牛蒡繁育系统与花部特征研究邢艳萍1,赵容1,许亮1,2∗,杨燕云1,康廷国1,2㊀(1.辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;2.辽宁省中药原料质量监测技术服务中心,辽宁大连116600)摘要㊀[目的]了解牛蒡生殖特性,为其栽培育种提供理论基础㊂[方法]通过野外观察,运用异交指数(OCI )㊁花粉胚珠比(P /O )及套袋试验等研究方法对大连地区辽宁中医药大学内牛蒡的花部特征及繁育系统进行研究㊂[结果]牛蒡群体花期一般为34~35d ,花期重叠,每年6月下旬开始到7月末结束,其花粉和柱头具有活力且柱头在全天都具有活力;OCI 为4,P /O 为5666,异花授粉需要传粉者,风对其传粉作用不明显;套袋试验中自然套袋与自然对照均可结实,结实率分别为99.0%和69.5%,去雄去柱头后套袋结实率为0,不具有无融合生殖特性㊂[结论]牛蒡具有异交特性且自花授粉可结实,风媒传粉可能性小㊂关键词㊀牛蒡;花部特征;繁育系统;杂交指数;花粉胚珠比中图分类号㊀S 631.9㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀0517-6611(2024)05-0185-04doi :10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.044㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(OSID):Study on the Breeding System and Floral Syndrome of Arctium lappaXING Yan-ping 1,ZHAO Rong 1,XU Liang 1,2et al ㊀(1.School of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian,Liaoning 116600;2.Liaoning Provincial Technical Service Center for Quality Monitoring of Traditional Chinese Medicine Materials,Dalian,Liaoning 116600)Abstract ㊀[Objective]To understand the reproductive characteristics of ppa and provide theoretical basis for its cultivation and breeding.[Method]Flowering syndrome and breeding system of ppa growing in Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Dalian were studied by field observation,outcrossing index (OCI),pollen-ovule ratio (P /O)and bagging test.[Result]ppa population generally had 34-35days of flowering period and overlapped flowering period.From late June to the end of July,pollen and stigma had vigor and the stigma had vigor throughout the day,OCI =4,P /O =5666,cross-pollinators needed pollination,and the effect of wind on its pollination was not obvious.Both natural bagging and natural control were fruitful and the seed setting rate was 99.0%and 69.5%respectively.The setting rate of bagging at the emasculate and removing stigma of head was 0,it did not have apomixis characteristics.