多肽及蛋白类药物微球的载体材料、制备以及突释现象中国组织]:程研究与l临床康复第,2眷,D2008—03—04出版JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchMarch4.2008V o1.12,No.10多肽及蛋白类药物微球的载体材料,制备以及突释现象★lf丹Cardermaterials,preparationandfastreleaseofpolypeptideandproteinmicrospheres WangDanAbstract:Polypeptideandproteinmicrospherescanelevatedrugavailability,butdrugdevita lizationanddrugfastreleasecan resultinsideeffectsduringmicrospherepreparation.Fastreleaseinthebodyisaburningquest ionfactinginvestigatorswho studyingmicrospherecontrolledreleasesystem.Relativemolecularmass,concentration,str uctureanddrugcontentofthepolymercangreatlyaffectdrugfastrelease.Fastreleasecanbecontrolledbystructuralmodification,us ingadditives,controllingparticle diameterofmicrospheresanddecreasingdrugcontent.WangD.Carriermaterials,preparationandfastreleaseofpolypeptideandproteinmicrospher es.ZhongguoZuzhiGongchengY anjiuyuLinchuangKangfu2008;12(10):1931-1934(China)[/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-193l(ps).pdf]摘要:多肽及蛋白类药物微球在提高药物的利用度的同时,存在的主要要问题足微球制备过程中药物失活及药物突释而产生的毒副作用.微球进入体内后的突释现象已成为微球控释系统研究背面ll 备的一个急待解决的问题.聚合物的_村I对分子质鼍,浓度,结构及载药量,药物含量对药物突释产生重要的影响.采用结构修饰,聚合物联用,选用添加剂,控制微球粒径,降低微球载药量等方法控制突释程度取得一定效果.关键词:多肽及蛋白类药物:缓释微球:载体材料:制备工艺:药物突释王丹.多肽及蛋白类药物微球的载体材料,制备以及突释现象[J】-中国组织工程研究与临床康复,2008,12(10):1931.1934[WWW.zglckf.conv'zglckffejournal/upfiles/08-l0/1Ok-l93l(ps).pdf]0学术背景随着生物技术的高速发展,多肽蛋白质类药物不断涌现,体现出了确切的药用价值.然而由于蛋白,多肽类物质分子大,普遍具有稳定性差,生物利用度低,体内生物半衰期短,极易被生物体内的酶分解等缺点,使它们在治疗学领域的应用受到很大限制.如将大分子药物通过可生物降解微球系统给药,不仅能有效防止药物在体内很快降解,还可能靶向送达体内有效部位,达到缓释长效目的.近年来,人们对多肽和蛋白质药物的控制释放进行了比较广泛的研究,通过适当的载体材料对药物进行微囊化而提高其稳定性及生物利用度.本文对多肽及蛋白质药物控制释放载体材料,制备方法,药物突释的影响因素进行分析,以了解多肽及蛋白质药物微球的研究现状及存在的问题.1问题的提出问题1:在长期的缓释过程中,如何保持多肽/蛋白类药物的生物活性?