下载文档原格式
马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。
近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。
2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。
但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。
马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。
马铃薯病毒检测包括：基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。
严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。
马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。
目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法（DAS-ELISA）检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。
下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。
1马铃薯病毒的概况1.1马铃薯X病毒（PVX）也称普通花叶病毒,是一种长520～550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。
在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。
免疫试纸条结合RT-PCR法快速检测马铃薯Y病毒摘要：利用马铃薯Ｙ病毒免疫试纸条，对ＰＶＹ进行了快速检测，结果表明，试纸在２ｍｉｎ内，可特异性检出ＰＶＹ，而健康的叶片无反应。
刮下试纸条上显示的检测带，进行ＲＴ－ＰＣＲ，能扩增到与预期大小相同的ＤＮＡ条带，是对快速检测试纸条检测结果的验证。
关键词：马铃薯Ｙ病毒；免疫试纸条；ＲＴ－ＰＣＲ中图分类号：Ｓ４３２．４＋１；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11405－1056-02ＴｈｅＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｏｔａｔｏＶｉｒｕｓＹｂｙＩｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐＡｓｓａｙａｎｄＲＴ－ＰＣＲＺＨＵＹｕｎ－ｆｅｎ１，ＣＨＥＮＧＱｕｎ１，ＳＨＥＮＹａｎ－ｆｅｎ１，ＭＡＺｕｏ－ｊｉａｎｇ１，ＷＡＮＧＥｒ－ｈｕｉ１，ＷＥＩＫａｉ２Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹｗａｓｒａｐｉｄｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐaｓｓａｙ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＶＹｃｏｕｌｄｂｅｔｅｓｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐｗｉｔｈｉｎ２ｍｉｎｕｔｅｓａｎｄｎｏ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｒｄｆｏｒｈｅａｌｔｈｙｌｅａｖｅｓ．ＲＴ－ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅａｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｂａｎｄｗｉｔｈａｎｅｘｐｅｃｔｅｄｓｉｚｅ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ；ｉｍｍｕｎｏｓｔｒｉｐ；ＲＴ－ＰＣＲ我国是世界上马铃薯生产第一大国，近年来，马铃薯产业发展迅速，在国民经济增长中占有重要比重，但现阶段马铃薯整体生产水平低于世界平均水平［１］，其主要原因是受马铃薯病毒的影响。
