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阿维菌素补糖工艺的初步研究李军华高鹤永郑智新【摘要】摘要:目的研究阿维菌素在发酵过程中的补糖工艺，提高阿维菌素的产量。
方法利用180m 3通用发酵罐研究补糖工艺，通过定时定量、定时匀速流加、变速流加三种不同的补糖方式，分别加入经过液化和糖化的淀粉。
结果变速流加糖化淀粉的补糖方式较其它组效价高。
结论新工艺为阿维菌素高产奠定基础。
【期刊名称】生物技术世界【年(卷),期】2012(000)004【总页数】3【关键词】阿维菌素补糖工艺液化糖化淀粉阿维菌素是由阿维链霉菌(Streptomyces aver-mitilis)生产的一组由十六元大环内酯与一个二齐墩果糖所构成的一类杀虫抗生素，在医药、农业及畜牧业上有着重要的应用，已在我国大量使用，并是我国出口的第二大的杀虫剂品种。
目前，阿维菌素的生物合成是阿维链霉菌的研究主要内容[1]，国内对阿维菌素研究主要集中在诱变育种和发酵工艺优化[2]。
补料工艺是其中的一个主要工艺，国内研究补料主要是研究加入葡萄糖的的方法和方式，为降低生产成本，我们尝试在工业化生产中加入液化和糖化的淀粉，分别通过三种不同的方式加入，优化补糖工艺，实现阿维菌素高产和低成本。
1 实验材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种阿维链霉菌由河北威远生物化工股份有限公司提供。
1.1.2 培养基种子培养基配比发酵培养基配比1.2 培养方法与补糖1.2.1 培养基组分一级种子罐为500L，培养基(g/L)：玉米淀粉30，黄豆饼粉10，酵母粉5，PH 6.8～7.1二级种子罐为30m3，培养基(kg/ m3)：玉米淀粉30，黄豆饼粉10，酵母粉5，PH 6.8～7.1发酵罐为180m3，培养基(kg/ m3)：玉米淀粉12，黄豆饼粉2.5，酵母粉1，PH 6.5～6.91.2.2 淀粉的液化与糖化(1) 液化：先将淀粉糊化，然后用α—淀粉酶处理，制得含有糊精、低聚糖、葡萄糖等的糖液，简称液化糖，经检测其中总糖28%、还原糖7%。
2024年阿维菌素原药市场发展现状引言阿维菌素是一种广谱抗生素，对多种细菌感染有效。
由于其治疗效果明显，阿维菌素原药市场迅速发展。
本文将对阿维菌素原药市场的发展现状进行分析和探讨。
阿维菌素原药市场概述阿维菌素原药是指未经加工和深加工的阿维菌素产品。
在原药市场上，阿维菌素原药是一种重要资源，被广泛应用于制药、医疗等领域。
市场上的阿维菌素原药主要分为两种：天然来源的阿维菌素和合成阿维菌素。
阿维菌素原药市场的发展趋势市场规模持续扩大随着世界范围内细菌感染疾病的增多，阿维菌素的需求量也在不断增加。
据市场调研机构数据显示，阿维菌素原药市场的规模正在持续扩大，预计在未来几年内仍将继续增长。
技术创新推动市场发展阿维菌素原药市场在技术方面也不断创新。
一方面，新的合成方法使得阿维菌素原药的生产更加高效和经济；另一方面，基因工程技术的应用使得阿维菌素的天然产生量显著提高。
这些技术创新不仅提高了阿维菌素原药的质量，也降低了生产成本，促进了市场的发展。
医疗水平提高助推市场增长随着医疗水平的提高，人们对阿维菌素的需求也随之增长。
特别是在新兴市场和发展中国家，细菌感染疾病的治疗需求大幅增加，进一步推动了阿维菌素原药市场的增长。
阿维菌素原药市场的挑战和机遇市场竞争加剧随着阿维菌素原药市场的逐渐成熟，竞争也日趋激烈。
不仅来自国内生产商的竞争，国际市场上的进口原药也给市场带来了一定的竞争压力。
生产商需要不断提高产品质量和降低生产成本，以在激烈竞争中保持竞争优势。
监管政策的影响阿维菌素原药市场受到监管政策的严格影响。
各国对阿维菌素原药的质量和安全性有着严格的要求，对进口原药进行了严格的检测和审批。
不合格产品的禁止销售和使用，增加了生产商的质量控制成本。
疫情的影响近年来的全球疫情对阿维菌素原药市场也产生了一定的影响。
疫情导致全球医疗资源的紧张和需求的剧增，进一步推动了市场对阿维菌素原药的需求。
然而，疫情也带来了一些负面影响，如供应链中断、生产能力下降等，给市场带来一定的挑战。
2024年阿维菌素市场发展现状1. 引言阿维菌素（Avermectin）是一种广谱抗生素，被广泛应用于农业领域，用于防治各种农作物病虫害。
自20世纪70年代发现并投入市场以来，阿维菌素市场一直保持着快速增长的态势。
本文旨在探讨阿维菌素市场的发展现状，包括市场规模、竞争格局、应用领域和发展趋势等方面的内容。
2. 阿维菌素市场规模阿维菌素作为一种高效、低毒的农药，具有广泛的应用前景，其市场规模逐年扩大。
据统计，2019年全球阿维菌素市场规模达到XX亿美元，预计到2025年将超过XX亿美元。
中国是全球阿维菌素的主要生产和消费国家，占据了全球市场规模的30%以上。
3. 阿维菌素市场竞争格局目前，全球阿维菌素市场竞争激烈，主要的竞争企业包括巴斯夫、辉瑞、拜耳、杀虫宁等。
这些企业通过技术创新、产品质量和价格竞争等手段来争夺市场份额。
此外，一些新兴企业也以其自主研发的阿维菌素产品进入市场，并逐渐崭露头角。
4. 阿维菌素应用领域阿维菌素在农业领域的应用非常广泛，包括作物保护、畜禽养殖和水产养殖等方面。
在作物保护方面，阿维菌素可用于防治多种病虫害，如蚜虫、红蜘蛛、钻心虫等，对提高作物产量和质量起到积极作用。
在养殖方面，阿维菌素可用于预防和治疗畜禽寄生虫病，提高养殖效益。
此外，阿维菌素还可以应用于水产养殖，防治鱼病等。
5. 阿维菌素市场发展趋势随着全球农业产业的发展和对食品安全的要求越来越高，阿维菌素市场有望继续保持增长势头。
未来发展趋势主要包括以下几个方面：•技术创新：企业将加强对阿维菌素的研发，提高产品的技术含量和市场竞争力。
•拓展应用领域：阿维菌素有望在新的应用领域发挥更多作用，如环境保护、人畜共患病的防控等方面。
•市场国际化：中国企业将加强国际市场拓展，提高产品在国际市场的份额。
•环保要求：阿维菌素生产过程中的环保问题将受到更多关注，企业需加强环保措施，提高产品的可持续发展性。
6. 结论阿维菌素市场在近几年取得了快速增长，未来仍然具有良好的发展前景。
阿维菌素的研究现状和前景分析【摘要】阿维菌素化学结构新颖，作用机制独特，是目前应用最广泛的生物农药。
本文阐述了阿维菌素的结构，作用机制，优缺点，介绍了如何正确使用阿维菌素，并对阿维菌素的未来应用前景进行了展望。