}ssNl673.8225CN2i.i539,RCODEN:ZLKHAH目前,多/tk/蛋白类药物的缓控释制剂尤其是生物可降解微球引起了研究者的广泛关注,微球制剂新技术经过几十年的研究已逐渐成熟,然而在制备多肽蛋白质药物微球给药系统中依然存在很多问题.药物载体是药物释放体系的重要组成部分,也是影响药效的主要因素,选择哪些药物载体材料对这类物质进行微囊化可提高其稳定性?聚乳酸微球以其良好的生物相容I陛已成为重要的组织工程载体形式,但制成的蛋白载药微球使蛋白质药物容易部分失活或完全失活导致有效药物的利用率大大降低,临床应用不理想.影响多肽/蛋白类药物活性降低的因素有哪些?不同的制备工艺是否可以造成蛋白质天然结构的改变和生物活性的丧失?应该如何提高载体材料的制备工艺?问题2:如何降低多肽/蛋白类药物微球的突释室?包封率和突释率是评价微球制剂的两个最重要的指标.突释问题是限制多肽及蛋白类微球广泛应用的一个关键技术问题.制剂在进入体内的第一天前后会迅速大量地释放药物,这种现象被称为"突释".由于给药初期的突释有可能导致血药浓度接近或超过中毒水平,产生明显的毒副作用.如何提高药物的包封率?如WangDan,Pharmacist—in-charge,DepartmentofPharmacy.ShenyangSeventhPeople'sHospita1.Shenyang110003,LiaoningProvince,China*************Received:2o07-Il一26Accepted:2008—0I一20沈阳市第七人民医院药剂科,辽宁省沈阳市l1OOO3王丹,女,1963年生,辽宁省沈阳市人,汉族,2000年吉林大学毕业,主管药师,主要从事药学工作.**************『}]嘲分类~J-:R692艾献标kB史鳊:1673—8225f20081f0—0f93f一04收稿日期:2OO8—1f一26修日日期:20084)I一20(07—50-『1—6570/LYHQ)l93l7wwzgfc.王丹.多聩及蛋白类药物微球的载体料,锄备以致突释现象何减少微球的突释率,控制突释程度?突释控制技术易受哪些因素影响?已成为微球控释系统研究者面临的一个急待解决的问题.只有解决上述问题才有可能实现精确控制释放和靶向定点释放.2问题的讨论2.1多肽和蛋白质药物控制释放载体材料用作多肽和蛋白质药物制剂的载体材料一般分为天然高分子材料和合成高分子材料.天然高分子材料包括壳聚糖,海藻酸及其盐类,明胶等,合成高分子材料主要为聚酯类,如聚乳酸,乳酸/羟基乳酸共聚物等.2.1.1壳聚糖壳聚糖是一种生物相容性好,毒性低,可生物降解的多糖,由于粘附性高,生物相容性好,无毒无副作用,能够有效促进生物大分子渗透,被广泛应用于药物载体和医用辅助材料.有研究…采用基于壳聚糖与聚阴离子(多聚磷酸纳)间静电作用的离子凝胶化方法.以牛血清白蛋白为模型,在室温下制备了包载蛋白质的亲水性壳聚糖纳米颗粒.研究显示这种壳聚糖纳米颗粒对丙种球蛋白具有良好的缓释作用.有研究[2-31将低分子量壳聚糖和三聚磷酸钠以一定的浓度和体积配比在室温下搅拌,制得了壳聚糖和经聚乙二醇修饰的壳聚糖纳米粒子,并利用牛血清蛋白作蛋白质模型药物,增加牛血清白蛋白的初始浓度可提高纳米粒子对牛血清白蛋白的包封率,体外释放实验在初期的突释量明显减小,载药纳米粒子突释之后均呈现缓慢而持续的释放.2.1.2海藻酸钠海藻酸钠又称海藻胶,褐藻酸钠或海带胶,从褐藻或细菌中提取出的天然多糖,由O【一L一古洛糖醛酸(G段)与其立体异构体D—D一甘露糖醛酸(M段)2种结构单元,以3种方式(MM段,GG段和MG段)通过(卜4)糖苷键链接而成的一种无支链的线性阴离子共聚物.海藻酸钠是无毒,生物相容性好,无免疫原性,可降解的天然生物高分子材料.当遇到二价或三价阳离子时,形成水凝胶,海藻酸钠的这种良好的成型和成膜特性, 使其适于作为释放或包埋药物,蛋白与细胞的微囊.贾云等【4应用牛血清白蛋白为模型药物,海藻酸钠(Alg)为包埋材料制备微囊,结果显示,用海藻酸钠作为包埋材料具有良好的包埋率,微囊在制备过程中,牛血清白蛋白没有受到破坏,保持了结构的完整性;用海藻酸钠作为包埋材料对蛋白有一定的缓释效果,突释效应也并不十分明显.2.1-3海藻酸钠/壳聚糖共混药物载体材料海藻酸钠和壳聚糖都是天然多糖,具有生物相容和生物降解的特点.