大蒜SOD的分离与提取

植物中SOD的分离提取及性质研究前言：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。

SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。

SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。

在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。

植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。

材料及方法：一、试剂(1) PH7.8 0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液(2) PH8.2 50mmol/l Tris-HCL(3)0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液:准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。

4℃冰箱中保存可用1～2d。

(4)7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液:准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。

4℃冰箱中保存可用2～3d。

(5)含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液:A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

一、实习时间：２０１１.１２.２８二、实习地点：生科实验室４０８三．实验题目：大蒜中SOD 提取及分离纯化１.实验目的：（１）学习并掌握大蒜SOD 提取与纯化的方法及原理。

（２）学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD 酶活的方法。

（３）熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。

２.实验原理：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O 2-) 的歧化反应，使 O 2-转化为 H 2O 2 和 O 2。

因此，SOD 是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。

SOD 是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD 、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 3种。

Cu/Zn-SOD 是分布最广而且是最重要的SOD ，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD ，一般由两个亚基组成。

SOD 对热、pH 以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60℃，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD 对氰化物及过氧化氢均敏感。

SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

Cu/Zn-SOD 由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm ，由于含铜，所以在可见光680nm 处有最大吸收。

国内测定SOD 活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。

在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O 2-）。

中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。

邻苯三酚的自氧化速率与O 2-的浓度有关。

当有SOD 存在时，由于它可催化超氧负离子(O 2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：222222O H O H O +=+-，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定目的1．掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

2．了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

试剂大蒜，磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)，氯仿—乙醇混合液冷丙酮，邻苯三酚，浓盐酸方法1．SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。

(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。

（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。

将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。

6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。

取1ml备用，其余量取体积。

2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力试验结果记录：1）2）蛋白质含量的测定：3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0总活力 U = 41.2蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09比活力 U/mg = 0.6568粗酶液: 酶活力单位U/ml = 1.3总活力 U = 12.78蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542比活力 U/mg = 0.3670酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8总活力 U = 65.96蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719比活力 U/mg = 9.45764）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56回收率 = 0.31酶液: 纯化倍数 = 14.40回收率 = 1.60实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。

铜锌SOD的分离纯化与活性鉴定【实验导读】蛋白质的提取分离技术是化学生物学研究者应该熟练掌握的重点技术之一。

蛋白质的纯化步骤应根据纯化蛋白的具体性质来设计。

可以利用到的性质包括蛋白质的分子量大小、蛋白质的等电点、对有机溶剂的耐受性、对温度的耐受性、中性无机盐对蛋白质溶解性的影响等等。

为了保证蛋白质提取分离纯化的成功，需要在整个实验过程中，对所得蛋白质的总量和活性进行不断监测。

SOD是超氧化物歧化酶的简称，是一个典型的酶类蛋白质。

它催化超氧化物的歧化反应，是真核生物细胞内抗氧化酶系的重要组成部分。

它能够耐受相对较高的温度、对有机溶剂丙酮和氯仿-乙醇也具有较好的耐受性。

利用这些性质，本实验通过一些列实验流程达到了对大蒜SOD进行初步纯化的目的。

每经过一个纯化步骤，本实验都将监测所得产物的总蛋白量以及总SOD活性，并计算SOD酶在总蛋白中的比活力（总SOD活性与总蛋白量之比）。

如果分离纯化过程是成功的，则总蛋白量应不断下降，而SOD酶的比活力应不断上升。

通过本实验的训练，读者应该能够初步掌握蛋白质的纯化流程，根据所给蛋白质的理化性质设计出一套比较合理的蛋白质纯化方案。

一、实验目的1.进一步熟悉掌握分光光度计的使用方.2.熟悉SOD提取与分离的基本原理与操作方法，学习一般蛋白质纯化的基本流程.3.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的基本原理与操作.4.了解SOD活力测定—邻苯三酚法的原理.二、基本原理对于以氧气作为呼吸作用最终电子受体的生物来说，除将氧气还原为其完全还原产物水以外，还有可能产生包括超氧负离子(O2-)在内的一系列不完全还原产物，这类分子统称为活性氧族(reactive oxygen species, ROS)。

ROS具有极强的化学反应活性，可以与蛋白质、脂类、核酸等生物大分子发生反应并破坏它们的结构与生物学功能。

ROS在细胞内聚集将对细胞的正常生命活动造成不良后果。

为了应对这一潜在的严峻挑战，细胞内形成了一套有效的ROS清除系统。

实验五制备大蒜SOD实验题目：实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD实验原料：新鲜蒜瓣约20g实验仪器：离心机超声波细胞破碎分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙酮、活性测定缓冲液参考书目：[1] 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 [J].中国卫生检验2000,12,10(6):673[2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].化学与生物工程.2005,(10):23～25[3] 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究[J].食品科学2004,34(5)[4] 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].吉首大学学报 .2003,24(4)qtw-1操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g↓可以数组合并进行。