【关键词】阿维菌素；结构；作用机制；优缺点；应用前景中国作为一个农业大国，农业支撑着整个国民经济的发展，而农药作为保证粮食高产的重要的防治害虫的方法，越来越受到人们的重视，随着频频出现的粮食安全问题，农药残留造成的危害逐渐引起人们的注意，开发一种新型安全环保的农药也逐渐提上日程。
农药的各项检测标准也越来越严格，高残留农药逐渐遭到限制，甚至被淘汰。
在这一背景下，开发一种性能良好，既安全又环保的生物农药迫在眉睫[1]。
从1994年第一个阿维菌素乳油取得临时登记上市至今，已有将近二十年，阿维菌素作为一种高效人们普遍认可的生物农药制剂，已经广泛应用到农作物害虫害螨的防治中[2]。
1.阿维菌素的结构阿维菌素的分子式为c48h72o14（b1a）·c47h70o14（b1b），含b1a≥90%，是一组16元大环内酯类化合物，易溶于有机溶剂，相对密度为1.16，熔点150～155℃，蒸气压低于200npa，常温下相对稳定，不容易分解[3]。
阿维菌素是由灰色链霉菌发酵产生的，共有8种结构相似的组分，包括a1a，a2a，b1a，b2a（>80%）和a1b，a2b，b1b，b2b（<20%），这八种组分都对多种害虫有极强的杀灭作用，尤其是阿维菌素b1 的杀虫活性最高，且毒性却最小，是阿维菌素类农药中起到杀虫作用的主要组成成分。
[4-6]2.阿维菌素的作用机制阿维菌素作为新型生物农药的主力军，具有高效低毒、抗虫谱较广的优点。
它对动物体内外寄生虫尤其是对节肢动物和体内线虫有较好的预防和杀害作用。
阿维菌素的作用机制为：阿奇菌素作用于昆虫外周神经系统内的神经元突触或神经肌肉突触的γ-氨基丁酸（gaba）系统[7]。
《阿维菌素纳米制剂的制备及其对芹菜中次生代谢产物的影响》一、引言阿维菌素作为一种重要的生物农药，具有广谱、高效、低毒等优点，被广泛应用于农业病虫害的防治。
然而，阿维菌素在传统制剂中的溶解性和稳定性较差，限制了其应用效果。
近年来，纳米技术的兴起为阿维菌素的改良提供了新的途径。
本论文主要探讨阿维菌素纳米制剂的制备及其对芹菜中次生代谢产物的影响。
二、阿维菌素纳米制剂的制备1. 材料与方法本实验采用溶胶-凝胶法，以阿维菌素为原料，选用适当的表面活性剂和溶剂，通过控制反应条件，制备阿维菌素纳米制剂。
同时，我们选用了不同大小的纳米载体，以优化制剂的释放性能和生物利用度。
2. 制备过程制备过程包括溶剂选择、表面活性剂的添加、溶胶-凝胶转化、纳米粒子的形成与分离等步骤。
在实验过程中，我们严格控制了反应温度、时间、pH值等参数，以保证纳米粒子的质量和稳定性。
3. 制剂表征通过透射电镜、动态光散射等技术对制备的阿维菌素纳米制剂进行表征，结果显示纳米粒子分布均匀，粒径大小适中，具有良好的稳定性和溶解性。
三、阿维菌素纳米制剂对芹菜中次生代谢产物的影响1. 实验设计选择健康芹菜作为实验材料，分别采用阿维菌素传统制剂和纳米制剂进行喷施处理。
通过测定处理后芹菜中次生代谢产物的含量及组成变化，分析两种制剂对芹菜生长及次生代谢的影响。
2. 结果与讨论实验结果显示，阿维菌素纳米制剂处理后的芹菜中次生代谢产物的含量明显高于传统制剂处理组。
这可能是由于纳米制剂具有更好的渗透性和释放性能，能够更好地促进植物对营养物质的吸收和利用。
此外，纳米制剂还可能通过调节植物体内激素水平、酶活性等生理过程，促进植物的生长和发育。
进一步分析发现，不同种类的次生代谢产物对阿维菌素纳米制剂的响应程度存在差异。
这可能与植物自身的遗传特性、生长环境等因素有关。
因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的制剂类型和施用方法。
四、结论本论文研究了阿维菌素纳米制剂的制备及其对芹菜中次生代谢产物的影响。
阿维菌素产业发展现状
阿维菌素（Abamectin）是一种高效、广谱、低毒的农药，也是一种重要的抗寄生虫药物。
其广泛应用于农业生产中，可以用于防治多种害虫和寄生虫，对提高农作物产量和质量具有显著效果。
阿维菌素产业在过去几十年中得到了快速发展。
首先是阿维菌素的生产技术不断提升，从最初的传统生产方法逐渐发展到现代生物技术制备方法，大大提高了产量和纯度。
生产成本的降低也使得阿维菌素的价格相对较低，更容易被广大农民接受和使用。
其次，阿维菌素在农业生产中的应用范围不断扩大。
除了广泛用于农作物防治，还可以用于养殖业，防治畜禽寄生虫。
随着人们对食品安全和环境保护的要求不断提高，对阿维菌素的需求也在逐年增加。
随着阿维菌素产业的发展，市场竞争也越来越激烈。
国内外许多企业都在研发和生产阿维菌素，提高产品质量和技术含量。
同时，相关政府部门也加强了对阿维菌素生产和使用的监管，确保产品的安全性和环境友好性。
未来，阿维菌素产业将面临一些挑战和机遇。
一方面，需求增长和市场前景广阔，为企业提供了发展的机遇。
另一方面，技术创新和市场竞争将是重要的因素，促使企业不断提高产品质量和降低成本。
总之，阿维菌素产业在过去几十年中取得了快速发展，在农业生产中发挥着重要作用。
随着农业和环境保护需求的不断提高，阿维菌素产业有望继续发展壮大。
阿维菌素生物合成机制阿维菌素是一种广谱抗生素，被广泛应用于临床治疗中。
那么，阿维菌素是如何被生物合成的呢？阿维菌素的生物合成机制主要经过以下几个步骤：1. 基因组中阿维菌素基因的转录和翻译阿维菌素基因位于细菌基因组中，通过基因的转录和翻译过程，将基因序列转换为阿维菌素的生物合成酶。
这些生物合成酶是阿维菌素生物合成的关键酶。
2. 阿维菌素前体的合成阿维菌素的生物合成始于阿维菌素前体的合成。
阿维菌素前体是由一系列的化学反应逐步合成而成的。
首先，酸性酮酸通过羧化酶催化反应被转化为羧基酸。
然后，羧基酸经过内酯化反应，形成了阿维菌素的前体物。
这一步骤是阿维菌素生物合成的关键步骤。
3. 阿维菌素前体的环化和修饰阿维菌素前体被阿维菌素生物合成酶催化，使其发生环化反应。
在环化过程中，阿维菌素前体的一部分被切割掉，形成了阿维菌素的环状结构。
同时，阿维菌素前体还会经过一系列的修饰反应，如甲基化、氧化、脱水等，进一步调节阿维菌素的结构和活性。
4. 阿维菌素的成熟和释放经过环化和修饰后，阿维菌素已经具备了其特定的结构和功能。
然而，它还需要进一步的成熟和释放过程。
这个过程主要由阿维菌素酶催化，将阿维菌素与其他分子结合，并将其从细胞内释放到外部环境中。
总结起来，阿维菌素的生物合成机制主要经历了基因的转录和翻译、阿维菌素前体的合成、阿维菌素前体的环化和修饰以及阿维菌素的成熟和释放等步骤。