海藻酸钠与多价阳离子(如钙离子)接触时瞬时凝胶l932化,从而在温和条件下实现了对蛋白质药物的包埋【51.这一简单的制备过程避免了高温,有机溶剂及其它有害的条件,有助于保持蛋白质的生物活性.壳聚糖具有独特的阳离子特性,可以与海藻酸钠(聚阴离子)通过正,负电荷吸引作用,在海藻酸钠微囊表面复合一层聚电解质半透膜.从而提高微囊的稳定性和载药量,并可调节药物释放速度.所以海藻酸钠/壳聚糖微球应用于多肽蛋白质的给药具有独特的优越性,近年来已引起相当重视.目前,在多肽蛋白药物控释研究方面,壳聚糖一海藻酸钠微囊主要被用作1:2服控释制剂.有研究【6】采用乳化法制备了可注射用壳聚糖一海藻酸钠微囊,其粒径小于200um,牛血清白蛋白作为模型药物在微囊中的包埋率可超过50%.通过壳聚糖在海藻酸钠微囊表面的复合,牛血清白蛋白从微囊中的持续释放时间从几个小时延长到半个月以上.付加雷等l用壳聚糖和海藻酸钠为原料,制备干扰素2-tau微囊,结果显示其制备简单快速,干扰素2-tau包封率很高,并且具有肠溶缓释作用.李军等隅采用乳化凝胶法研制壳聚糖一海藻酸钠包被的猪血红蛋白微囊,研究结果表明壳聚糖一海藻酸钠一血红蛋白微囊具有较佳的形态和较小的粒径,平均粒径1um,血红蛋白在微囊中包埋率超过90%,从微囊中持续释放时间达1个月以上.壳聚糖一海藻酸钠微囊具有PH的敏感性,根据药物的吸收特点,调节壳聚糖和海藻酸钠的浓度,使其在不同pH值膨胀释放药物,以达到药物的最佳吸4t-ff,l用. 壳聚糖一海藻酸钠微囊制备条件温和,不需要有机溶剂, 适合于有生物活性的蛋白质类药物,且其来源丰富,成本低廉,是很有前途的缓控释给药载体.石晓丽等l用壳聚糖与海藻酸钠通过聚电解质络合反应制备成壳聚糖/海藻酸钠微囊,以干扰素为模型药物,结果显示微囊的粒径为1mm左右.其干扰素的包封率达90%以上,微囊在模拟胃液(pH1.0)中,3h药物释放不到5%;在模拟肠液(pH7,4)中,3h药物释放近100%.壳聚糖/海藻酸钠微囊有可能成为蛋白质类药物1:2服控释制剂的载体.2.1.3聚乳酸类近年来人工合成的可生物降解高分子材料作为蛋白质和多肽的输送载体,受到了高度重视, 并广泛地应用于医学领域的科学研究.目前最常用的生物可降解聚合物为聚乳酸和聚乳酸一羟基乙酸共聚物,因其具有良好的安全性和生物相容性,不会引起明显炎性反应,免疫反应和细胞毒性反应,并且降解速度可以根据需要灵活调整,从而成为可缓释微球的首选壁材Il"J.由英才等¨1用具有生物降解性和血液相容性的聚乳酸为载体材料,以牛血清白蛋白为多肽,蛋白质药物的模P.O.Box1200,**********************************王丹多甑及蛋8类药物微球的载体材料铂备以及突释现象www.zglckf.co 型化合物,分别用相分离法和溶剂萃取法制备出了聚乳耐牛血清白蛋白微球,结果表明用上述两种方法制备的聚乳酸/牛血清白蛋白微球均具有可控释放牛血清白蛋白的功能,含明胶的聚乳耐牛血清白蛋白微球具有更长的牛血清白蛋白释放周期.郑彩虹等¨3J以牛血清白蛋白为模型药物采用修饰的乳化,醇洗法制备小粒径海藻酸微囊,再以壳聚糖孵育制得海藻酸一壳聚糖双层微囊,并进一步用聚乳酸包裹制得复合微球.提高了蛋白药物的包封率,同时通过减少牛血清白蛋白的泄漏,减少了药物的突释,并可通过调节聚乳酸比例调节药物的释放.2.2多肽/蛋白质类药物微球制备方法成功开发一种蛋白质药物的微球给药系统,不仅要求有适宜的载药量,合适的粒径分布范围,而且要求所包封的蛋白质药物稳定,可控制释药速率,突释小.微球的制备方法对微球上述特性有着非常重要的影响.目前微球制备中常用的方法有溶剂挥发法,喷雾干燥法,相分离法和乳化交联法,近年又发展了新的微球制备技术,如采用低温喷雾提取法和超临界流体技术.2.2.1溶剂挥发法溶剂挥发法包括水/油/水复乳溶剂挥发法,固体/,do/水乳剂溶剂挥发法和油/,do乳剂溶剂挥发法三种.