马铃薯为营养体繁殖，病毒在寄主体内随继代繁殖而逐渐积累，导致马铃薯种性退化，产量严重降低，块茎大小、形状、口感等原有品质下降，影响马铃薯的商品性。
马铃薯病毒病(一)病原及侵染对马铃薯能够侵染并且造成损失的病原病毒有马铃薯X 病毒、Y病毒等多种。
马铃薯花叶病毒(PVX)，是一种长520-550nm的线状病毒，有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。
在病毒外壳由亚基形成时，可看到它的横纹，这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。
马铃薯重花叶病毒(PVY)，是一种长680-900nm的线状病毒，在电镜下找不到它的中心孔和外壳蛋白亚基的横纹。
它比PVX更细一些、更长一些。
此外，还发现了马铃薯S病毒、M病毒、黄矮病毒和类病毒中的马铃薯纤块茎病毒。
对于马铃薯病毒侵染造成马铃薯病毒病的途径，主要是汁液传播。
汁液传播的主要媒介是蚜虫。
蚜虫有探食性特性，就是说，蚜虫在接触植物(主要是幼嫩叶片)时，首先在着落点吐出唾液，停一会再在有唾液部位，连同刺吸的汁液和唾液一同吸回，最后才确定是否继续吸食下去，正是由于这个特性，病毒在汁液悬浮中就依靠蚜虫这个主要媒介而传播。
所以，一般的农药杀蚜，并不能解决蚜传病毒问题。
蚜虫被杀死了，病毒也早已传播了。
PVX通过汁传后，在马铃薯植株上造成的症状是轻花叶，PVY通过汁液传播后，在马铃薯植株上造成的症状是重花叶，PVX与PVY的重复感染在马铃薯上产生明显的重花叶和斑枯，对产量和品质的影响就严重了。
在生产实际中，往往是复合感染，因此，后果严重。
成片的马铃薯枯斑坏死是屡见不鲜的。
直至收获的块茎都出现肉质褐变。
(二)微公害、无公害防治技术1.选留和选用无病种薯种用马铃薯，一般以秋薯为佳，一来腐烂率小，二来薯块较小而匀称，经济实用。
作为选留无病种薯，一般用目测法，植株生长健壮，芽眼鲜嫩无病，薯块韧实而鲜壮，同时注意尽量用新窖或未贮存过病株的场所，历经一段时间后，播前对选留的种薯再作一次逐块检查。
2.茎尖脱毒培养马铃薯病毒有一个很重要的特点，实践证明，在植株的生长点部位是不带毒的。
也就是说，病毒在寄主体内传递的速度不如植株生长的速度快，利用这一特性，在无毒条件下切取茎尖0.3-0.5毫米，”栽种”在烧瓶培养基上，培育无毒小苗和无毒小种薯，用这种无毒小种薯作一级种薯，再在无病地块中进行二级种薯扩大繁殖，用于大田生产。
脱毒马铃薯种植技的重点分析马铃薯是一种重要的粮食和经济作物，但它容易受到多种病虫害的侵袭，影响产量和质量。
为了解决这个问题，脱毒马铃薯种植技术应运而生。
脱毒马铃薯种植技术是通过对马铃薯进行病毒检测、分离、消毒和培养等一系列繁育措施，以获得无毒和高质量的马铃薯种薯。
以下是脱毒马铃薯种植技术的重点分析：1. 病毒检测：通过病毒检测能够及早发现马铃薯种薯中的病毒感染情况，并对病毒进行鉴定和分类。
常用的病毒检测方法包括病毒感染指数检测、ELISA法、PCR技术等。
只有经过病毒检测并证明无病毒污染的马铃薯才能用作种薯。
2. 病毒分离：病毒分离是将感染病毒的马铃薯进行分离处理，使其与其他健康马铃薯隔离开来，防止病毒的传播。
常见的病毒分离技术有组织培养、热处理、匀浆等方法，可以有效地减少种薯中的病毒污染。
3. 病毒消毒：病毒消毒是指对种薯进行除病毒处理，消除种薯中的病毒感染。
常用的病毒消毒方法包括化学消毒和物理消毒。
化学消毒常用的药剂有氯化汞、戊唑醇等，物理消毒则有温度处理、阳离子辐射等方法可供选择。
4. 病毒培养：病毒培养是将无病毒的马铃薯种薯进行培养，以获得健康的马铃薯苗。
病毒培养通常采取组织培养和无土培养技术。
组织培养是在无菌条件下，利用马铃薯组织培养基进行培养；无土培养是利用营养液培养的方法，使种薯在无土环境下正常生长。
5. 高质量种薯生产：脱毒马铃薯种植技术的最终目的是获得质量优良的种薯，以保证高产和高品质的马铃薯产量。
高质量种薯的生产需要注意土壤选择、施肥管理、病虫害防治等方面的技术，同时也要进行适当的种植密度、栽培方式和收获、贮藏等管理措施，以确保种薯的生长和发育。