这一系列反应需要依赖于特定的生物合成酶，通过催化作用，将不同的化学物质转化为阿维菌素的前体物和最终的成熟阿维菌素。
这一生物合成机制的研究，为我们深入了解阿维菌素的合成过程和调控机制提供了重要的基础。
同时，也为我们进一步改良和开发新的抗生素提供了借鉴和启示。
山东畜牧兽医2019年第40卷72阿维菌素生物合成基因结构研究进展李淑焕（山东农业工程学院食品科学与工程学院山东济南250100）薄永恒*（山东省兽药质量检验所山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室山东济南）中图分类号：S852.6 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2019)07-0072-03寄生虫病是动物常见的疾病，对畜牧养殖造成比较大危害。
每年，寄生虫感染动物从而造成的社会损失超过30多亿美元。
从Fleming发现青霉素到现在，人们已经发现39000多种不同作用的抗生素。
杀伤各种寄生虫的抗生素却不是很多，其中大多数是作用于真菌和细菌的。
可以杀死寄生虫的抗生素也就只有十几种，因为寄生虫和宿主之间对抗生素敏感性一般差别小，在实际应用方面效果比较差。
一般一种抗生素只能杀死一种或几种寄生虫，他们的抗虫谱也比较窄。
阿维菌素是由阿维链霉菌分泌出的一种次级代谢产物，是迄今为止发现最有效的生物杀死寄生虫的药物，是农业部推荐的一种的高效低毒的兽用药品，具有良好的应用价值和广阔的市场前景。
目前，阿维链霉菌育种技术主要有自然选育、诱变育种、基因重组、代谢控制育种、基因工程育种等方法。
本文主要从阿维菌素生物合成关键调控基因的研究进行探讨，为后期基因工程育种打造理论基础。
1 阿维菌素生物合成基因结构组成（1）已知许多抗生素生物合成基因都是成簇排列的，阿维链霉菌也是如此。
阿维链霉菌生物合成基因簇大约有90kb，这一部分是阿维链霉菌生物合成的关键点，其间82kb的连续区域被测通，从而获得的区域的结构如图2所示。
与已知的I型多功能聚酮合酶(PKS)的模块(module)结构进行比较，红霉素[1-2]、苦霉素[3]、利福霉素[4]多功能PKS的编码模块结构都比阿维链霉菌的要简单。
这个区域有18个开放阅读框(ORF)。
在转录方向上，编码利福霉素PKS的10个模块和编码红霉素PKS模块方向一致，而aveA1-aveA2和ave3-ave4两部分组成了阿维链霉菌PKS的12个编码模块，但是有6个模块与另外6个模块的转录方向是相反的。
第17卷 第3期 2007年3月阿维菌素的生物合成研究进展与展望*陈 芝 宋 渊 文 莹 李季伦**中国农业大学生物学院微生物系,北京100094 2006-07-19收稿,2006-08-18收修改稿 *国家重点基础研究发展计划资助项目(批准号:2003CB114205) **通信作者,E -mail :lijilu n @摘要 阿维链霉菌(S treptom yces avermitilis )由于可以产生杀虫抗生素———阿维菌素而备受研究者的青睐.多年来该菌得到了全面系统的研究,其基因组序列也已测定.文中综述了阿维链霉菌中阿维菌素生物合成代谢途径方面的研究,并对后续研究进行展望.关键词 阿维链霉菌 阿维菌素 次级代谢 生物合成 基因工程 组合生物合成1 阿维链霉菌及其基因组信息阿维菌素的产生菌———阿维链霉菌(S trepto -myces avermitilis )是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk 公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域.与其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域[1—5].链霉菌中天蓝色链霉菌(S treptomy ces coelicol -or )A3(2)[6]、阿维链霉菌MA -4680[7]和S trepto -myces div ersa 的基因组序列已被测定,此外还有一些链霉菌(S.noursei ,S.ambo faciens ,S.peucetius 和S.scabies )的基因组正在测定中(http ://w w w.geno mesonline.o rg /search.cgi ).对它们的基因组序列的比较将为这些微生物的研究提供有价值的信息.阿维链霉菌的线状染色体大小为9025608bp ,G +C 含量为70.7%,至少包含7577个开放阅读框(ORF ),编码区占基因组的86.2%.O RF 平均大小为1034bp.阿维链霉菌还含有一个线性质粒SAP1,大小为94287bp ,G +C 含量为69.2%,含有96个O RF ,编码区占质粒的79.0%.在阿维链霉菌的基因组中,大多数必需基因都位于一个高度保守的6.5M b 的内部区域.染色体上靠近端粒的位置有两个保守性低的亚端粒区(subtelome ric re -gio ns ).有趣的是,50%以上的与次级代谢合成有关的基因(包括阿维菌素的生物合成基因)都位于亚端粒区,而在亚端粒区没有发现已知的必需基因.此外,亚端粒区含有基因组中大部分的转座因子[7].这些基因位于亚端粒区可能与阿维链霉菌的遗传不稳定性有关,在对阿维链霉菌培养过程中我们经常得到一些形态分化的突变株(光秃型突变株和白色突变株等),有些突变株同时丧失了合成阿维菌素的能力.在阿维链霉菌的线状染色体上有30个基因簇与次级代谢合成有关,共有271个基因,占基因组的6.6%.它们广泛地分布于染色体上,但有一半位于染色体的末端.在质粒SA P1上没有发现与次级代谢有关的基因簇[7,8].在30个与次级代谢有关的基因簇中,有4个与黑色素的合成有关,其中两个负责酪氨酸酶及其辅酶的合成,另外两个分别与由尿黑酸生成的赭色色素和聚酮结构的黑色素的合成有关;合成类胡萝卜素和铁载体的基因簇分别由7个和5个基因组成;此外,有8个基因簇与非核290糖体肽类化合物的合成有关,还有4个基因簇与萜类化合物的合成有关.在30个次级代谢的基因簇中,有9个基因簇含有Ⅰ型PKS基因(polyketide sy nthase),2个基因簇含有Ⅱ型PKS基因.目前已有3个Ⅰ型PKS合成的化合物被鉴定,它们分别是阿维菌素、寡霉素以及菲律宾菌素(filipin)的衍生物—pentaene[8].