[Conclusion]ppa had the characteristics of cross-pollination and it also could self-pollination and fructification.And the possibility of wind pollination was low.Key words ㊀Arctium lappa ;Floral syndrome;Breeding system;Outcrossing index (OCI);Pollen-ovule ratio (P /O)基金项目㊀辽宁省百千万人才工程资助项目(2021921039);辽宁省科技厅项目(2020-MS -224);国家自然科学基金项目(81874338,81773852)㊂作者简介㊀邢艳萍(1986 ),女,辽宁北票人,高级实验师,博士,从事药用植物资源鉴定研究㊂∗通信作者,教授,博士,博士生导师,从事药用植物资源评价和鉴定研究㊂收稿日期㊀2023-04-11;修回日期㊀2023-06-01㊀㊀牛蒡(Arctium lappa )为菊科(Compositae)植物,历代本草记载,其果㊁叶㊁根均可入药㊂牛蒡干燥成熟果实牛蒡子为我国传统中药,始载于‘名医别录“[1],具有疏散风热㊁宣肺透疹㊁解毒利咽的功效,主要用于治疗风热感冒㊁咳嗽痰多㊁麻疹㊁风疹㊁咽喉肿痛㊁痄腮㊁丹毒㊁痈肿疮毒[2]㊂牛蒡根具有多种活性成分,具有抗菌作用[3]㊂牛蒡叶中的主要成分绿原酸也具有抗菌作用[4]㊂此外,牛蒡肥大的肉质根可作蔬菜食用,叶柄及嫩叶也可食用[5],具有丰富的营养和保健作用,是具有潜力的经济作物㊂目前,药用牛蒡子产于全国,不同产地药材质量具有一定差异[4,6],而且栽培牛蒡子药材产量低,大面积种植牛蒡子处于亏损状态㊂国内对于牛蒡的研究主要集中于栽培技术㊁药理疗效㊁药材质量和鉴定等方面[7-12],但关于牛蒡繁育系统与花部特征的相关研究鲜有报道,这是牛蒡品种改良和选育等的重要基础㊂植物繁育系统主要研究的是花的形态特征㊁花的开放式样㊁花各部位的寿命㊁传粉者种类和频率㊁自交亲和程度和交配系统,其中交配系统是核心[13]㊂目前多种药用植物,如蒙古蒲公英㊁暗紫贝母㊁直缘乌头花等的繁育系统已有报道[14-16],这些研究是药用植物开展有性杂交育种的理论基础,可为人工选育新品种提供理论依据[17-18]㊂该研究通过野外观察㊁套袋去雄等试验对牛蒡的花部特征和繁育特性进行研究,旨在为牛蒡植物资源居群遗传特性㊁栽培育种及质量控制等研究提供理论参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀植物材料㊀供试的牛蒡为野生引种,栽种于辽宁中医药大学药草园,约150株㊂2017㊁2018年6 7月,选择天气晴朗的日期对生长健壮㊁无病虫害的植株进行观察和试验㊂1.2㊀试验方法1.2.1㊀牛蒡花部综合特征研究㊂1.2.1.1㊀花设计特征观察㊂随机选取10株牛蒡,标记30朵盛开的花序,记录花序颜色㊁柱头形态为羊角状的单花颜色㊁柱头和花药的位置关系等,并用游标卡尺测量其花序直径㊁花冠长度㊁子房长宽㊁雌雄蕊等长度㊂取新鲜的牛蒡花粉和花柱,其中花粉直接进行粘样,花柱需在经2.5%戊二醛和1%锇酸溶液中双固定,0.1mol /L 磷酸缓冲液冲洗,乙醇梯度脱水,乙酸异戊酯置换,CO 2临界点干燥后再进行粘样㊂花粉和花柱粘样后进行喷金㊁观察及拍照㊂1.2.1.2㊀开花动态研究㊂对不同植株单个花序和单花进行观测㊂标记不同的牛蒡植株20株,在花朵开放前每天观察一次,开放当日每1h 观察一次,对花朵花瓣伸展㊁花丝伸长㊁花药开裂㊁花粉散出㊁花柱伸长以及柱头形态变化等进行记录拍照㊂安徽农业科学,J.Anhui