RT PCR技术对宁夏马铃薯脱毒种薯病毒检测的研究作者：聂峰杰 詹红 张丽 宋玉霞巩檑甘晓燕陈虞超石磊张国辉来源：《植物保护》2016年第05期摘要病毒病是影响马铃薯生产的重要病害，为了解宁夏地区马铃薯种薯生产中的病毒发生情况，在银川市、固原市和西吉县不同种植模式的脱毒种薯生产基地，对不同品种的原原种、原种、一级种在不同生育期随机采集样品，利用RTPCR检测技术对4种马铃薯主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV和类病毒PSTVd进行检测。
结果表明：PVX、PVY、PVS、PLRV在3个基地均有不同程度检出，成熟期病毒检出率分别为35%、28%、35%和34%，未检出PSTVd；4种病毒检出率在马铃薯现蕾期以后呈现显著性增长；病毒检出率随着种薯繁育级别增加差异显著；6个马铃薯品种均为感病品种；大田种植种薯的病毒检出率显著高于防虫网室。
关键词马铃薯；病毒检测； RTPCR病毒病是危害马铃薯生产的重要病害，在全世界马铃薯产区均有分布。
目前，已发现的马铃薯病毒、类病毒有近40种[1]，我国常见的有8种，包括马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y 病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯皱缩花叶病毒（PVM）、马铃薯古巴花叶病毒（PAMV）和马铃薯纺锤形块茎类病毒（PSTVd）[23]。
马铃薯受病毒侵染后主要表现为花叶、卷叶、植株矮小、叶片失绿、块茎变小、龟裂、内部网状坏死等，严重时种薯失去发芽能力，病毒逐代积累引起马铃薯品种退化，产量和品质下降，一般引起减产20%～30%，如果多种病毒混合侵染可造成减产80%以上[45]。
目前马铃薯病毒病的防治主要包括生产脱毒种薯、抗病毒品种选育和施用抗病毒药剂，其中生产脱毒种薯是控制马铃薯病毒病最有成效的手段[67]。
但在脱毒种薯生产中，病毒病的发生与马铃薯品种、脱毒种薯级别、种植地区和生产管理等有很大的相关性，病毒的种类和生产环境也密切相关。
用DTBA方法检测马铃薯病毒
朱国春;朱国庆
【期刊名称】《中国马铃薯》
【年(卷),期】2000(014)001
【摘 要】@@ 1 前言rn检测马铃薯病毒没有单一的最佳技术,用电子显微镜检测
病毒很灵敏,但昂贵,同时要具备经验,这种经验是许多诊断学家无法具备的.而血清检
测相比灵敏、迅速、准确、连贯、成本低、方便.例如ELISA方法在所有种类中应
用相对好些,以下用DTBA方法与ELISA方法比较检测马铃薯病毒病.
【总页数】2页(P59-60)
【作 者】朱国春;朱国庆
【作者单位】青海省师范高等专科学校基础部,810007;四川省西昌市农科
所,615000
【正文语种】中 文
【中图分类】S532
【相关文献】
1.3种检测方法在脱毒马铃薯种薯病毒检测中的应用及检测效果比较 [J], 张丽;聂
峰杰;张国辉;巩檑;石磊;陈虞超;甘晓燕;宋玉霞
2.马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法 [J], 罗燕娜;刘江娜;王航
3.马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立 [J], 梁雨
欣;吴建祥;李小宇;张春雨;侯吉超;周雪平;王永志
4.马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立研究 [J], 康明蛟
5.一种快速简便检测马铃薯病毒的方法——病毒细菌协同凝集法(VBA)的研究 [J],
卢爱兰;冯兰香;宋伯符
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【摘要】病毒是马铃薯生产过程中危害较大的一类病原,为快速检测出云南省马铃薯主要病毒种类,依据病毒外壳蛋白基因序列设计合成了马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)的特异性引物,从退火温度、最低检测浓度、热反应循环条件、病毒间的模板及引物间的最佳组合浓度进行优化,建立了三重RT-PCR反应体系.结果表明:该优化体系可同步扩增出上述3种病毒,分别得到480 bp (PVY)、187 bp (PVS)、336 bp (PLRV)大小的扩增片段.优化的三重RT-PCR反应体系可快速、灵敏、简便的检测到单一或复合侵染的马铃薯病毒,有利于马铃薯病毒病的早期检测和防治,将为云南省马铃薯种苗脱毒、继代、田间植株的高产栽培等有重要实践作用.