怀化医专《微生物学检验》教案编号：
厌氧性细菌及检验
(anaerobic bacteria)
第一节概述
厌氧性细菌指一群必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。
一、厌氧菌的分类
分为两类：（P285表）
一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属，即梭菌属，共有130个种。以芽胞形式存于体外。
另一类为无芽胞厌氧菌，包括40多个属，300多个菌种和亚种；多为体内正常菌群，存在于皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和泌尿生殖道。易引起这些部位的内源性感染，而不易诊断。
二、厌氧菌感染（占临床感染的60%）
（一）厌氧菌在正常人体的分布
厌氧菌与需氧菌一起组成了人体的正常菌群。人体许多部位厌氧菌在种类和数量上远多于需氧菌，如在结肠中99%的细菌都是厌氧菌。
临床厌氧菌感染中，由正常菌群的无芽胞厌氧菌的感染最为多见。
（二）厌氧菌感染的原因
1. 局部组织的氧化还原电势降低如血管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧，使Eｈ降低；此外，大面积外伤伴有需氧菌感染消耗了氧，为厌氧菌感染提供了条件。
2 . 机体免疫功能下降如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病病人及老人、婴幼儿、早产儿等，因免疫力下降易併发厌氧菌感染。
3. 机体局部屏障破坏，使厌氧菌进入周围组织和血液引起感染。
（三）厌氧菌感染的临床及细菌学指征
1.局部有气体产生为重要指征之一
2.发生在粘膜附近的感染
3.深部外伤
4.有特殊的分泌物如有恶臭，暗红血色或在紫外光下发出红色荧光。如分泌物或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染。
5.某些抗生素治疗无效的感染。
6.细菌形态培养有特征性变化如革兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形性；或镜检查见细菌而需氧培养为阴性者。
第二节厌氧菌的微生物学检验
一、标本的采集与运送
（一）标本采集
标本种类：血液、关节液、心包液、腹腔液、膀胱穿刺液等体液；深部脓肿渗出液、肺部渗出液、其他组织穿刺液。厌氧菌培养最好的标本是组织标本，厌氧菌在其中更易生长。
采集注意事项：避免正常菌群污染，尽量避免接触空气。有些标本如鼻咽拭子、痰液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等因含大量的正常菌群，故不宜作厌氧菌培养。
采集方法：采取深部的组织标本：需经碘酒消毒皮肤后，用注射器插入病变部位深部，抽取数毫升后，弃去一滴于酒精棉球上。（不同标本采集见P291表）（二）标本的运送与处理
注意尽快送检，避免干燥，避免接触空气
1. 针筒运送法适宜液体标本。标本抽取后排尽空气，并将针头插入无菌橡皮塞中即可送检。
2. 无氧小瓶运送法常用于少量脓液标本的运送。用无菌青霉素小瓶，瓶内装入0.5ｍｌ的心脑浸液(含有0.0003%的刃天青---氧化还原指示剂),加橡皮塞后,铝盖密封，真空泵抽出瓶中空气，充入N2，连续充抽3次，最后充以CO2，高压灭菌备用。
如有氧渗入小瓶，培养基则显粉红色，应弃去。运送时挑选无色小瓶，将标本用无菌注射器注入瓶中即可。
3. 标本充盈法送检适宜于大量液体标本运送。将液体标本装满标本瓶，加盖密封，可驱除瓶中空气。
4. 组织块运送法将组织块放在密封的厌氧罐中运送。罐内放入经酸化硫酸铜浸泡过的钢丝绒，其表面即有金属铜，具强还原性，能迅速吸氧，造成厌氧罐中无氧状态。
5. 厌氧袋运送法
6. 棉拭运送法（略）
应在20~30min内处理完毕，最迟不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过度生长，抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，应将标本保存于室温（因冷藏对厌氧菌有害）。