Agric.Sci.2024,52(5):185-188㊀㊀㊀1.2.1.3㊀开花物候观测㊂花期观测主要观测从开花到花闭时间㊂观察120株牛蒡开花情况,花序以第一朵单花展开为开始开花到花序最内层最后一朵单花开放为开花结束㊂参照Barrett等[19]的方法,对牛蒡的始花期㊁花盛期㊁持续期和花末期进行记录㊂1.2.2㊀繁育系统研究㊂1.2.2.1㊀花粉特性和柱头活性㊂花粉活力的研究通过0.4%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液染色测得[15]㊂花粉的采集:标记不同植株共10个花序,套上纱网,用于后续采集花粉㊂09:00 18:00每隔1h采集一次花粉,进行染色观察,每次每个处理分别取3个固定大小的视野统计,单次统计的花粉数不少于100个,重复3次㊂花粉数量及散粉率计算参照朱更瑞等[20]的方法,计算出合生花药中花粉的数量;散粉率计算时取羊角状单花,将花药部分切下,并测得花药中花粉的数量㊂重复3次㊂柱头的可授性通过过氧化氢-联苯胺法进行检测[14]㊂在牛蒡盛花期,09:00开始每隔1h分别取柱头发育为羊角状㊁ Y 字状和棒状的单花进行检测,至18:00结束㊂1.2.2.2㊀异交指数(outcrossing index,OCI)㊂按照Dafni[21]标准,统计并得出牛蒡的异交指数㊂1.2.2.3㊀花粉胚珠比(pollen-ovule ratio,P/O)㊂取心皮在体视显微镜下解剖,统计胚珠数,重复20次㊂平均单花花粉量除以单花胚珠数得到P/O值㊂按Cruden[22]标准,得出其自交异交情况㊂1.2.2.4㊀风媒鉴定㊂参照崔大练等[23]的重力玻片法对牛蒡风媒传粉特性进行检测㊂具体操作:选取处于盛花期牛蒡单株5株,株高55~60cm,冠幅30~45cm,在植株8个方位上,从根部开始每个方位放置4片涂有凡士林的载玻片,间距为20cm,间隔1d取回㊂重复3次㊂样品在显微镜下统计花粉粒数㊂1.2.2.5㊀套袋试验㊂该试验以自然花序为对照,对花期的牛蒡进行套袋处理㊂自然套袋:对未开放的花蕾直接套硫酸纸袋;去雄去柱头套袋:在蕾期将花序的柱头和花药除去后套硫酸纸袋㊂每个处理重复10次,待种子成熟后,统计结籽率㊂2㊀结果与分析2.1㊀牛蒡花部特征研究2.1.1㊀花设计特征观察㊂牛蒡单株花序数量平均为123.0朵,头状花序直径为1.26cm,单个花序单花数为52.3朵,单花花冠管状,花冠长为0.57cm,子房长宽分别为0.35㊁0.18cm,花柱高为1.79cm,花药长0.40cm,花药5枚联合,柱头与花药距离为0.20cm,柱头高于花药㊂在电镜下花柱表面密布花柱毛(图1a),沿花柱生长方向着生,内侧分布柱状乳突(图1b),花粉粒显微形态为近球形(图1c),表面具刺,3孔沟,平均直径为38.6μm,直径长度为37.8~ 40.2μm,大小变异范围较小㊂注:a.花柱表面结构(箭头方向为花柱正常生长方向);b.花柱内侧结构;c.花粉显微形态㊂Note:a.Style surface structure(the arrow direction is the normal growth direction of style);b.Style inner structure;c.Pollen microstructure.图1㊀牛蒡花柱显微结构和花粉显微形态Fig.1㊀Style microstructure and pollen morphology of ppa2.1.2㊀开花动态㊂在整个开花过程中牛蒡花柱头未伸出花冠时为粉红色,后期随着花柱的生长和花药的伸出表现为花药部分为紫色,花冠粉红色;单花花冠长度几乎无变化;合生花药紫色,将花柱包于内侧,单花开放时花药成熟,沿花柱一侧开裂,花粉附着在花柱上,这种现象与蒲公英属(Taraxa-cum)植物类似[23];柱头在单花开放后会继续生长,形态呈棒状至羊角状(图2),柱头与花药的距离会逐渐增大,黄白色花粉会分布在此处㊂花序无香气,花序中单花从内到外逐层开放,逐层衰老萎蔫㊂2.1.3㊀花期观测㊂表1所示牛蒡在大连地区6月下旬初开始开花,盛花期在7月中旬,在7月下旬进入开花末期,少数植株花期可持续到8月末,但盛开的花序多为植株末端花序㊂单花从露粉到凋谢为2~5d,平均为3d,花序的寿命是2~5d,平均3d,单花与花序寿命随温度升高时间变短,在花末期其单花和花序寿命也会变短㊂整个种群的花期为34~ 