组织捣碎机处理10min。

↓合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。

加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。

↓超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)↓搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液↓60℃热变性20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。

↓另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。

↓分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。

↓搅拌15 分钟，使沉淀完全。

4000rpm,15min 离心，收集沉淀↓注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。

部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。

qtw-2实验结果与分析数据整理：1、空离心管质量：第①组 4.131g第②组 4.056g粗体物与容器质量：第①组 4.265g第②组 4.223g产品质量：第①组 4.265-4.131=0.134g第②组 4.223-4.056=0.167g2、冰丙酮沉淀SODqtw-3冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。

大蒜中SOD活性的测定一、实验目的：（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

（3）掌握离心机的使用。

二、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。

当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。

三、实验试剂：大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根四、实验步骤：（1）SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。

(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。

（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）（3）SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。

将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。

6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。

取1mL备用，其余量取体积。

（4）粗酶液活性测定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。

加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。

大蒜中超氧化物歧化酶的提取及其酶活力测定一、实验目的：⒈掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

⒉了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

⒊掌握离心机的使用。

二、实验原理：邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。

邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。

颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

三、实验材料及试剂：大蒜、磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l）、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮、邻苯三酚（45mmoL/L）(焦性没食子酸)、浓盐酸四、操作步骤：1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15ml的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm 离心，弃去沉淀，得上清液。

(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2、除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm 离心15min去沉淀，得粗酶液。

（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm 离心15min，得到SOD酶沉淀。

将沉淀每管先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml 混匀。

6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。

取1ml备用，其余量取体积。

4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法）提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。

加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值.5、溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 –0.74A260) ×稀释倍数6、计算：酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力五、实验数据记录及结果计算：1、提取液、粗酶液、酶液体积记录(除去留下的1ml)2、420nm吸光值测定：3、稀释后的SOD提取液280nm\260nm吸光值：4、按公式计算蛋白质浓度：稀释提取液中蛋白质浓度：（1.45×0.055－0.74×0.082）×50=0.9535mg/ml 稀释粗酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.098－0.74×0.144）×20=0.7108mg/ml 稀释酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.030－0.74×0.040）×10=4.054mg/ml5、酶活力单位、总活力、比活力计算：6、粗酶液：纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=35.9595/15.1023=2.3811回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=25.56/14.4×100%=177.5%酶液：纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=5.6167/15.1023=0.3719回收率=酶液总活力/提取液总活力=22.77/14.4×100%=158.1%。

大蒜中超氧化物歧化酶的提取及其酶活力测定一、实验目的：⒈掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。

⒉了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。

⒊掌握离心机的使用。

二、实验原理：邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。

邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。

颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

三、实验材料及试剂：大蒜、磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l）、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮、邻苯三酚(焦性没食子酸)、浓盐酸四、操作步骤：1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15ml的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm 离心，弃去沉淀，得上清液。

(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2、除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm 离心15min去沉淀，得粗酶液。

（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm 离心15min，得到SOD酶沉淀。

将沉淀每管先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml 混匀。

6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。

取1ml备用，其余量取体积。

4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法）提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。

加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值.5、溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 –0.74A260) ×稀释倍数6、计算：酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力五、实验数据记录及结果计算：1、提取液、粗酶液、酶液体积记录(除去留下的1ml)2、420nm吸光值测定：3、稀释后的SOD提取液280nm\260nm吸光值：4、按公式计算蛋白质浓度：稀释提取液中蛋白质浓度：（1.45×0.055－0.74×0.082）×50=0.9535mg/ml 稀释粗酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.098－0.74×0.144）×20=0.7108mg/ml 稀释酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.030－0.74×0.040）×10=4.054mg/ml5、酶活力单位、总活力、比活力计算：6、粗酶液：纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=35.9595/15.1023=2.3811回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=25.56/14.4×100%=177.5%酶液：纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=5.6167/15.1023=0.3719回收率=酶液总活力/提取液总活力=22.77/14.4×100%=158.1%。

本科生课程论文封面课程名称 现代生化技术授课学期 学年至 学年第 学期学院 漓江学院专 业 生物技术组 员李翠200913007007王志远200913007008任课教师 刘晓灿老师交稿日期 2010年10月成绩阅读教师签名日 期广西师范大学大蒜细胞SOD的提取与分离【摘要】 SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。

