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实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。
将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。
灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。
培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。
2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。
包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。
包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。
严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染•每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。
（3）无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
细菌学检验重点（选择20个20分，填空52个26分，名词解释6个18分，简答6个24分，论述1个12分）注：以下内容主要是老师的红字部分，可能看的过程有些吃力，大家结合课件和书本看哈，帮助理解，不过老师说过考点重点在红字部分的第一章细菌学实验的基本要求1、实验室生物安全(Laboratory biosafety): 实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相差法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。
2、生物安全防护基本要求实验室生物安全防护（biosafety protection for laboratories）–实验对象：致病的微生物及其毒素–`–综合措施：实验室设计建造、个体防护设施、工作及操作程序和规程等–确保：实验室工作人员不受实验对象侵染，周围环境的生物安全。
实验室生物安全通用原则•积极防止操作者在污染的环境中接触生物危害物；•主动封闭生物危害材料产生之源，防止从操作部位向周围环境释放；•尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。
3、实验室必须设有专职的生物安全负责人实验室负责人为实验室生物安全的第一责任人。
*生物安全等级•生物安全防护实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四级。
–实验室生物安全防护要求：一级最低，四级最高。
4、在主实验室合理设置清洁区、半污染区和污染区5、各级生物防护实验室特点•一级生物安全防护实验室（BSL-1/P1）：适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。
•二级生物安全防护实验室（BSL-2/P2 ）实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。
:在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。
•三级生物安全防护实验室（BSL-3/P3）：适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗。