【期刊名称】《云南农业大学学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】6页(P535-540)【关键词】马铃薯;病毒;多重RT-PCR检测【作者】黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【作者单位】云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南省建水县农业技术推广所,云南建水654399;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S435.32马铃薯病毒病是马铃薯非常重要的一类病害，病毒的侵染可引起马铃薯种质退化，导致产量急剧下降[1]。
我国各马铃薯主产区均有马铃薯病毒病发生[2]。
主要的马铃薯病毒种类有马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus，PLRV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯A病毒(Potato virus A，PVA)和马铃薯S病毒(Potato virus S，PVS)[3-4]。
马铃薯种薯病毒检测现已发现，造成马铃薯退化的病毒有30余种，严重为害马铃薯的病毒有七种：马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯A病毒（PV A）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯S病毒（PVS）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。
在马铃薯栽培过程中，出现叶片皱缩卷曲，叶色浓淡不均，茎秆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量逐年下降等现象，就表明马铃薯已经发生“退化”。
种薯“退化”是病毒的侵染及其在薯块内积累造成的，也是引起产量降低和商品性状变差的主要原因。
采用现代生物技术将种薯内的病毒去掉，恢复马铃薯品种本身的生理功能和生产特性，才能防止马铃薯的“退化”，使之达到育种家培育品种本身的商品性状和产量。
这就是种薯需要脱毒和采用脱毒种薯能够大幅度提高产量的重要原因。
1.种薯分类复合国家标准（GB18133-2012 表1）规定的相应质量要求的种薯为原原种、原种、一级种薯和二级种薯。
表1 各级别种薯田间检查植株质量要求1.1原原种（G1）用脱毒组培苗或试管薯在防虫网、温室等隔离条件下生产，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于原种生产的种薯。
1.2原种（G2）用原原种作种薯，在良好隔离环境条件下生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产一级种的种薯。
1.3一级种薯（G3）在良好隔离环境中，用原种作种薯生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产二级种的种薯。
1.4二级种薯（G4）在相对隔离环境中，用一级种作种薯生产，经过质量检测后达到国家标准（表1）要求的，用于生产商品薯的种薯。
1.5种薯批来源相同、同一块地、同一品种、同一级别以及同一时期收获、质量基本一致的马铃薯植株或块茎作为一批。
2.主要检测病毒2.1马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）2.2马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）2.3马铃薯A病毒（Potato virus A,PV A）2.4马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）2.5马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）2.6马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）2.7马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）3.检测方法3.1病毒检测采用酶联免疫（ELISA）或反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法。
