一株反硝化菌的分离与鉴定

一株好氧反硝化菌的筛选鉴定及其系统发育分析李大鹏;崔福义;徐勇鹏;刘冬梅;李慧婷【摘要】从稳定运行的序列间歇式活性污泥(SBR)反应器中分离纯化得到一株好氧反硝化菌(实验室命名为CFY1),对菌株CFY1进行了形态观察、生理生化鉴定及16S rDNA基因序列分析,并对其好氧条件下的反硝化能力进行了考察.结果表明,菌株CFY1的菌落呈圆形,乳黄色,半透明,表面光滑,边缘不整齐,菌体细胞为短杆状,无芽孢,革兰氏染色呈阴性;氧化酶反应呈阳性,具有分解葡萄糖和淀粉以及还原硝酸盐的能力;菌株CFY1的16S rDNA序列经BLAST分析,与GenBank中施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)具有98.9％同源性,结合该菌株的形态和生理生化特征,可基本确定菌株为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),NCBI GenBank登录号为KC253270;在摇床转速150 r·min-1、培养温度30℃及pH值7.2的培养条件下,24 h内能将113.6 mg·L-1的NO3--N降解为0 mg·L-1.【期刊名称】《黑龙江大学自然科学学报》【年(卷),期】2015(032)002【总页数】6页(P236-241)【关键词】施氏假单胞菌;好氧反硝化;16S rDNA;系统发育分析【作者】李大鹏;崔福义;徐勇鹏;刘冬梅;李慧婷【作者单位】哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090;哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090;哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090;哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090;哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090【正文语种】中文【中图分类】X172水体中的含氮化合物存在诸多危害,包括造成水体富营养化现象、增加给水处理成本、消耗水体中的含氧量和对人体及动物的毒害作用等[1-2]。

一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定第24卷第1O期2011年10月环境科学研究ResearchofEnvironmentalSciencesV o1.24,No.10Oct.,2011一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定曾琳,朱琼芳,卢贯能,陈来琳,匡庐峰,柯林华南理工大学环境科学与工程学院,广东广州510006摘要:利用含As"肉汤培养基,从广西河池砷污染地区水样和沉积物样中通过多次分离,纯化获取砷耐受菌.进一步从砷耐受菌中筛选出在好氧条件下可以同时进行砷氧化和反硝化的多功能菌株c1l一35.对该菌株进行形态观察,并利用16SrDNA序列分析方法进行鉴定,发现该菌株为革兰氏阴性菌,与Achromobacterdenitrificallsstrain22426和Achromobacter xylosoxidansstrainC8B的同源性均达99%;该菌株在NO一和As"同时存在的条件下好氧反硝化能力和砷氧化速率均得到提高;在只含NO一的条件下,NO,一的去除率为53.65%,而在As"和NO,一同时存在的条件下,NO一的去除率为75.27%.在不含NO一和含NO一的条件下,As"的转化率都在99%以上,而在含NO 一的条件下,As"的氧化速率更快.这种相互促进可能与反硝化过程中的电子传递和砷氧化过程中的动态平衡有关. 关键词:砷氧化;好氧反硝化;多功能菌中图分类号:X172文献标志码:A文章编号:1001—6929(2011)10—1123—06ScreeningandIdentificationofanAchromobacterStrainforBothArsenic OxidizingandDenitrifyingAbilitiesZENGLin,ZHUQiong-fang,LUGuan—neng,CHENLai—lin,KUANGLu-feng,KELin CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology, Guangzhou510006,ChinaAbstract:Waterandsedimentsamplesweretakenfromanarsenic—contaminatedregioninHechi,GuangxiProvince.Arsenite—resistingstrainswereisolatedandpurifiedseveraltimesfrombrothmediumcontainingAs.cll 35.thearseniteoxidizerand