第一章细菌检验基本技术一、名词解释1.培养基2.Gram stain二、选择题【A1型题】1．做细菌培养时，采集标本的最佳时间是A、应用抗菌药物之前采集标本B、应用抗菌药物之后采集标本C、一边应用抗菌药物一边采集标本D、采集标本与是否应用抗菌药物没有关系E、应用抗菌药物一天后采集标本2．采集窦道标本进行细菌学检查，应选择A、坏死组织B、窦道底部取活组织C、窦道口取标本D、窦道流出的液体E、窦道中央的脓液3．盛装细菌学检查标本的容器A、用75%酒精浸泡24小时后直接应用B、用碘酒浸泡12小时后直接应用C、高压灭菌，煮沸或干热灭菌D、用浓H2SO4处理后，直接应用E、用水洗后直接应用4．尿液做厌氧菌培养时A、取消毒中段尿B、无菌注射器从耻骨上缘行膀胱穿刺术抽取C、自然导尿D、放入无菌试管送检E、盛装尿液的容器不必将标本与空气隔绝5．怀疑肠热病患者，应如何采集标本A、发病的第一周采集血液，第二周采集尿液，第三周采集粪便B、发病的第一周采集尿液，第二周采集血液，第三周采集粪便C、发病的第一周采集尿液，第二周采集粪便，第三周采集血液D、发病的第一周采集血液，第二周采集粪便，第三周采集尿液E、发病的第一周采集粪便，第二周采集血液，第三周采集粪便6.标本不需要保温送检的病原体是A、脑膜炎柰瑟菌B、淋病C、流感嗜血杆菌D、阿米巴滋养体E、大肠埃希菌7．采用运输拭子采集标本做细菌培养可延长保存时间，但一般不超过多长时间A、1天B、2天C、3天D、4天E、5天8．细菌不用染色直接镜检主要用于检查A、细菌的动力及运动状况B、细菌的排列．C、细菌的形态D、细菌的夹膜E、细菌的鞭毛9．常用的碱性染料是A、伊红B、刚果红C、结晶紫D、瑞氏染料E、姬姆萨染料10．常用的酸性染料是A、结晶紫B、美蓝C、瑞氏染料D、姬姆萨染料E、伊红11．细菌经革兰染色，结果是A、革兰阳性菌为红色，革兰阴性菌为紫色B、革兰阳性菌为紫色，革兰阴性菌为红色C、革兰阳性菌为紫色，革兰阴性菌为兰色D、革兰阳性菌为兰色，革兰阴性菌为红色E、革兰阳性菌为兰色，革兰阴性菌为紫色12．下列不是抗酸性细菌的是A、金黄色葡萄球菌B、人结核分枝杆菌C、牛结核分枝杆菌D、非结核分枝杆菌E、异染颗粒染色13．敏感性最强的染色方法是A、革兰染色B、抗酸染色C、鞭毛染色D、荧光染色E、异染颗粒染色14．为进一步观察白喉棒状杆菌的形态，应做下列哪种染色A、革兰染色B、抗酸染色C、鞭毛染色D、荧光染色E、异染颗粒染色15．为观察细菌的运动情况，常用下列哪种方法A、悬滴法B、革兰染色法C、抗酸染色法D、鞭毛染色法E、墨汁染色法16.下列不是细菌生长所需营养物质的是A、蛋白质B、肉浸液C、牛肉膏D、琼脂E、血液17．在制备培养基时，为有利于检出病原菌而抑制非病原菌，常加入一定量的抑制剂，下列属于抑制剂的是A、维生素B、氨基酸C、胆盐D、嘌呤E、嘧啶18．血琼脂平板培养基属于A、基础培养基B、营养培养基C、鉴别培养基D、选择培养基E、特殊培养基19．SS琼脂平板培养基属于A、基础培养基B、营养培养基C、鉴别培养基D、选择培养基E、特殊培养基20．克氏双糖铁琼脂（KIA）属于A、基础培养基B、营养培养基C、鉴别培养基D、选择培养基E、特殊培养基21．糖发酵管属于A、基础培养基B、营养培养基C、鉴别培养基D、选择培养基E、特殊培养基22．巧克力琼脂平板属于A、基础培养基B、营养培养基C、鉴别培养基D、选择培养基E、特殊培养基23．疱肉培养基属于A、基础培养基B、营养培养基C、鉴别培养基D、选择培养基E、特殊培养基24．可用碱性琼脂或TCBC琼脂培养基分离的细菌是A、霍乱弧菌B、沙门菌C、志贺菌D、大肠埃希菌E、铜绿假单胞菌25．氧化-发酵试验（O/F试验）主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，其原因是A、肠杆菌科细菌与非发酵菌均为发酵型B、肠杆菌科细菌与非发酵菌均为氧化型C、肠杆菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型D、肠杆菌科细菌为氧化型，非发酵菌为发酵型E、肠杆菌科细菌与非发酵菌均为产碱型26．七叶苷水解试验主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，该试验阳性的细菌是A、肺炎链球菌B、无乳链球菌C、化脓链球菌D、肠球菌E、草绿色链球菌27．硫化氢试验主要用于肠杆菌科细菌属及种的鉴别，不产生硫化氢的细菌是A、沙门菌属B、肠杆菌属C、枸橼酸杆菌属D、变形杆菌属E、亚利桑那菌属28．氧化酶试验阴性的细菌是A、奈瑟菌属B、莫拉菌属C、葡萄球菌属D、铜绿假单胞菌E、弧菌29．过氧化氢酶试验（触酶试验）主要用于革兰阳性球菌的初步分群，下列正确的是A、葡萄球菌阴性，链球菌属阳性B、微球菌阴性，链球菌属阳性C、葡萄球菌与链球菌均阴性D、葡萄球菌阳性，链球菌阴性E、葡萄球菌与链球菌均阴性30．葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是结合凝固酶，另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶，下列说法正确的是A、结合凝固酶可用玻片法检出，游离凝固酶可用试管法检出B、结合凝固酶可用试管法检出，游离凝固酶可用玻片法检出C、结合凝固酶和游离凝固酶均可用玻片法检出D、结合凝固酶和游离凝固酶均可用试管法检出E、结合凝固酶和游离凝固酶不能用玻片法和试管法检出31．下列CAMP试验阳性的细菌是A、A群链球菌B、B群链球菌C、C群链球菌D、D群链球菌E、F群链球菌32．下列对杆菌肽敏感的细菌是A、A群链球菌B、B群链球菌C、C群链球菌D、D群链球菌E、F群链球菌33.下列对optochin纸片敏感的细菌是A、A群链球菌B、B群链球菌C、肺炎链球菌D、草绿色链球菌E、肠球菌34．对沙门菌属及志贺菌属进行血清分型时，一般采用的凝集反应试验是A、玻片法凝集试验B、反向间接血凝试验C、胶乳凝集试验D、协同凝集试验E、试管法凝集试验35．用分子生物学方法检测耐β-内酰胺抗生素的TEM型β-内酰胺酶基因（bla-TEM-1）时，常用的方法是A、Southern印迹B、Northern印迹C、斑点杂交D、PCRE、生物芯片技术36．下列可产生内毒素的病原体是A、革兰阳性细菌B、真菌C、抗酸性细菌D、病毒E、革兰阴性细菌37．有关细菌培养基的描述，不正确的是A、按物理状态可分为液体、固体和半固体B、血琼脂平板属于营养培养基C、SS培养基属于鉴别培养基D、疱肉培养基属于厌氧培养基E、蛋白胨水为常用的基础培养基38．细菌检查最快速的检测方法是A、电镜检查B、动物试验C、分离培养D、直接涂片镜检E、血清学试验39．用鲎试验测定的物质是A、类毒素B、肠毒素C、神经毒素D、外毒素E、内毒素40．细菌染色法中，最常用最重要的鉴别染色法是A、革兰染色B、抗酸染色C、鞭毛染色D、荚膜染色E、芽胞染色41．为鉴定肠杆菌科细菌进行IMViC试验，不属于IMViC试验项目的是A、VP试验B、甲基红试验C、硝还试验D、枸橼酸盐利用试验E、吲哚试验42．芽胞、鞭毛、荚膜及异染颗粒等的染色称为A、美兰染色B、革兰氏染色C、抗酸染色D、特殊染色E、复红染色43．革兰染色阴性的细菌颜色是A、蓝色B、紫色C、红色D、黄色E、白色44．适于用麦康凯（MacConKey）琼脂培养基培养的细菌是A、肠道菌B、分离培养鼠疫杆菌C、白喉棒状杆菌D、培养布鲁氏菌E、百日咳杆菌45．常用痰涂片抗酸染色光镜检查进行初步诊断的细菌是A、军团菌B、支原体C、流感嗜血杆菌D、肺炎链球菌E、分枝杆菌46．患者6岁，春节后突然发热、剧烈头痛、喷射状呕吐、颈项强直。
微生物检验技术介绍微生物检验技术是医学、生物学、化学等多个学科领域交叉融合的前沿技术，其主要目的是通过对微生物的形态、结构、生理生化特性等进行观察、测定和分析，为疾病诊断、病原体鉴定、流行病学调查等方面提供重要依据。
以下是微生物检验技术的主要内容：一、传统微生物学检验技术传统微生物学检验技术是建立在经典微生物学的基础上，通过形态学、生理生化等特征对微生物进行鉴定和分类。
该方法具有简单、直观、快速等优点，但易受主观因素和经验限制，且无法对某些微生物进行准确鉴定。
1、显微镜检查显微镜检查是微生物检验的基本方法之一，通过观察微生物的形态、大小、结构等特征，对微生物进行初步鉴定。
该方法主要用于细菌、真菌等微生物的观察。
2、培养基培养培养基培养是一种常用的微生物分离培养方法，通过在培养基中接种微生物，观察其生长情况，进行分离、鉴定和计数。
该方法可用于细菌、真菌等微生物的培养。
3、生化鉴定生化鉴定是通过测定微生物对各种生化试剂的反应，了解其生理生化特性，从而对微生物进行鉴定和分类。
该方法可用于细菌、酵母菌等微生物的鉴定。
二、现代微生物学检验技术随着科技的发展，现代微生物学检验技术越来越趋向于自动化、快速化和高精度化。
以下是一些常见的现代微生物学检验技术：1、免疫学检测技术免疫学检测技术是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，通过制备特异性抗体，对样本中的抗原进行检测。
该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已被广泛应用于医学、食品等领域。
2、分子生物学检测技术分子生物学检测技术是一种基于DNA或RNA等核酸分子的检测方法，通过分析核酸分子的序列、结构等特征，对微生物进行鉴定和分类。