水/油/水复乳溶剂挥发法是制备载蛋白质微球最常用的方法.蛋白质为亲水性药物,先将其溶于水或磷酸盐缓冲液,另将载体材料溶于有机溶剂(多用二氯甲烷,有时也采用毒性较小的乙酸乙酯),将二者混合,超声乳化形成水/油初乳,将初乳转移到另一含有乳化剂的水相中制成水/油/水型复乳,不断搅拌萃取挥发有机溶剂,使高分子材料固化成球,最后收集微球,洗涤,干燥.该法广泛适用于许多高分子材料,最为常用的是聚乳酸和聚乳酸一羟基乙酸共聚物.李玲玲等[141以乙酸乙酯与二氯甲烷的混合溶液为有机溶剂,以单甲氧基聚L,.s-醇一取DL一乳酸为膜材的水/ 油/水复乳分步固化法制务蛋白质药物控释微球,结果表明,当外水相盐浓度增大至1.5%时可将释放率由22%提升至45%,是一种较好的加快微球释药速率的途径,通过选择适当的外水相盐浓度,可达到所期望的药物释药速率. 这一方法的优点在于蛋白质溶液以水溶液的形式被包封,使工艺放大成为可能,并且可以得到较高的包封率.但该法在保持蛋白质的稳定性上仍存在着一些问题, 即在制备,贮存,释药过程中蛋白质结构,构象的改变和蛋白质完整性的丢失.固体/,do/水乳剂溶剂挥发法是将固体蛋白质分散于含高分子材料的油相,再加入连续相水相制备固体/油/水型乳剂,蒸发除去高分子材料的溶剂,分离干燥即得微球.为了有效地包裹蛋白质,需要将蛋白质材料jssNi673.8225CN2i—i539/RCODEN:ZLKHAH微粉化.这种方法在保持蛋白质的完整性上比水/,do/水法优越,因为避免了蛋白质溶解于水相并与有机溶剂接触所造成的不稳定.为提高蛋白质的稳定性,在初始的冻干过程中常加入稳定剂.油/油乳剂溶剂挥发法乳剂的外相为油相,内相为有机溶剂.将蛋白质药物分散于含成囊材料的第一油相,与第二油相乳化形成油/油型乳剂,连续蒸发除去材料的溶剂,分离可得到微球.2I2I2喷雾干燥法喷雾干燥技术则是一种快速的一步微囊化过程,药物以固体粉末形式通过高速匀质机分散到高分子材料的有机溶液中,再用喷雾法将此混合物喷入热气流使溶剂迅速挥发,得到固化微球,真空干燥除去残留溶剂[15-161o分为溶液/喷雾干燥,乳剂/喷雾干燥,喷雾冷冻干燥,喷雾液中冷冻及低温喷雾提取等制备工艺.有研究【1用喷雾干燥工艺制备出壳聚糖微球,制得的壳聚糖微球呈规则的球形,粒径小,形态好,获得令人满意的结果.喷雾干燥工艺制备微球是一个物理过程,参数易控,操作简单,节省时间,且条件温和,条件温和,制得的微球具有包封率高,微球粒径大小均匀,可控制粒径范围和释药速率等特点.其缺点是仪器设备投资较大,蛋白质药物在均匀分散到高分子材料有机溶液前需雾化冻干成粉末,以减小蛋白质颗粒的大小,制备过程中也有可能造成微球粘连以及敏感蛋白质药物的变性失活.2.2.3相分离法相分离又称凝聚作用,是制备微球的主要工艺之一,其工艺基本步骤为在高分子材料溶液中将药物溶解或分散成混悬液或乳状液,通过降低温度,调节pH值或加入脱水剂,非溶剂等方法,使高分子材料溶解度降低而从溶液中析出,最后固化成球.相分离过程主要用于水溶性药物,如蛋白质,多肽,疫苗等.相分离过程是一个复杂的过程.虽然该方法能成功地制备微球,但需要消耗大量的有机溶剂,而且容易导致蛋白质失活,除去微球中的残留有机溶剂也存在困难.这些都阻碍了相分离技术的应用.2.2.4超临界流体技术采用超临界流体技术制备微粒制剂能尽可能少用有机溶剂,并在制备过程中能控制微粒性质.通常使用超临界流体制备微球的方法有超临界溶液快速膨胀,气体抗溶剂以及超临界抗溶剂等3种.然而,对该技术的研究还不是很深入,目前尚未见到比较理想的包封率和回收率,体外和体内药物释放的数据也不多.2,3多肽/蛋白质类药物释放过程中突释的影响因素多肽及蛋白质药物微球突释的原因,一般从以下两个方面来解释,首先是因为药物分子和聚合物分子之间的相互作用太弱,导致药物很容易从微球进入释放介质中.其次药物在微球中的分布导致了突释,多肽及蛋白质疏松地吸附在微球表层,或包埋在微球的表层,在微球释放初期,药物从微球中的孔洞和缝隙中释放出来导致突释现l933wwmzglc…l壬丹多驮及蛋白类筠物微球的载体秘料锄冬匕土硬突释现象象的发生.23.1聚合物的相对分子质量微球表面的孔隙率和内部的致密度与突释效应直接相关,而这两者又与聚合物分子量直接相关.