阿维链霉菌和其他链霉菌的基因组计划必将极大地推动对链霉菌形态分化和次级代谢的研究,最终揭示链霉菌复杂的调控网络.2 阿维菌素的生物合成基因簇阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一组结构相似的十六元环大环内酯类抗生素.阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分:A1a,A1b,A2a,A2b,B1a, B1b,B2a和B2b,它们的区别主要在于C-5,C-22, 23和C-26位所连接的基团不同(图1).Cane等通过在阿维菌素合成过程中掺入相应的13C标记的化合物,表明阿维菌素的大环内酯是由7个乙酸盐, 5个丙酸盐和1个带有支链的脂肪酸首尾聚合而成[9].“a”组分的2-甲基丁酰基(C25-C28)和“b”组分的异丁酰基(C25-C27)分别由L-异亮氨酸和L-缬氨酸衍生而成[10].齐墩果糖由葡萄糖直接转化而来[11].阿维菌素中C-5,C-3′和C-3″位上的甲氧基均来自L-甲硫氨酸.图1 阿维菌素及伊维菌素结构图 Ikeda等利用标记底物结合分析突变株累积中间产物的策略,已基本阐明阿维菌素生物合成的全过程[1],并对阿维菌素合成的全基因簇序列进行了功能分析[2].该基因簇全长82kb,共有18个开放阅读框(图2).基因簇内部的60kb片段含有4个大的阅读框(ave A1-aveA2)和(aveA3-av eA4),共同编码多功能的PKS,该聚酮合酶由12个模块组成,共有55个活性位点,负责1个支链脂肪酸、7个乙酸盐和5个丙酸盐的聚合反应.每个合酶单位(S U)都由缩合酶(KS)-酰基转移酶(A T)-酰基载体蛋白(ACP)组成,有些SU还含有酮基还原酶(KR)和脱水酶(DH)活性位点.每个SU负责一步掺入前体如乙酸或丙酸的聚合反应及β-酮基的还原程度,最后所形成的聚酮体在位于PKS末端的硫酯酶(T E)的作用下成环内酯化.aveC和aveE基因位于aveA1-aveA2和aveA3-ave A4基因之间,与聚酮体的修饰291 第17卷 第3期 2007年3月有关[12];在基因簇的右侧邻近av eA 4基因的上游,是一套涉及合成和转移齐墩果二糖的8个基因(av eB I —aveB VI I I );紧邻aveA 1的上游(左方)是编码C5-O -甲基转移酶的aveD 基因,该基因负责将甲基转给阿维菌素B 的C -5位的-OH 从而形成阿维菌素A.aveF 紧邻aveD 的下游,两者转录方向一致,可能属于同一转录单位[1].aveF 编码C5-酮基还原酶,催化C -5位的酮基还原成羟基.aveR 位于aveF 的下游(但转录方向相反),它可能是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因[2].aveR 突变株不能合成任何阿维菌素,也不能转化阿维菌素糖苷配基,对该基因序列分析表明具有H -T -H 结构,但是aveR 如何调控阿维菌素生物合成有待于进一步研究.图2 阿维菌素生物合成基因簇[2]3 阿维链霉菌的基因工程改造阿维菌素的生物合成途径已基本阐明,相关合成基因已被克隆和测序,阿维链霉菌的基因组序列也已清楚.这为利用基因工程手段改造阿维菌素生物合成基因簇从而对发酵产物进行有效的控制,以及合成新的阿维菌素衍生物及提高阿维菌素的产量提供了可能.目前对阿维链霉菌中代谢途径的改造主要集中在以下几个方面.3.1 菌株高产性能的提高阿维菌素是重要的杀虫抗生素,提高阿维菌素的产量具有重要的意义.在链霉菌中,次级代谢产物的生物合成是一个复杂的过程,受到不同水平的调控[13].抗生素的生物合成除受途径专一调节基因(pa thw ay -specific reg ula to ry gene )控制之外[14],还受多效调控基因(pleio tro pic regulatory genes )的控制,如aba A ,abaB ,af sQ 1和a f sQ2等[15],其次还受到其他调控因子,如ppGpp ,A 因子和磷酸盐等的调控[16—18].Lee 等利用Southe rn 杂交在阿维链霉菌中检测到了与S.lividans 中a f sR2基因的同源基因,将多拷贝的a f sR 2基因分别转入阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中,阿维菌素的生物合成分别提高了2.3倍和1.5倍[19].H w ang 等曾直接将一段包含编码膜蛋白or f X 的克隆片段(8.10kb )转入野生型阿维链霉菌,刺激了阿维菌素的生物合成,可使阿维菌素的合成提高近3.5倍[20].对位于aveR 基因上游的av eR1,aveR 2基因进行全部或部分缺失,可使阿维菌素的产量提高3倍多[21].王晓芳等[22]对阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中aveR1,aveR2基因分别进行基因缺失,野生型菌株阿维菌素的合成提高了3倍多,但高产菌株产量基本没有提高,可能是高产菌株经历了多次的诱变,其调节基因可能发生了改变.这些结果表明虽然常规诱变育种是菌种选育的有效手段,但是利用基因工程手段也有可能进一步提高菌株的生产能力.Xiong 等利用PCR 介导的基因中断技术对bkdF 基因进行阻断,获得的突变株不再合成阿维菌素,只产生寡霉素,而且寡霉素的产量由原来的0.1mg /m L 提高到2.3mg /mL [23].这可能是由于阿维菌素和寡霉素都具有聚酮体结构,拥有共同的底物,阿维菌素合成被阻断导致了代谢流流向了寡霉素的合成.292 第17卷 第3期 2007年3月3.2 菌株发酵性能的提高阿维菌素的发酵是一个好氧的生物过程,一般对氧的需求比较敏感.由于氧在水中的低溶解性,在大规模深层发酵中,溶氧常成限制因素.文莹等通过将透明颤菌血红蛋白(VH b)基因置于硫链丝菌素诱导的启动子PtipA之下,转入阿维链霉菌,经摇瓶实验证实,表达的V H b蛋白在氧限条件下会明显促进阿维链霉菌的生长和阿维菌素的合成,而且在发酵液中溶氧状况越差,V Hb蛋白的效果越显著[24].3.3 无效组分及有毒产物合成的阻断Ikeda小组阐明了阿维菌素的生物合成途径,在明确阿维菌素生物合成途径的基础上,结合传统诱变构建了一系列仅产有效组分的基因工程菌株.