａ）、人子宫颈癌细胞系（Ｈｅｌａ）、人喉头癌细胞系（ＨＥＰ一　２）、ＣＶ—ｌ（Ｔｃ７　ｃｌｏｎｅ）细胞系、Ｂｓｃ—ｌ细胞系、兔肾细胞系（ＲＫ１３）、ＢＤ细胞系等。近年来　用Ｖｅｒｏ细胞分　离培养ＣＤＶ很有希望，被认为是首选细胞　】。Ｖｅｒｏ细胞接种后可逐日观察到细胞变圆，胞质内颗粒增　多，胞浆空泡化，部分细胞坏死脱落，使单层细胞呈现拉网状，融合细胞如蜘蛛样匍匐于网中。在用传代细　胞单层培养病毒时，细胞形成单层的时间不宜过长，否则影响对病毒的敏感性，另外，ＣＤＶ用传代细胞系　传代，易使毒力下降或细胞病变丢失。　１．３动物回归试验　ＣＤＶ分离成功后，还需通过动物回归试验对该病作进一步确诊。各种接种途径均可使雪貂、犬和水　貂发生具有临床症状的感染，但该病最敏感的实验动物是雪貂，接种后其死亡率可达１００％　。　

２　电镜诊断　本法是检查、确定ＣＤＶ感染最简便快速的方法。制备电镜样品方法有磷钨酸（ｍ）负染色法　驯、液　相免疫电镜　’　和超薄切片法　ｍ　。根据笔者的经验，电镜观察的最佳病料是粪便，该诊断法从制样到镜　下观察，整个过程只需要２～３ｈ，可用于快速检查ＣＤＶ粒子。　

３包涵体检查　在ＣＤＶ感染的细胞中出现一种特征性的形态学变化——包涵体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）。这是ＣＤ感染的重　要标志之一，可通过诊断病理学进行检查，这是诊断ｃＤ的重要辅助方法。生前采取鼻黏膜、眼结膜、膀胱　刮取物、阴道黏膜或外周血液等制成涂片，检查细胞的胞浆内包涵体和核内包涵体。包涵体经Ｈ，Ｅ．染色　后，在光学显微镜下可见其呈红色或暗红色、具有清晰的边界和匀质的边缘。通常多见于细胞浆内，一个　细胞中常可发现１～１０个多形性包涵体，一般呈圆形或椭圆形，也有见到呈镰刀形而紧贴于胞核上者；存　在于核内的包涵体属于Ｃｏｗｄｒｙ　Ａ　。对病理组织及组织培养细胞采用免疫荧光技术可以证明包涵体　内含有病毒抗原。特征的组织变化为下列细胞有胞浆和／或胞核内包涵体：　

维普资讯 http://www.cqvip.com ８０　山地农业生物学报　２００４年　＝＝＝＝＝＝＝：＝＝＝＝＝＝：＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝：＝：：：：：：：：：：：＝：：：　＝：：＝：＝：＝＝：　

呼吸道：鼻和咽喉部黏膜上皮内有特征的胞浆和核内包涵体，核内包涵体与胞浆内包涵体相似，仅引　

起细胞核的轻度肿胀。　肺：在巨细胞、单核细胞、细支气管和支气管黏膜上皮细胞有胞浆内包涵体，但核内包涵体较少见。　皮肤：上皮尤其皮脂腺上皮细胞有核内或胞浆内包涵体。　胃肠道：上皮可能有大量胞浆内包涵体和一些核内包涵体。　肝：肝细胞变性和坏死，胆管上皮有核内包涵体。　泌尿道：上皮细胞内有胞浆内和核内包涵体。　中枢神经系统：在胶质细胞内常有胞浆内和核内包涵体。神经细胞也会发生退行性变化。在神经细　胞内，很少见到包涵体。脑膜动脉和静脉的内皮和外膜细胞、皮质和脉络丛毛细血管的内皮细胞、血管腔　的单核细胞、蛛网膜腔的组织细胞和巨噬细胞、增生的小胶质细胞和室管膜细胞中，均可见类似犬瘟热病　毒衣壳的晶状结构。　视网膜：在视网膜和视神经的胶质细胞有核内包涵体。　另外，在病犬外周血液中的中性粒细胞和单核细胞有核内包涵体。而淋巴细胞内的包涵体则比较少　见。有时关节上皮也有包涵体。在慢性病程中，很少出现包涵体。