对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化.抗衰老.抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用PH8.7的磷酸缓冲液。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

然后根据SOD抑制肾上腺素自氧化的效率，可间接测出SOD酶的活力。

【关键词】：超氧化物歧化酶歧化反应酶活力【引言】超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。

1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。

超氧化物歧化酶广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属酶类。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子（O2）是人体氧代谢产物，它在体内过多积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

【正文】本实验使用的是大蒜细胞中的超氧化物酶，利用SOD不溶于丙酮，可用丙酮将大蒜中的SOD 析出。

实验五大蒜细胞SOD的提取和活力测定一、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

SOD酶活性测定原理：核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入氮蓝四唑（NBT）后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。

当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。

通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值。

二、材料和试剂1．提取试剂：（1）.新鲜蒜瓣（2）.0.05mol/L/0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）（3）.氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5（4）.丙酮：用前需预冷至4-10℃2．测活试剂：（1）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。

4℃冰箱中保存可用1～2d。

（2）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。

4℃冰箱中保存可用2～3d。

（3）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

实验五制备大蒜SOD实验题目：实验原理: 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD实验原料：新鲜蒜瓣约20g实验仪器：离心机超声波细胞破碎分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙醇、预冷丙酮、活性测定缓冲液参考书目：[1] 李永利,张众.邻苯三酚自氧化法测定活性 [J].中国卫生检验2000,12,10(6):673[2] 孙永君. 大蒜中SOD 的提取研究[J].化学与生物工程.2005,(10):23～25[3] 邹芝芳,刘佳佳.三种大蒜中提取SOD 的对比研究[J].食品科学2004,34(5)[4] 张丽,罗丽萍,谷力.大蒜SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性[J].吉首大学学报 .2003,24(4)qtw-1操作记录：制备大蒜SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g↓可以数组合并进行。

组织捣碎机处理10min。

↓合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。

加入50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。

↓超声破碎(5s+10s)40 times (冰水浴)↓搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液↓60℃热变性20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。

↓另取适量体积的(20ml)滤液，加2 倍体积的氯仿-乙醇(3：5)，于分液漏斗中振荡5min。

↓分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。

↓搅拌15 分钟，使沉淀完全。

4000rpm,15min 离心，收集沉淀↓注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。

部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。

qtw-2实验结果与分析数据整理：1、空离心管质量：第①组 4.131g第②组 4.056g粗体物与容器质量：第①组 4.265g第②组 4.223g产品质量：第①组 4.265-4.131=0.134g第②组 4.223-4.056=0.167g2、冰丙酮沉淀SODqtw-3冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm下高速离心出现淡黄色沉淀。

一、实验目的1. 了解大蒜中SOD的提取方法及其酶活力测定原理。

2. 掌握大蒜中SOD的提取与分离实验步骤。

3. 分析大蒜中SOD的提取效果及酶活力。

二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子进行歧化反应，从而降低细胞内的氧自由基浓度，保护细胞免受氧化损伤。

大蒜中含有丰富的SOD，本实验旨在通过提取和分离大蒜中的SOD，研究其酶活力，为后续研究提供实验数据。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜大蒜、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）、无水乙醇、氯仿、硫酸铵等。

2. 实验仪器：电子天平、高速冷冻离心机、超声波破碎仪、分光光度计、恒温培养箱等。

四、实验步骤1. 大蒜SOD的提取（1）称取150g新鲜大蒜蒜瓣，研磨2倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨至浆状。