aerobicdenitrifierwasfurtherscreenedfromarsenite—resistingstrains.Morphologicalstudiesand16SrDNAsequencingrevealedthat theisolatewasGramnegative.andhad99%homogeneitytoAchromobacterdenitrific口,lsstrain22426andAchromobacterxylosoxidansstrainC8B.Theaerobicdenitrifyingandarsenite?oxidizingabilityofthisstrai nwasenhancedwhenarseniteandnitratewerepresenttogether.Theremovalrateofnitratewas53.65%whenonlynitratewaspresent,w hiletheremovalrateincreasedto75,27%whenbotharseniteandnitratewerepresent.TheconversionrateofAs"wasabove99 %withandwithoutnitrate,andtheoxidationratewasenhancedbythepresenceofnitrate.Thisphenomenonmayberelatedtothe electrontransmissionprocessof aerobicdenitrifieationandthedynamicbalanceinthearseniteoxidation.Keywords:arsenicoxidation;aerobicdenitrification;multi—functionbacteria砷是一种致癌物质,长期饮用高砷水会导致慢性砷中毒和癌症等疾病.自然界中,砷以4种氧化价态存在:As,As,As¨和As",其中元素砷很少存在.As"的毒性最强,是As的25～60收稿日期:2011—03—15修订13期:2011—04—19基金项目:国家自然科学基金项目(21047003);教育部留学回国人员科研启动基金项目(x2hjB7100180)作者简介:曾琳(1986一),女,江西吉安人,******************.责任作者,柯林(1973一),男,广西梧州人,教授,博士,主要从事环境微生物研究,**************.cn倍..环境水体中的NO,一和NO:一被人体摄人后,可转化为亚硝胺,是一种致突变,致畸,致癌物,对人体是潜在的健康威胁.各国对饮用水中NO一含量已有比较严格的规定.含砷废水主要在冶金,化工和农药生产使用过程中产生;含氮废水主要来自生化污水,工业废水和农业地表径流;而有些农药废水中砷和氮含量都比较高,钨冶炼过程中也会产生含砷和氨氮的废水.另外,如风化,侵蚀等自然作用可使砷从地壳中释放出来,进入到自然水体或地下水,环境科学研究第24卷与水中原本存在的氮形成As¨和NO一共同污染的状况.而环境中本身可能存在Fe/Mn氧化物和硫酸盐等物质,加上微生物的作用,可能导致砷的毒性和迁移性增强,对公共健康造成威胁".目前国内外对于含砷废水的处理方法有吸附法,离子交换法,化学沉淀法和生物法等,而对于含氮废水的脱氮主要通过吹脱法,离子交换法和活性污泥法等¨.其中,化学沉淀法会产生含砷废渣,吹脱法产生的氨废气会造成环境的二次污染;吸附法处理效率低,离子交换法存在费用高的问题.而生物处理则是一种廉价,高效,污染较小的处理方法,符合可持续发展的需要.目前国内外对于含砷含氨氮废水处理的研究极少,采用石灰一亚铁盐除砷,湿式催化氧化吹脱除氮联合工艺来实现对钨冶炼过程产生的废水的有效治理是国内对含砷含氨氮废水实施系统处理的先例.而鲜见关于含氨氮或NO,一的砷废水的生物法处理的研究报道,大大限制了对氮砷联合污染的治理.采用活性污泥法去除NO一的有效性取决于反硝化菌的耐砷能力¨.而共存污染物的存在,使得针对单一污染物开发的污染去除工艺或方法在实际应用中通常无法取得预期效果,因此有必要研究可以同时去除多种共存污染物的去除手段.有学者¨对水体中微生物的厌氧砷氧化和厌氧反硝化之间的联系做过研究,而对于好氧反硝化菌的报道并不多.该研究从砷污染区筛选出能够同时在好氧条件下进行砷氧化和反硝化的多功能菌株,初步探究该菌株砷氧化和好氧反硝化机理及其相互作用机制,使利用微生物来同时进行脱氮除砷的目标得以实现,以突破该领域的研究瓶颈.1材料与方法1.1菌株来源从广西河池砷污染地区采回水样和沉积物样中,筛选分离出同时具有砷氧化和反硝化功能的多功能菌株c11-35.1.2材料肉汤培养基:筛选分离及菌株活化时使用.Minimal培养基(g/L):NH4C1,0.67;K2HPO4,O.61;KH2PO4,0.75;FeC13,0.0024;MgSO4?7H2O,0.2; CaC12,0.023;MnC12?4H2O,0.003;Na2MoO4?2H2O, 0.001;NaC6H5O7?2H2O,3.64.100mmol/LAs"储备液.1.3方法1.3.1菌株的筛选分离将0.5mL水样接种至c(As")为5和1Ommol/L的肉汤培养基的试管中培养;将沉积物样稀释100倍接种至C(As")分别为5和10mmol/L的肉汤培养基的试管中培养.