3.2类病毒采用往返电泳（R-PAGE）、RT-PCR、或核酸斑点杂交（NASH）方法。
4.种薯质量要求4.1脱毒苗基础苗经检测，不含有上述7种重要病毒（PVX、PVY、PV A、PVM、PLRV、PVS、PSTVd），否则淘汰，在瓶苗大量扩繁前需要对基础苗提前检测，来确定基础苗是否合格。
4.2原原种检测4.2.1温室或网棚中，组培苗定植结束或试管薯出苗后30天~40天，同一生产环境条件下，对于非正常植株或器官应马上采集样本进行实验室检验。
原原种收获后检测，原原种每个品种每100万粒检测200粒（每增加100万粒检测样品增加40粒，不足100万粒的按100万粒计算）。
4.3原种、一级种和二级种田间检测采用目测检查，种薯每批次至少随机抽检5点~10点，每点100株（见表2），目测不能确诊的非正常植株或器官应马上采集样品进行实验室检验。
表2 每种薯批抽检点数检测面积检测点数/个检查总株/株≤1 5 500＞1，≤40 6~10（每增加10hm2增加1个检测点）600~1000 ＞40 10（每增加40hm2增加2个监测点）＞1000备注：（1）对于原种而言，采样500个左右，进行混样，每25个叶片混在一起作为一个检测样品，可以降低检测成本，然后把有病毒的混样分开检测，来确定最终的带病毒机率。
图1 分解检测（2）对于一级种和二级种，根据（GB18133-2012 表1）采样个数可以减少至100个，可以每10个叶片混样检测，根据图1分解检测，来确定最终的带病毒机率。
（3）整个田间检测过程要求于40天内完成。
第一次检测在现蕾至盛花期，第二次检查在收获前30天左右进行。
（4）当第一次检查指标中任何一项超过允许率的5倍，停止检测，该地块马铃薯不能作为种薯销售，或者原种降级销售，或者作为商品薯销售。
（5）第一次检测任何一项指标超过允许率在5倍以内，可以通过通过种植者拔除病株和混杂株降低比率，第二次检测为最终田间检测结果。
4.4原种、一级种和二级种收获后检测种薯收获和入库期，根据种薯检测面积在收获田间随机取样，或者在库房随机抽取一定数量的块茎用于实验室检测。
4.4.1大田每批种薯根据生产面积确定检测样品数量（表3）。
表3收获时实验室检测样品数量4.4.2种薯出库前应进行库房检测。
大田各级种薯根据每批次总产量确定扦样点数（表4）。
表4大田各级种薯块茎扦样量5.判定规则5.1定级种薯级别以种薯繁殖的代数，并同时满足田间检查和收获后检测达到质量要求为定级标准。
5.2降级检测参数任何一项达不到拟生产级别种薯质量要求时，降到与检测结果的质量指标的种薯级别，达不到最低一级种薯质量指标的不能用作种薯，作为商品薯。
第二次田间检测超过最低级别种薯允许率的，该地块马铃薯不能作为种薯。
5.3出库标准任何级别的种薯出库前应达到库房检查块茎质量要求，重新挑选或降到与库房检测结果相对应的质量指标的种薯级别，达不到最低一级种薯质量指标的，应该重新挑选至合格后方可发货。
附录1 酶联免疫吸附试验法(ELISA)1 原理酶联免疫测定是一种用血清学技术检测植物病毒的方法。
其原理：双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）试验的原理是利用结合在酶联板表面的抗体（IgG）捕获待检样品中的目标抗原（A），再用特异性的酶标抗体结合物（E）检测被结合的抗原，通过比色底物（S）反应检测酶（图例中是碱性磷酸酶）。
双抗体夹心酶联免疫吸附测定的主要方法与实验步骤如下：2 仪器和设备①酶联板一般用96孔酶联板。
②微量移液器需2~10 μl、10~50 μl和10~200 μl三种规格，并附相应规格的塑料头。
③冰箱。
④温箱：温度设置为37℃。
⑤用于采样、研磨的小塑料袋。
⑥酶联检测仪（Bio-Rad 550型）碱性磷酸酶（Alkaine Phosphatase. AKP）标记的酶标抗体用405nm波长检测。
3 应用的化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。
①抗体免疫球蛋白（r-globulin）和酶标记抗体（Conjugate）从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，将其浓度调为1 mg/ml，作为包被微量滴定板的抗体。