（2）静置20min，使SOD充分溶解到缓冲液中。

（3）4℃下以8000r/min离心10min，取上清液。

2. 除杂蛋白（1）取上清液，加入硫酸铵至饱和，静置2h。

（2）4℃下以8000r/min离心10min，收集沉淀。

（3）用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）溶解沉淀，透析过夜。

3. SOD的纯化（1）将透析后的溶液用氯仿-甲醇（体积比2:1）沉淀蛋白质，静置2h。

（2）4℃下以8000r/min离心10min，收集沉淀。

（3）用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）溶解沉淀，透析过夜。

4. SOD酶活力测定（1）取一定量的SOD样品，加入0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）稀释至适当浓度。

（2）取0.1ml稀释后的SOD样品，加入0.1ml0.1mol/L邻苯三酚溶液，37℃下反应5min。

（3）立即加入0.1ml0.02mol/LHCl终止反应。

（4）在波长320nm下测定吸光度。

（5）计算酶活力。

五、实验结果与分析1. 大蒜SOD的提取效果根据实验结果，本实验成功提取了大蒜中的SOD，提取率约为0.5%。

实验四大蒜细胞SOD的提取和分离实验目的本实验的主要目的是通过对大蒜细胞中SOD的提取和分离，进一步了解SOD酶的性质和结构，为后续的研究奠定实验基础。

实验原理超氧化物歧化酶（SOD），是一种钴酶类的抗氧化酶，广泛存在于大多数细胞中，其主要作用是催化超氧自由基（O2.-）的消除反应，将其转化为氧气和过氧化氢。

SOD的主要作用是稳定细胞内部的氧气，保护细胞免遭氧化破坏，同时也具有防止免疫炎症、抗癌和减轻辐射损伤等多种生理功能。

大蒜细胞中含有多种酶类，其中包括超氧化物歧化酶。

为了提取大蒜细胞中的SOD酶，需要经过以下几个步骤：（1）细胞破碎细胞壁是细胞的第一道障碍。

由于大蒜细胞的细胞壁比较坚硬，所以在提取SOD酶之前，需要先将细胞壁破碎。

这可以通过在液氮中冻结蒜瓣，然后将其粉碎。

随后使用磨菇研钵将蒜瓣粉碎，直到细胞完全破碎。

（2）制备提取液对于大蒜细胞的SOD酶提取，最常用的缓冲液是磷酸盐缓冲液（pH 7.0-8.0）。

缓冲液可以促进酶的保持，并且可以调节溶液的酸碱度。

在制备提取液的过程中，加入组织抑制剂可以抑制其他酶的活性。

（3）离心在将破碎后的大蒜细胞加入提取液之前，需要先将其用离心机离心。

这样可以将细胞碎片和蛋白质分离，避免其与SOD结合并降低SOD的提取效率。

离心过程中，应将速度逐渐加快以分离出不同分子量的组分。

（4）氨基酸分析提取出的SOD酶含有不同的氨基酸成分，可以通过氨基酸分析的方法进一步判断其组成。

实验步骤（1）取5-10g鲜大蒜蒜瓣，进行清洗，切碎成小块；（2）将碎好的蒜瓣放入液氮中冷冻至-20℃，然后取出，加入50mL磷酸盐缓冲液中，并加入10μL组织抑制剂，使用研钵将蒜瓣磨碎至细胞裂解；（3）将混合液转入离心管中，用1000×g离心20min，分离上清液；（5）对提取出的SOD酶进行氨基酸分析，确定其化学组成。

实验结果与分析实验中成功提取出了大蒜细胞中的SOD酶，并进行了氨基酸分析。

大蒜SOD的提取与分离一、实验目的：1、熟悉大蒜SOD的提取与分离方法2、掌握SOD活力测定—NBT光化还原法的原理3 熟悉G-250法对蛋白浓度的测定以及PAGE电泳的操作方法二、实验的原理1、通过研磨和高速离心的方法粗提大蒜SOD,再经过丙酮沉淀得到SOD酶液2、由于SOD是含金属辅基的酶，通过氮蓝四（NBT）光还原法测定酶的活性。

NBT在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，在560nm处有最大光吸收。

SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。

3考马斯亮蓝G250与蛋白质通过疏水结合作用后，变为蓝色，在波长为595nm处测得吸光度，用EXCEL软件得出标准曲线，从而得到待测的蛋白浓度。

三、实验的材料和试剂（1）新鲜蒜瓣；（2）磷酸buffer（0.05mol/L，pH7.8）；（3）氯仿：无水乙醇（3:5，V/V）；（4）丙酮，冷却至4~10℃四、实验步骤1、SOD的提取，15min）3五、结果分析1、SOD活力测定—NBT光化还原法试剂：（1）0.026mol/L蛋氨酸（Met）溶液；（2）75×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液；（3）1.0μmol/LEDTA及2×10-5mol/L核黄素溶液。

表1 反应各系统中试剂用量（ml）的2盏20W日光灯下照光15分钟，然后立即遮光停止反应，于560nm以第一号杯调零，测定光密度。

以2、3号杯液光密度的平均值作为还原率100%，分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率，作出二者相关曲线（以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标），找出50%抑制的酶液量（μl）作为一个酶活单位。

结果计算：SOD活力按下式计算：V×1000×60A= ————————B×W×T式中A：酶活力（酶活力单位·g –1FW·h–1）；V：酶提取液体积（ml）；B：一个酶活单位的酶液量（μl）；W：样品鲜重（g）；T：反应时间（min）。