该方法具有高精度、高特异性等优点，但需要一定的技术和设备支持。
3、色谱-质谱联用技术色谱-质谱联用技术是一种将色谱分离与质谱鉴定相结合的检测方法，通过将样本中的化合物进行分离和鉴定，了解其化学性质和结构特征。
该方法可用于细菌、真菌等微生物产生的代谢产物的鉴定。
细菌的一般检验方法
细菌是一类微小的生物体，它们存在于自然界的各个角落，有
些对人类健康有益，有些则可能引发疾病。
因此，对细菌进行检验
是非常重要的。
下面将介绍一般的细菌检验方法。
首先，最常见的细菌检验方法之一是培养法。
培养法是通过将
样本置于适当的培养基上，利用培养基中的营养物质和条件，促使
细菌在培养皿中生长和繁殖。
在适当的环境条件下，细菌会形成典
型的菌落，通过观察菌落的形态、大小、颜色等特征，可以初步判
断细菌的种类。
其次，鉴定细菌的生化试验也是一种常用的方法。
生化试验是
通过检测细菌在特定生化反应条件下的代谢产物，来判断细菌的特性。
比如，利用氧化酶试验来判断细菌是否具有氧化酶酶活性，利
用大肠杆菌培养基来区分大肠杆菌等。
除此之外，PCR法也是一种常用的细菌检验方法。
PCR法是一种
快速、高效的分子生物学技术，通过扩增细菌DNA片段，再通过电
泳等手段来检测细菌的存在。
PCR法的优点是操作简便、灵敏度高，可以快速准确地检测出细菌。
最后，抗生素敏感性试验也是细菌检验的重要环节。
抗生素敏感性试验是通过将不同抗生素涂布在培养皿上，观察细菌对不同抗生素的敏感性，从而选择出对患者病情最有利的治疗方案。
总的来说，细菌的一般检验方法包括培养法、生化试验、PCR 法和抗生素敏感性试验。
这些方法各有优势，可以相互补充，提高细菌检验的准确性和可靠性。
在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的方法，以确保检验结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的细菌检验方法对您有所帮助。
细菌学检验重点第一章细菌学实验的基本要求1、实验室生物安全(Laboratory biosafety）：实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相差法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。
2、生物安全防护基本要求实验室生物安全防护（biosafety protection for laboratories）–实验对象：致病的微生物及其毒素–综合措施：实验室设计建造、个体防护设施、工作及操作程序和规程等–确保：实验室工作人员不受实验对象侵染，周围环境的生物安全。
实验室生物安全通用原则•积极防止操作者在污染的环境中接触生物危害物；•主动封闭生物危害材料产生之源,防止从操作部位向周围环境释放；•尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。
3、实验室必须设有专职的生物安全负责人实验室负责人为实验室生物安全的第一责任人。
生物安全等级•生物安全防护实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四级.–实验室生物安全防护要求：一级最低，四级最高。
4、在主实验室合理设置清洁区、半污染区和污染区5、各级生物防护实验室特点•一级生物安全防护实验室（BSL—1/P1）：适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等.•二级生物安全防护实验室（BSL-2/P2 ）实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。
在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时,在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。
•三级生物安全防护实验室(BSL—3/P3）：适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗.•四级生物安全防护实验室( BSL-4/P4 )：适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。