35d㊂群体中个体之间具有花期重叠的特征㊂2.2㊀繁育系统研究2.2.1㊀花粉特性和柱头活性㊂牛蒡单花花粉数量为5666个,在柱头状态为羊角状时,散粉率为89.4%,散粉较完全㊂染色结果显示,牛蒡花粉09:00开始到18:00单花柱头3种形态下的花粉均具有活力,且花粉活力较高,均在90%以上㊂由表2可知,在09:00时,牛蒡柱头在棒状㊁ Y 字状㊁羊角状3种形态下均具有可授性(图3),之后活力均有增强,在18:00之后活力消失,可见牛蒡具有雌雄同熟特征;羊角681㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2024年状在全天可授性强于其他2种状态,可能是由于该时期是柱头生长最后时期,柱头逐渐变长,不断有新组织出现,有利于保持其活性㊂注:a.花序;b.花柱未伸出花冠;c.花柱伸出花冠;d.柱头伸出花冠 Y 字状;e.柱头开裂呈羊角状㊂Note:a.Inflorescence;b.Style not extended corolla;c.Style protruding corolla;d.The stigma cracked in the shape of Y ;e.The stigma cracked in theshape of lamb horn.图2㊀牛蒡单花开放进程Fig.2㊀Single flower bloom process of ppa表1㊀牛蒡花期观测Table 1㊀Observation of flowering period of ppa年份Year 个别植株开花期Individual plant flowering date开花初期Initial floweringstage开花盛期Flowering peak date开花末期Flowering end date单花从露粉到凋谢时间Single flower from dew pollen to withering timeʊd花序从开放到闭合时间Inflorescence time /dfrom opening to closingʊd群落花期时间Flowering time /d of communityʊd201706-2207-0207-1207-273334201806-2107-0107-1207-2533352.2.2㊀异交指数(OCI)㊂牛蒡头状花序直径为1.26cm,雌雄同熟,柱头与花药距离为0.31cm,雌雄异位,由此得出牛蒡的异交指数为4,根据Dafin [21]的标准,牛蒡在有性繁殖过程中以异交为主,部分自交亲和,需要传粉媒介㊂表2㊀牛蒡柱头可授性Table 2㊀Stigma receptivity of ppa开花时间Flowering time温度Temperatureħ柱头形态Stigma morphology棒状Rod likeY 字状 Y shape羊角状Horn shape 09:0028+++10:0032++++11:0034++++++12:0033++++++13:0030+++++14:0030+++++15:0028++++16:0027++++17:0027+++++18:0026---㊀注: -㊁+㊁++ 分别代表柱头不具可授性㊁具有可授性㊁具有强可授性㊂㊀Note:-,+and ++represent that the stigma is not receptive,receptive,strongly receptive,respectively.2.2.3㊀花粉胚珠比(P /O)㊂牛蒡单花的花粉数量为5666粒,胚珠为1个,P /O 为5666㊂根据Cruden [22]标准判断可知,牛蒡为专性异交植物㊂2.2.4㊀套袋试验㊂牛蒡在自然㊁自然套袋㊁去雄去柱头套袋状态下结实率分别为99.0%㊁69.5%和0,具有显著差异(P <0.01)㊂牛蒡去雄去柱头不能结实,说明牛蒡不存在无融合生殖现象㊂自然植株结实率显著高于自然套袋植株(P <0.01),说明牛蒡存在自交的繁殖方式,但可能由于自交亲和性或者自交授粉限制导致结实率较低㊂2.2.5㊀风媒鉴定㊂在冠幅之内花序下面单个载玻片上少数能收集到较多的花粉,多数载玻片上数量极少,离开植株的第4排以外的载玻片上均未收集到花粉,表明牛蒡花粉并未被风传播较远距离㊂在电镜下花粉粒显微形态为近球形,具脊,脊上具刺,花柱表面密布花柱毛,这一结构与蒙古蒲公英类似[23],可能具有将花粉固定到花柱上的功能㊂3㊀讨论与结论花部结构及特征会对植物传粉者的类型㊁活动规律以及植物传粉机制产生重要影响[13]㊂牛蒡头状花序为鲜艳的紫色,单株花序数量大,同时散粉时具有大量的花粉,可以吸引昆虫访花㊂花粉表面具有脊和刺,易于黏附在访花昆虫身体上,完成传粉,同时田间也观察到大量昆虫访花㊂植物花期重叠这一特征也促进了对传粉昆虫的吸引,在植物群体中通常会集中开花,增加群体对昆虫的吸引力,增加传粉程度㊂但植物开花过多也会导致传粉者的饱和,而导致后期的传粉障碍[24-25]㊂牛蒡花期较长,虽然在盛花期开花数量最多,但是不同开花时期持续的时间相近,并没有出现暴发式开花,这也可能是对昆虫传粉的适应机制㊂OCI 检测结果显示牛78152卷5期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀邢艳萍等㊀牛蒡繁育系统与花部特征研究蒡具有昆虫传粉的特性,风媒检测结果也显示风对牛蒡传粉作用不明显,由此可以推断虫媒为牛蒡的主要传粉方式㊂注:a 为棒状,遇溶液后柱头张开;b 为 Y 字状;c 为羊角状㊂Note:a is rod like,stigma open after in solution;b is Y shaped;c is horn shape.图3㊀不同形态柱头在09:00的可授性Fig.3㊀Stigma receptivity in different shapes at 09:00㊀㊀P /O㊁OCI 和套袋试验是检测繁育系统的主要方法[26],牛蒡的OCI 和P /O 检测结果均显示其属于异花授粉植物,结合套袋试验以及传粉媒介检测结果显示,牛蒡属于混合交配系统㊂此外,植物还可以通过自身的特征来影响自交,如雌雄异位㊁异熟等㊂牛蒡单花具有雌雄异位㊁花柱异长等异花授粉特征㊂同时,自花授粉植物的花部结构能够使得花粉在不借助任何外力的情况下即能传播到自花柱头上[27],牛蒡虽然雌雄几乎同熟,柱头生长最后弯曲成羊角状时其柱头可授性仍然很强,花粉也具有活力,但是从结构来看其单花无法在不借助外力的情况下接触到自花花粉,但是套袋试验说明牛蒡可以自主完成自交,可能是同一花序上单花互相接触完成授粉,那么花序中开花较晚的单花授粉机会减少,可能也是导致其结子率低于自然对照的原因㊂通常情况下花粉形态在种内比较稳定,在花粉变异较大情况下会出现花粉败育,如张迟等[28]对 瓯柑 的研究,牛蒡花粉的大小形态较均一,具有活力和可育性,同时牛蒡不具有无融合生殖现象,说明牛蒡的种子繁殖为有性繁殖㊂综上所述,牛蒡属于虫媒花,混合交配系统,不具有无融合生殖现象㊂此外,牛蒡的花期为34~35d,在每年的7月下旬至8月下旬㊂牛蒡花粉和柱头在一天的时间内都具有活力,且活力较强㊂参考文献[1]陶弘景.名医别录[M ].北京:人民卫生出版社,1986:154.[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2020版)[S ].北京:中国医药科技出版社,2020:73-74.[3]胡喜兰,王国卫,高英.牛蒡根中活性成分的研究[J ].食品科学,2007,28(11):113-115.[4]林学政,柳春燕,陈靠山,等.不同地域牛蒡叶绿原酸的含量比较及其抑菌实验[J ].天然产物研究与开发,2004,16(4):328-330.[5]胡秉安.甘肃河西沿祁连山冷凉灌区牛蒡栽培技术[J ].中国农技推广,2013,29(5):24-25.[6]袁媛,窦德强,康廷国.不同产地牛蒡子药材质量评价[J ].世界科学技术 中医药现代化,2008(3):75-77.[7]周传建.牛蒡药理作用的研究综述[J ].现代园艺,2011(16):6,14.[8]许亮,张建逵,卢淑君,等.牛蒡子药材中内果皮石细胞与牛蒡苷含量相关性研究[J ].时珍国医国药,2015,26(4):812-815.[9]许亮,窦德强,康廷国,等.不同产地牛蒡种质与药材质量的相关性评价研究[J 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