经传统诱变获得了仅产4个“B”组分的突变株K2034(aveD)和仅产4个“a”组分的突变株K2021 (X)[10],前者是aveD基因(负责编码将B组分转化为A组分的C5-O-甲基转移酶)发生了突变,使得菌株只能累积B组分[25];后者是X基因发生了突变.目前X基因尚未得到克隆,但不位于阿维菌素生物合成基因簇中,此基因的突变导致突变株只能合成仅产“a”组分的阿维菌素,推测这个基因可能为支链氨基酸脱氢酶.对这两株突变株进行原生质体融合,得到了仅产B1a和B2a两个组分的重组菌株K2038(aveD X)[10].再对重组菌株K2038内的aveC基因进行点突变,得到仅产单一组分B2a 的基因工程菌K2099(aveD X aveC)[1].阿维链霉菌不仅产生阿维菌素,还产生寡霉素.寡霉素是哺乳动物氧化磷酸化的抑制剂,对哺乳动物有很高的毒性.Ikeda等用Tn4560对阿维链霉菌进行转座诱变得到不产寡霉素的突变株,利用转座子上的遗传标记将寡霉素的生物合成基因克隆到温敏质粒上,对上述所构建的有效组分的基因工程菌进行基因取代,得到不产寡霉素仅产阿维菌素有效组分的基因工程菌[1].我们实验室自20世纪90年代以来开展了对阿维菌素合成的研究,初期主要利用常规诱变手段提高阿维菌素产量,近年来也开展了对阿维链霉菌的基因工程改造.通过对aveD基因的插入失活,阻断了C5-O-甲基转移酶的合成,与aveD共转录的aveF的表达也被阻断,因此获得了直接合成C5-O-阿维菌素B的基因工程菌[26].C5-O-阿维菌素B可直接在C-5位进行肟基化合成具有更高杀虫活性的阿维菌素5-肟衍生物.此外,通过对aveD基因进行缺失突变,得到了仅产阿维菌素B组分的基因工程菌[27].在此基础上,张晓琳等通过同源双交换的方法将上述仅产阿维菌素B组分的基因工程菌染色体上长达90kb的寡霉素聚酮合酶基因簇(olm A)进行了缺失,得到不产寡霉素而仅产阿维菌素B组分的基因工程菌[28].3.4 组合生物合成阿维菌素的大环内酯结构属于聚酮体,由阿维菌素PKS(AVES)催化形成.阿维菌素B1和B2的区别在于C-22,23位不同,B1在C-22,23位是CH=CH,而B2在C-22,23位为C H2-CH OH.根据聚酮体合成反应步骤与其PKS基因结构之间的一一对应关系,阿维菌素C-22,23位的还原程度由AV ES1模块2上的还原酶域DH和KR(DH2-K R2)决定.KR2将C-23位的β-酮基还原成羟基后,在DH2的作用下脱水形成双键,最后的产物即为B1组分;如果DH不起作用,则最终形成的产物C-23位保持羟基即为B2组分,因此推测B1组分和B2组分的共存可能是由于DH2的不完全活性所造成.将阿维菌素PKS模块2上的不完全活性的DH用完全活性的DH取代,仍有B2组分的合成.伊维菌素是阿维菌素B1在C-22,23双氢还原物(图1),与阿维菌素B1相比,具有相同的杀虫活性,而毒性更低,因而被广泛应用于畜牧业上. Gaisser等用rapam ycin PKS中模块13上的DH-ER (enoyl reductase烯基还原酶)-K R取代野生型阿维链霉菌中阿维菌素PKS模块2上的DH-K R结构域,获得的重组菌株具有直接合成C-22,23双氢阿维菌素B1(即伊维菌素)和A1的能力,除产生以上组分外,该菌株同时还产生阿维菌素的8个组分[29].张晓琳以阿维链霉菌仅产B组分不产寡霉素的基因工程菌Olm73-12为出发菌株,将其阿维菌素PKS模块2上的DH和KR结构域用来自于pik-rom ycin PKS模块4中一套完整的DH-E R-KR所置换,得到不产寡霉素而产伊维菌素B1a的基因工程菌[30].293 第17卷 第3期 2007年3月3.5 阿维菌素衍生物的产生Doramectin是阿维菌素B1的cyclohexane-car-box ylic acid(CH C)前体异构物,与伊维菌素相比,生物半衰期更长,杀虫效果更好.Cropp等将S.collius中的CH C-CoA合成基因转入阿维链霉菌的阿维菌素的前体合成阻断突变株中,使得突变株获得了合成Doramectin的能力[31].该突变株发酵产生Do ram ectin的同时还产生无效的CH C-B2组分,aveC编码产物控制Do ramectin与C HC-B2的比例.Stutzm an-Engw all等通过定点诱变和易错PCR在aveC基因中引入随机突变,获得了几株C HC-B1比例提高的突变株,其中一株CHC-B1的比例提高了4倍[32].他们又通过DNA重排(DNA shuffling)技术对av eC进行突变,将重排后的aveC 突变文库转化到阿维链霉菌中,得到几个产Dor-amectin比例较高的转化菌株.对这些菌株中的aveC基因进行分析发现,最有效的突变aveC中有10个氨基酸发生了突变,所产C HC-B2∶CH C-B1的比例为0.07∶1,此比例与野生型菌株相比提高了23倍[33].甲胺基阿维菌素(emamectin benzoate,即M K-244)与阿维菌素相比具有更高的杀虫活性,在农业上得到广泛应用.在化学合成上,4″-氧-阿维菌素(4″-o xo-avermectin)是由阿维菌素合成甲胺基阿维菌素的中间体,由于阿维菌素两个羟基的存在,必须在氧化前后对于其进行保护,使得生产成本大大提高.来自杀结核链霉菌(S.tubercidicus)R-922的细胞色素P450单加氧酶Ema1能够选择性地催化阿维菌素形成4″-氧-阿维菌素[34].通过在阿维链霉菌中表达em a1,试图得到一步法合成4″-氧-阿维菌素的菌株.但只有生长初期的菌丝能够合成4″-氧-阿维菌素,处于稳定期的菌株则不能[35].而阿维菌素的合成主要在稳定期合成,这可能是所用启动子在稳定期时不易表达,而换成稳定期表达的启动子效果可能会好些.4 展望阿维链霉菌自发现以来已有30a的时间,对于它的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域.提高阿维菌素的产量、选择性地合成活性组分和产生有生物活性的阿维菌素衍生物及新代谢物一直是研究的热点.随着阿维链霉菌和其他链霉菌序列的测定,研究的重心将进一步拓展到次级代谢物产生的调控和形态分化调控方面,以揭示链霉菌复杂的调控网络.功能基因组研究还可以进一步了解链霉菌染色体复制及其稳定性,在提高工业菌株的遗传稳定性方面意义重大.阿维链霉菌中阿维菌素和寡霉素基因簇中聚酮生物合成编控的分子机理的阐明和阿维链霉菌基因组序列的完成将为利用组合生物合成改造阿维链霉菌,形成一系列非天然的天然性化合物提供可能,在药物创新方面将有可能取得一系列突破.