再通过划线分离,得到纯化后的砷耐受菌.将砷耐受菌株经肉汤培养基活化24h后,按1%的接种量接种至c(NO一)为10mmol/L的Minimal培养基中(pH8.7,30℃)进行反硝化菌的定性筛选.首先通过格利斯试剂法定性判断培养基中是否含有NO一,若不存在,则认为该菌株有反硝化功能;若NO,一存在,则利用二苯胺试剂法检测是否存在NO:一,若存在,则表示该菌株具有反硝化功能.另一方面,将砷耐受菌株经肉汤培养基活化24h后,按I%的接种量接种至c(As")为1mmol/L的Minimal培养基中(pH8.7,30℃),高锰酸钾法¨变红即表示该菌株具有砷氧化功能.1.3.2菌株的形态学特征对筛选得到的菌株进行划线分离,观察菌落生长情况,并进行革兰氏染色,镜检观察.1.3.316SrDNA序列测定及系统发育分析采用DNA提取试剂盒(北京普博欣)提取DNA,以DNA为模板进行PCR扩增,扩增引物为通用引物(正向引物27F:5一AGAGTTTGA TCM TGGCTCAG一3,反向弓I物1492R:5一TACGGYT ACCTTGTTACGACTT一3,由上海英骏生物技术有限公司合成).PCR反应参数:94℃预变性3min;94℃变性40S,54℃退火50S,72℃延伸2min,35个循环;72oC延伸10min.通过琼脂糖凝胶电泳检验.PCR产物的纯化与测序由华大基因公司完成.用BLAST数据库进行对比鉴定.1.3.4菌株反硝化功能与砷氧化功能的测定将菌株cll一35肉汤培养基中活化24h,并统一OD值为0.015,然后按1%的接种量分别接种至c(NO一)为10mmol/L的Minimal培养基(NM),C(As)为1mmol/L的Minimal培养基(AM)以及c(NO一)为10mmol/L同时c(As")为1mmol/L的第l0期曾琳等:一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定1125 Minimal培养基(NAM)中.培养条件为:pH8.7,150r/min,30℃摇床培养.分别测定不同时间OD..值及c(NO,一),c(NO2一),c(As")和c(As).1.3.5分析方法C(NO一)采用酚二磺酸紫外分光光度法测定;c(NO,一)采用N一(1一萘基)一乙二胺光度法测定,紫外可见光光度计uV3000(Shimadzu,Japan);C(As")与c(As")采用高效液相色谱法(HPLC)测定,UItiMate3000(Dionex);HPLC反应条件为10%甲醇冲洗高效液相柱,流速0.5mL/min;流动相为3.6g/L磷酸二氢钠;调pH至5;经0.45tzm滤膜过滤;流速1mL/min;柱温30℃;进样体积20L.在该研究中,As"的出峰时间约为2.45min;As"出峰时问约为9.53rain;菌株的OD∞值使用紫外可见分光光度计NanoDrop1000(Thermo,USA)测定.2结果与讨论2.1分离菌株的形态学特征通过筛选分离获得的菌株cll一35同时具有反硝化和砷氧化功能.该菌株菌落较小且平滑,呈透明,白色,表面湿润,边缘整齐,生长较快;通过革兰氏染色,镜检观察,发现该菌株为革兰氏阴性菌.2.216SrDNA序列测定及系统发育分析通过BLAST检索与Genbank中的核酸序列进行同源性比对(/)发现,cl1.35菌株与木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans),反硝化无色杆菌(Achromobacterdenitrifics)和Achromobacterinsolitus的相似性都达到99%以上,综合以上结果可以认为,菌株cl1.35属于Achromobactersp.,使用ClustalX1.83和Mega4.1软件进行系统发育分析,得出cll一35系统发育树,见图1.图1显示,cll一35与AchromobacterxylosoxidansC8B亲缘关系最近.AchromobacterxylosoxidansJS1-2(DQ1049801) AchromobacterxylosoxMansJS1?1(DQ1049791 Achromobacterdenitrca?is22426(FJ8100801) AchromobacterxylosoxidansM66{HQ67660t1) AchromobacterxylosoxMansB8L(DQ4665681) AchromobacterinsolttusY2P1(EU2213791) AchromobacterxylosoxidansAU0665(hV4110191) Achromobacterxylosoxidansybb5(EU2146111) AchromobacterxylosoxidansIL-03(DQ9892132) AchromobacterxylosoxidansC8B(HQ4266481)chromobacterspcll一35图1基于16SrDNA序列同源性构建的c11-35系统发育树Fig.1Phylogenetictreebasedon16SrDNAsequencesofell一35andrelatedbacteria该菌属分别用于反硝化¨和砷氧化Ⅲ的菌株都有报道,但鲜见同时具有这2种功能的报道. 