就材料本身而言,聚合物的相对分子质量越大,分子结构排列越整齐,生物降解速度越慢.也就是说分子量越高,吸水能力越弱,水解速率越慢.突释受聚合物相对分子质量的影响,但具体如何影响说法不一,一种说法是:聚合物的相对分子质量越低,蛋白质的突释越高,一方面是因为相对分子质量低的聚合物在有机溶剂中的溶解度比较大,导致固化变慢,制得微球的表面孔隙较多;另一方面,是因为相对分子质量低的聚合物制得的微球粒径较小,药物扩散的表面积相应较大.另一种说法是在一定相对分子质量范围内,聚合物相对分子质量越大,与药物之间的相互作用越弱,则微球突释程度越严重,这是因为聚合物分子和药物分子之间的相互作用在其中起了重要的作用.2.3.2聚合物的浓度分散相的浓度越低,会导致更多的水从连续相和内水相进入,在分散相固化之前形成水性的孔隙和通道,一旦微球干燥后,水性通道会变得中空,药物便从中扩散导致突释,提高聚合物浓度可以提高微球的包封率.233聚合物的结构聚合物的化学结构不同,水解的速率不同.一般多聚物的亲水性越强,突释越大,释放速度越快.例如聚合物中羟基乙酸的含量越高,聚合物的亲水性越强,从释放介质中吸收的水分越多,突释就越明显,反之亦然.2.3.4载药量/药物含量聚合物中的药物含量与释放速率密切相关,载药量增加,突释增加.当微球处于释放介质中时,表面吸附的蛋白形成了充满水的通道,使得微球中相应部位蛋白质得到充分的溶解.由于这些通道的大量形成,高的蛋白质含量导致了高的突释效应. 3小结通过对各影响因素加以适当优化与控制,可在一定程度上减少微球的突释率.多肽蛋白类药物的亲水性较强,因此突释效应较严重.采用化学手段进行结构修饰, 制成亲水性较弱的前药,可减少因水溶性较大引起的突l934释.将聚乳酸和聚乳酸一羟基乙酸共聚物等多种聚合物材料以适当的比例混合,利用药物与聚合物亲和力的差异,控制药物在微球中的分布,可起到降低微球突释量的作用.采用复乳一溶剂挥发法制备多肽蛋白类药物微球时,在内,外水相或油相中加入合适的添加剂,可有效控制微球突释水平.多肽蛋白质类药物微球给药系统是一项很有前景的技术,然而国内外对突释机制及控制突释措施的研究都还处于起步阶段,蛋白质多肤类药物微球的包封率和突释问题尚需进一步研究.4参考文献吴萍,何晓晓,王柯敏,等,基于壳聚糖载体的蛋白质药物纳米颗粒制备研究【J1瑚南大学(f1然科学版),2007,34(9):7l一73徐咏梅,杜予民.低分子量壳聚糖纳米粒子缓释蛋白质药物性能的研究….武汉大学(理学版),2003,49(4):470.474徐淑芳,徐咏梅,陈建钢.壳聚糖季铵盐纳米粒子的制备,表征及其缓释蛋白质药物性能….武汉大学:理学版,2004,50(6):721-725贾云,戴传云,赵宏伟,等.海藻酸钠微囊对蛋白质控制释放的分析IJ1.重庆大学:自然科学版,2008,28(10):108.1l0 EffectofCa",Ba",andSronalginatemicrobeads.Biomacromolecules.2006;7(5):1471—1480舒晓正.朱康杰.壳聚糖一海藻酸钠微囊对蛋白质控制释放的研究『J1rI力能高分子,1999,l2(4):423.430付加雷,宋长征,张更林.壳聚糖一海藻酸钠微囊对干扰素.tau的控释作用【J】.中国海洋药物杂志,2006,25(5):28.30李军,张继娟,赵兴娟,等.壳聚糖海藻酸钠包被猪血红蛋白微囊的制备IJ1.海南大学:自然科学版,2006,24(3):239—242石晓丽,徐军,张雪梅,等.干扰素壳聚糖,海藻酸钠微囊控释制剂载体的初步研究IJ1.中国生物制品学杂志,2007,20(2):ll7.1l8 WangJ,WangBM,SchwendemanSECharacterizationofthe 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