用碱性磷酸酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标抗体，一般使用浓度常在1:1000以上，贮藏于4 ℃条件下备用。
目前多用马铃薯特定病毒抗血清提取的免疫球蛋白包被好的酶联板，只需加检测样品和酶标抗体即可，这样可大大简化检测步骤，节省检测时间。
②碳酸盐包被缓冲液1.59 gNaCO3（碳酸钠），2.93 gNaHCO3（碳酸氢钠）加水至1L。
pH9.6。
③ PBS-Tween-20缓冲液8 gNaCl（氯化钠），0.2 gKH2PO4（磷酸二氢钾），2.2gNa2HPO4·7H2O（磷酸氢二钠）或2.9 gNa2HPO4·12H2O，0.2 gKCl（氯化钾）加水至1L，然后加0.5 ml Tween-20，洗涤微量滴定板用。
pH7.4。
④样品缓冲液取PBS-Tween-20缓冲液100 ml，加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）2 g。
⑤底物缓冲液取0.2mol/L Na2HPO4·12H2O溶液25.7ml，加0.1mol/L柠檬酸溶液24.3 ml，加水50 ml，pH调至5.0（现用现配）。
临用前加磷苯二胺40 mg，30％过氧化氢（H2O2）0.15 ml混匀，避光放置，应为白色或微黄色溶液。
⑥终止液为0.2mol/L硫酸溶液，用1体积浓硫酸加9份水。
4 操作步骤4.1 包被酶联板把免疫球蛋白用包被缓冲液按1:1000稀释，用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内加入稀释的免疫球蛋白200μL。
在37℃条件孵育1h。
（或在4 ℃条件下过夜）。
4.2 洗涤包被的酶联板甩掉酶联板中多余的免疫球蛋白稀释液，在吸水纸上敲打微量滴定板，除尽残留溶液。
向微量滴定板的样品孔中加满洗涤缓冲液，停留3min，甩掉洗涤缓冲液，共洗涤3~4次，以除尽未吸附的免疫球蛋白。
4.3 加被检测的样品4.3.1 取样在无菌条件下，从瓶苗上剪下长2 cm茎段，放入小塑料袋内，把取样的试管苗放回原瓶内，封好瓶口，样品编号，按检测结果决定取舍。
4.3.2加样品缓冲液加入的液量依每个样品上样的孔数而定，例如每个样品准备上一个样品孔时，可加入0.4 ml样品缓冲液，研磨后可得200 μl清液，够一个样品孔用。
4.3.3 加入检测样品洗涤完的微量滴定板的样品孔内，按样品编号逐个加入提取的样品液200μl，每一块微量滴定板上，可设两个孔的阳性对照。
两个孔的阴性对照和两个孔的空白对照。
4.3.4 孵育把加完样品的微量滴定板在37 ℃条件下孵育4-6 h，或在4℃条件下过液，然后按4.2洗涤微量滴定板。
4.3.5 加酶标记抗体把酶标记抗体用样品缓冲液按1:1000稀释，每个样品孔中加入200 μl稀释的酶标记抗体。
4.3.6 洗涤微量滴定板按4.2方法洗涤微量滴定板，以除掉未结合的酶标记抗体。
4.3.7 加底物加入200μl底物。
当观察到阴性对照孔与阳性对照孔显现的颜色可以明确区分时（辣根过氧化物酶标记的酶标记抗体显现桔红色，碱性磷酸酶标记的抗体显现鲜黄色）；或未设对照样品孔的微量滴定板的一些样品孔之间显现的颜色可以（碱性磷酸酶标记的抗体一般可不加终止液）。
明确区分时，每孔加入50μl终止液。
5 结果判定5.1 目测观察显现颜色的深浅与病毒浓度呈正比。
无色为阴性反应，记录为“—”；显现淡黄色为阳性反应，记录为“＋”，依颜色的逐渐加深记录为“＋＋”和“＋＋＋”。
5.2 用酶联检测仪测定光密度值样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍即判定为阳性反应，（阴性对照孔的光密度值应≤0.1）。
附录2 快速检测马铃薯病毒方法（Spot Check ）1 应用：非常适合应用在田间检测，实验室也可以使用它来提高效率。
2试剂盒所含物品2.1每一组设备包括一个提取瓶（1），里面含有提取缓冲液和可使植物组织软化的滚珠。
转移吸管（2），用来吸取提取液到横向流动检测设备。
2.2 横向流动检测设备，密封在金属箔袋中。
3 图解说明 3.1 进行检测步骤1-样品的制备（图）• 取下疑似感病叶片或叶片的一块（约3cm x 4cm ）。
从感病植物的不同部位或者几株感染相同病原菌的植物选取小块叶片构成混合样品会得到较好的结果。