二、检验程序
三、检验方法
（一）肉眼观察
应观察标本的性状，如是否为脓性、带血，有无黑色坏死组织或黑色分泌物，有无硫磺样颗粒或恶臭气味等。这些有助于厌氧菌的鉴定和培养基的选择。（二）直接镜检
在接种前除血液外，各种临床标本均需直接涂片染色、镜检，以了解标本中细菌的数量、形态及染色性，便于选择合适的培养基和培养方法，还可验证培养结果的成功与失败。
（三）分离培养
1、初代培养
（1）培养基的选择：
1）非选择培养基以牛心脑浸液及布氏肉汤为基础，补充0.5%酵母浸出液，5μg/ml氯化血红素、10 μg/ml维生素K1及5%－10%的脱纤维血的强化血平板。2）选择培养基常用的有:
七叶苷胆汁平板（BBE，用于脆脆弱类杆菌）
卡那万古冻溶血平板（KVLB，可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期产生黑色素）FS培养基（梭杆菌选择培养基）
VS培养基（韦荣球菌选择培养基）
CCFA培养基（艰难梭菌）
上述培养基使用注意：①尽量使用新鲜培养基，2~ 4ｈ内用完；②使用前放入无氧环境，预还原处理24~ 48ｈ；③也可采用预还原灭菌法制备的培养基；④液体培养基应煮沸10min，驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。
（2）标本接种
初代培养应同时接种固体和液体两种培养基，且每份标本应同时接种3个平板，分别置有氧、无氧和含5~10%CO2环境培养。
如只要求厌氧培养，只需种一个厌氧血平板，并将其分为三个区，在第一、二区交界处贴放一枚灭滴灵，如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在。（3）培养方法
原理是通过物理、化学或生物学等方法，创造一种无氧的环境。
1）厌氧罐培养法：即利用物理或化学的方法在一个密闭的罐子里造成无氧的环境。有抽气换气法和冷触媒法。
抽气换气法：将种好的培养基放于罐内，放入经烘烤的催化剂（钯粒）盘，盖子拧紧。通过罐盖上的三通管，用真空泵抽尽罐内空气，再用N2反复充气与抽气3次，最后充入含80%N2、10%H2、10% CO2的混合气体。
钯粒用过既失活，再次使用前需将其加热至灼红。如此反复使用：
2H2+O2 → 2H2O
冷触媒法：利用化学方法产生H2和CO2，产生的H2在触媒的作用下，与罐内的氧结合生成水，将氧消耗掉，造成无氧环境。使用时同抽气换气法将钯粒和接种好的平板放于厌氧罐内，然后将配套的气体发生袋剪去一角，加入10ml 水，立即放于罐内，密封厌氧罐即可。
2) 厌氧气袋法：原理与冷触媒法相同，只是用无毒的塑料薄膜制成的特殊气袋取代厌氧罐。
优点：简便易行，携带方便，尤适宜于床边接种，和基层医院使用。
3）厌氧手套箱：为国际公认的厌氧菌培养的最佳设备。为一个密闭的大型金属箱，由手套操作箱和传递箱两个部分组成，操作箱内还附有小型恒温培养箱，通过自动化装置自动抽气、换气，保持箱内的厌氧状态。
优点：因接种、培养和鉴定等都是在无氧状态下进行，提高了检验的阳性率；
缺点：设备昂贵，耗气。
4)疱肉培养法：肉渣加适量液体培养基，表面盖以凡士林。肉渣含不饱和脂肪酸，可吸收氧，并含谷光甘肽，可降低培养基的氧化还原电势。
适用于所有厌氧菌的培养和菌种保存
(4)结果观察
厌氧菌的初代培养生长较慢，故应在48ｈ后才能初步观察，如疑为放线菌则应延长至72－96ｈ。
观察时应注意：①厌氧菌在对数生长期对氧非常敏感，故在培养的48ｈ不应使细菌暴露于空气中；②标本镜检阳性，但培养48ｈ却无菌生长，应继续培养5－7ｄ。
2. 次代培养和厌氧菌的确定
初代厌氧培养有细菌生长时，需做耐氧试验，确定是否为厌氧菌。
方法是：从每个平板上挑取4－5个不同性状的菌落，每个菌落分别接种3个平板（每个平板分4－6个区，可同时做4－6个菌落的次代培养）。分别放有氧、无氧和含5%－10%CO2环境中培养48ｈ，如只在厌氧环境中生长的细菌，即为厌氧菌。
四、鉴定试验
