DNA测序分析常见问题整理

等，对激光全反射。 ● 对策
– 灌胶时，避免气泡 产生；
– 上样前，样品先离 心；
共同–学习毛，重细在管交、流 检测窗口
有机物污染（瀑布效应）
● 现象：基线从高处 突然下降。
● 原因：有机物进入 毛细管，受激发产生一定 波长的荧光，抬高基线。 ● 对策：依次更换水、 缓冲液、甲酰胺、测序胶、 毛细管；清洗或更换胶引
Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzers
DNA测序 分析常见问
题整理
测序结果—峰图
四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A T C G
共同学习，重在交流
影响测序质量的主要因素
➢ 引物 ➢ DNA模板 ➢ 纯化 ➢ 困难模板 ➢ 机器影响
共同学习，重在交流
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
共同学习，重在交流
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
共同学习，重在交流
酒精峰
特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明” 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。
① 毛细管寿命 ② 其它
共同学习，重在交流
毛细管寿命
突起部分
峰的左右不对称，向后 拖，有小突起
共同学习，重在交流
共同学习，重在交流
共同学习，重在交流
高GC
oly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。 局部高GC一般会导致信号中断和乱峰。 共同学习，重在交流
重复序列
GT 重复导致信号衰减
A/G重复导致信 号衰减
或信号乱
共同学习，重在交流
回文结构
其他复杂的二级结构也会导致衰减
共同学习，重在交流
四、机器因素对测序结果的影 响
共同学习，重在交流
模板上没有引物结合位点
● 现象：没有 特异性的测序峰
图 ● 原因：引物
无法结合模板 ● 对策
重新设计引物
共同学习，重在交流
引物二聚体
● 现象：前面100多bp噪音高， 后面正常（引物二聚体片段小大
在100bp左右）
● 原因：引物二聚体未去除干 净
● 对策：割胶纯化
共同学习，重在交流
号的小“尾巴”。
● 共原同因学习：，合重成在交时流引物多一
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰）
● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质
● 对策：
–建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。
–脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用
来测序。
共同学习，重在交流
移码突变
在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复
共同学习，重在交流
杂合子
杂合变点
杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。
共同学习，重在交流
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子 原因：挑克隆时两个质粒混在一起
对策：新挑克隆，重新制DNA
共同学习，重在交流
共同学习，重在交流
荧光物质污染
● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被
软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛
细管；清洗或更换胶引导块、针筒。
共同学习，重在交流
“钉子”峰
● 现象：四色并存突 然拔起的尖峰，峰形锐
利。 ● 原因：毛细管内有 气泡、灰尘、尿素结晶
一、引物对测序结果的影响
① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合
共同学习，重在交流
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个 同样荧光信
号的小“尾巴”。
● 原因：合成时引物多一
● 现象：每个峰前面有个 同样荧光信
双引物结合
● 现象：从一开始（区别于非 单克隆）就出现两套峰
● 原因：模板有两个引物结合 位点，同时和两个引物结合
● 对策：重新设计单个引物
共同学习，重在交流
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
共同学习，重在交流
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正常模板与噪音
PCR正常终止
导块、针筒。
共同学习，重在交流
四、困难模板对测序结果的影 响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
共同学习，重在交流
特殊结构
共同学习，重在交流
Poly结构
Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对 信号影响较大。
oly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
终止峰
共同学习，重在交流
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它 颜色
● 原因：PCR主带与杂带混在 一起测序
● 对策：凝胶电泳回收主带，
重新测序
割胶纯
化
共同学习，重在交流
点突变（SNP）
突变点
模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。