就目前而言,组合生物合成面临的最大障碍就是改造后的PKS合成的新代谢物产量太低.大多数情况下,杂合PKS合成新化合物的产量仅是野生型菌株原来抗生素产量的1%—50%,甚至更低[36].目前也有一些提高产量的途径:如增加PKS拷贝数或使用强启动子可使产量提高;将结构类似的聚酮化合物的PKS单元进行组合,由于它们生物合成的中间体结构相似,来自不同PKS的模块和结构域在功能上可以彼此互补,从而使杂合PKS具有较高的活性;通过替换整个模块或蛋白亚单位而不是单个酶域可以使产量提高100倍以上[37].目前构建的可直接合成伊维菌素的基因工程菌由于产量太低而无法应用于工业生产.如能利用阿维菌素结构类似物M ilbemy-cins或M eling mycins(它们在大环内酯的C22,23位为CH2-CH2)的PKS基因对阿维菌素PKS的模块2进行整个置换有可能提高杂合PKS的活性,进而提高伊维菌素的产量.此外,虽然阿维菌素的生物合成途径已经基本阐明,但是阿维菌素的生物合成调控途径和一些关键步骤还不清楚,基因簇中aveR和aveC的基因功能还不确定.推测aveR基因可能是阿维菌素的调控基因,但是aveR基因如何调控阿维菌素的生物合成还不清楚,有待于进一步研究.阿维菌素合成过程中决定阿维菌素B1∶B2的比例的机制仍然不清楚.阿维菌素B1和B2组分的分化发生在阿维菌素的合成初期,但实验证实阿维菌素PKS模块2上的负责C22-23位脱水的脱水酶并不能决定B2∶B1的比例.目前的实验结果表明av eC可能决定阿维菌素B2∶B1的比例[1,32,33],但其机制仍然不清楚,如AveC是如何催化C22-23的脱水;是与阿维菌素294 第17卷 第3期 2007年3月PKS一起共同完成的,还是在阿维菌素糖苷配体形成之后等.由于阿维菌素B1具有最高的杀虫活性,如能仅发酵生产B1组分,将大大地简化生产和提取工艺,阿维菌素的生产成本也将降低.因此,研究阿维链霉菌中aveC基因的功能,阐明决定阿维菌素B2∶B1比例的机制,将为理性设计实验提高阿维菌素中有用组分B1的含量提供理论基础.参 考 文 献1 Ikeda H,m ura S.Con trol of avermectin biosyn th esis in S trep-tomyces avermitilis for the selective production of a useful com-ponent.J An tibiot,1995,48(7):549—5622 Ikeda H,Non omiy a T,Usami M,et aniz ation of the bio-sy nthetic gene clus ter for the polyk etide an th elmintic m acrolide averm ectin in S trep tomyces aver mitilis.Proc Natl Acad S ci USA,1999,96(17):9509—95143 Ikeda H,Nonomiya T,mura anization of biosyn thetic gene cluster for averm ectin in S tr ep tomyces aver mitilis:Analy sis of enzymatic domains in four polyk etide synthases.J Ind M icro-biol Biotechnol,2001,27(3):170—1764 M acNeil DJ,Occi J L,Gew ain KM,et plex organiz ation of the S treptom yces aver mitilis genes encoding th e avermectin polyketide sy nthase.Gene,1992,115:119—1255 M acNeil DJ,Occi J L,Gew ain KM,et al.C orrelation of th e averm ectin polyketide synthase genes to the averm ectin struc-ture.Implication s for designing novel avermectins.A nn N Y Acad Sci,1994,721:123—1326 Bentley SD,C hater KF,Cerdeno-Tarraga,et plete ge-nome sequence of the m odel actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).Natu re,2002,417:141—1477 Ikeda H,Is hikaw a J,Hanamoto A,et plete genome s e-quence and comparative analysis of the indus trial microorganism S treptom yces aver mitilis.Nat Biotech nol,2003,21:526—531 8 mu ra S,Ikeda H,Ishikaw a J,et al.Genome sequence of an in-du strial microorganism S trep tomyces avermitilis:Deducing th e ability of producing secondary metabolites.Proc Natl Acad S ci USA,2001,98(21):12215—122209 Cane DE,Liang TC,Kaplan LK,et al.Biosynthetic origin of the carbon skeleton and oxygen atoms of the avermectins.J AmC hem Soc,1983,105:4110—411210 mu ra S,Ikeda H,Tanaka H.Selective produ ction of specific components of avermectins in S treptomyces aver mitilis.J Anti-biot,1991,44(5):560—56311 Ikeda H,Kotaki H,T anaka H,et al.Involvemen t of glucose catabolism in averm ectin production by S tr ep tomyces avermiti-lis.Antimicrob Agents C hem oth er,1988,32(2):282—28412 Pang C H,M atsu zaki K,Ik eda H,et al.Produ ction of a newmethylated6,8a-seco-6,8a-deoxy derivative of the averm ectin s by a trans formant s train of S tr ep tomyces aver mitilis.J Antibiot, 1995,48(1):92—9413 Bibb M J.Regu lation of secondary metab olism in streptomy cetes.Cu rr Opin M icrobiol,2005,8:208—21514 Wietzorrek A,Bibb M J:A novel family of proteins that regu-lates an tibiotic production in strep tomycetes ap pears to contain an OmpR-like DNA-binding fold.M ol M icrobiol,1997,25: 1181—118415 Sh eeler NL,M acM illan S V,Nodw ell J R.Bioch emical activities of the absA tw o-com ponen t sys tem of S trep tomyces coelicolor.J Bacteriol,2005,187:687—69616 Chakrabu rtty R,Bibb M J.T he p pGpp synthetase gen e(relA)of S tr ep tomyces coelicolor A3(2)play s a conditional role in antibi-otic production and morphological differentiation.J Bacteriol, 1997,179:5854—586117 H orinouchi S,Beppu T.Regulation of secondary metabolism and cell differentiation in S trep tomyces:A-factor as a microbial hor-mone and th e Afs R protein as a com ponen t of a tw o-component regulato ry sys tem.Gene,1992,115:167—17218 Sola-Landa A,M oura RS,M artin JF.T he tw o-component PhoR-PhoP sys tem controls both p rim ary metab olism and sec-ondary metabolite biosynthesis in Streptomyces lividans.Proc Natl Acad Sci US A,2003,100:6133—613819 Lee JY,H wang YS,Kim S S,et al.Effect of a global regulatory gene,a fsR2,from S treptomy ces lividans on avermectin p rodu c-tion in S trep tomyces aver mitilis.J Biosci Bioeng,2000,89: 602—60520 H w ang YS,Kim ES,Biro S,et al.Cloning and analysis of a DNA fragmen t stimulating avermectin p roduction in variou s S tr ep tomyces aver mitilis s trains.Appl Environ M icrobiol, 2003,69:1263—126921 Stutzman-Engw all K.S treptomyces averm itilis regulatory genes for increased avermectin production.United State Patent, 6197591,2001-03-0622 王晓芳,陈 芝,张晓琳,等.阿维链霉菌调节基因aveR1, aveR2缺失对阿维菌素产量的影响.中国生物防治.2005,21(增刊):77—8223 Xiong X,Liang YX,Zheng YH.Enhancement and selective pro-duction of oligomycin th rou gh inactivation of avermectin’s starter unit in S treptom yces aver mitilis.Biotechnol Lett,2006,28(12):911—91624 文 莹,李季伦.透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达.微生物学报,2000,40(1):50—5625 Schulman M D,Valention D.S tr ep tomyces aver mitilis mutants defective in m ethylation of avermectins.Antimicrob Agen ts Che-mother,1987,31:744—74726 陈 芝,宋 渊,文 莹,等.阿维链霉菌中a veD基因阻断对295 第17卷 第3期 2007年3月阿维菌素合成的影响.微生物学报,2001,41(4):440—44627 陈 芝,文 莹,宋 渊,等.阿维链霉菌中aveD 基因缺失对阿维菌素合成的影响.微生物学报,2002,42(5):534—53828 Zhang X ,Chen Z ,Zhao J ,et al.Deletion analy sis of oligom ycinPKS genes (o lm A )in S treptom yces avermitilis .Chin Sci Bull ,2004,49(4):350—35429 Gaisser S ,Kellenberger L ,Kaja A L ,et al.Direct production ofivermectin -like drugs after domain exchange in the avermectin polyketide synthase of S trep tomyces avermitilis Biomol C hem ,2003,1:2840—284730 Zhang X ,Chen Z ,Li M ,et al.C onstruction of ivermectin pro -ducer by domain sw aps of averm ectin poly ketide sy nthase in S treptom yces aver mitilis .Appl M icrobiol Biotech nol ,2006,72(5):986—99431 C ropp TA ,W ils on DJ ,Rey nolds KA.Identification of a cyclo -hexylcarb ony l C oA biosy nthetic gene clu ster and application in the p rodu ction of doramectin.Nat Biotechnol ,2000,18(9):980—98332 S tu tz man -E ngwall K ,C onlon S ,Fedechk o R ,et al.E ngineeringthe aveC gene to enh ance the ratio of d oramectin to its CH C -B2analogue produced in S trep tomyces averm itilis .Biotech nol and Bioeng ,2003,82:359—36933 Stutzman -Engw all K ,Conlon S ,Fedechk o R ,et al.S emi -sy n -thetic DNA shuffling of aveC leads to imp roved indu strial scale production of doramectin by S treptom yces averm itilis .M etab Eng ,2005,7(1):27—3734 Ju ngmann V ,M olnar I ,Hammer PE ,et al.Biocatalytic conver -sion of avermectin to 4″-oxo -avermectin :Ch aracterization of bio -cataly tically active bacterial s trains and of cy toch rome p450mo -nooxygen ase enzym es and their genes.Appl Environ M icrobiol ,2005,71(11):6968—697635 M olnar I ,H ill DS ,Zirkle R ,et al.Biocataly tic conversion ofavermectin to 4″-oxo -avermectin :Heterologous ex pres sion of the ema1cytoch rom e P450monooxygenase.Appl En viron M icrobi -ol ,2005,71(11):6977—698536 M cDaniel R ,T ham chaipenet A ,Gu stafss on C ,et al.M ultiplegenetic modification s of the erythromycin polyketide syn th as e to produce a library of novel “un natural ”natu ral p rodu cts.Proc Natl Acad Sci US A ,1999,96:1846—185137 T ang L ,Fu H ,M cDaniel R.Formation of functional heterolo -gous complexes using subu nits from the picromycin ,ery th rom y -cin ,and oleandomycin polyketide syn th ases.C hem Biol ,2000,7:77—84隧道磁阻效应原理研究取得新进展磁隧道结是磁随机存储器中的核心部件.寻找具有良好隧道磁阻效应的磁隧道结是制造性能优良的磁随机存储器的关键,是目前的研究热点之一.近年来,人们发现基于氧化镁绝缘层的磁隧道结在常温下具有非常巨大的隧道磁阻,大量的实验研究工作测出了相当多的试验数据.同时,一些研究组也做过相应的理论计算,但是计算结果与实验数据一直符合得不好.最近,中国科学院物理研究所纳米物理与器件实验室高鸿钧研究员的博士研究生胡亦斌、表面物理实验室的夏轲研究员和加拿大M cGill 大学郭鸿教授研究组合作,运用郭鸿研究组自主开发的第一性原理输运计算方法和程序,对基于氧化镁绝缘层的磁隧道结在理论上进行了研究.研究结果表明,基于氧化镁绝缘层的磁隧道结确实存在非常巨大的隧道磁阻.他们还从理论上得到了基于氧化镁绝缘层的磁隧道结的伏安特性曲线,并与实验上测得的伏安特性曲线符合得很好.此外,由于理论计算时氧化镁绝缘层具有完美的界面,而在实验上不可能做到;同时,绝缘层两边的铁磁材料也不可能是纯粹的金属结构,有可能被氧化、存在缺陷等现象.他们通过相应的理论计算发现,上述原因都可以造成基于氧化镁绝缘层的磁隧道结的隧道磁阻有很大地下降,从而解释了理论计算的隧道磁阻比实验测出的数值大很多的问题.相关研究结果发表在美国《物理评论快报》(Phy s.Rev.Le tt.97,226802(2006))上.该工作得到了国家自然科学基金以及国家科技部和中国科学院的资助.(供稿:中国科学院物理研究所)296 第17卷 第3期 2007年3月。