该多功能菌的存在使含砷生活污水(或工业废水) 的直接脱氮成为可能,具有很好的应用前景.另一方面,有研究¨表明,耐砷反硝化菌在自然界可能普遍存在,cll一35的分离也为此提供了依据. 2.3分离菌株的生长情况图2显示了菌株cl1—35在3种培养基中的生长情况.从图2可见,在AM培养基中,菌株c11—35 在停滞期(0～16h)没有生长,在32h达到对数期顶峰,并立即进入衰亡期,而在NAM培养基中,停滞期(0～16h)有缓慢生长现象,对数期延长至48 h,并且NAM中的长势较AM中更好.这说明在含砷情况下,NO一的存在可以促进菌株更好地生长,这可能是由于菌株对NO一的反硝化为其提供了能量.在NM与NAM培养基中,停滞期都有生长,48h后开始进入衰亡期;在0～48h内,NAM培养基中菌株的生长略高于NM培养基中, 最终,NM达到更高的峰值.2.4菌株的反硝化能力由图3可见,cll一35在NM培养基中,4d内将C(NO一)由12.69mmol/L降解至5.88mmol/L,并几乎达到平衡,去除率达53.65%;而在NAM培养基中,4d内将C(NO一)由l2.23mmol/L降解至环境科学研究第24卷时间/l1-I-NM培养基-O-AM培养基-~NAM培养基-o-NM培养基空白-0-AM培养基空白△NAM培养基空白图2菌株c11-35在3种培养基中生长曲线Fig.2Growthoftheell一35in3kindsofmedium接种菌株e11-35的NM培养基中的c(NO3一)◆接种菌株cll-35的NAM培养基中的c(NO一)◆接种菌株cll-35的NM培养基中的c(NO2)★接种菌株cll?35的NAM培养基中的c(NO2一).口_空白NM培养基中c(NO一)o空白NAM培养基中c(NO3一)_◇^空白NM培养基中c(NO一)△空白NAM培养基中c(NO2一)图3菌株cll-35的反硝化能力Fig.3Denitrificationabilityofcll一353.03mmol/L,去除率达75.27%,同时NO:～有少量的积累.根据物质守恒,推测其余被反硝化至气态氮(NO.或N:).在菌株生长停滞期(0～16h),c(NO一)基本不变,同时NO:一也没有相应的积累;而在对数期(16—32h)反硝化速率加快,去除率分别为47.10%和61.90%,占总反硝化量的85.30%和82.67%.若从C(NO,一)和C(NO一)的变化来看,NAM培养基中细菌相对于NM培养基在对数生长期(16～32h)的反硝化能力增强了1.31倍,说明As"的存在并未抑制菌株的活性,反而促进了菌株的反硝化作用,推测这与好氧反硝化的机理有关.孙庆鑫等曾提出一种假设:即好氧反硝化菌中存在一种可以醌氢类为供电子体,且不受氧分子抑制的orNAR(oxygenresistednitratereduc.tase,硝酸盐还原酶),和一种以Cytbcl为供电子体,且不受氧分子抑制的orNIR(oxygenresisted nitritereductase,亚硝酸盐还原酶).根据该假设,推测好氧反硝化菌中好氧反硝化代谢过程中有2条电子通道,一条通道为正常的好氧呼吸通道,即电子经NADPH和NADPH-Q传递给醌氢,再传递给细胞色素(Cytbcl,Cytc,Cytaa3),最后传递给氧分子;这条通道中Cytc和Cytaa3之间的电子传递存在"瓶颈"效应,电子流过剩时则经由第2条通道传递.过剩的电子通过醌氢类传电子体传递给orNAR,orNAR又将电子传递给NO一,将其还原为NO一,NO:一在orNIR的作用下接受从Cytbcl 传来的电子被还原为低价态的氮.而在As¨存在的情况下,As"的氧化给亚砷酸盐氧化酶A (AoxA)提供了2个电子,经由亚砷酸盐氧化酶B (AoxB)传递给Cytbcl,使得Cytc中出现了过剩的电子流,加剧了Cytc和Cytaa3之间的电子传递的"瓶颈"效应,迫使Cytbcl中的电子流向orNIR,为NO一的还原提供电子.这也就解释了为什么As¨的存在对NO:一还原的影响最大,强化效果最好. SUN等研究发现,在厌氧的环境下砷氧化和反硝化之问的联系试验中,当As¨存在时,反硝化过程中出现了N0的积累.由于试验条件的限制,笔者并未对N0的含量进行测量.好氧条件下砷是否对NO的还原有着相同的抑制作用有待进一步试验证明.2.5菌株的砷氧化能力由图4可看出,c1l一35在AM培养基中,32h内C(As")由0.6256mmol/L降至0.0024mmol/L,几乎达到平衡,As"氧化效率达99.62%,环境中积累的C(As")为1.0027mmol/L;在NAM培养基中,32h内c(As")由0.9793mmol/L降至第10期曾琳等:一株具砷氧化和反硝化功能的无色杆菌的筛选和鉴定接种菌株cll一35的AM培养基中的c(As")◆接种菌株cl1.35的NAM培养基中的c(As")★接种菌株cl1—35的AM培养基中的c(As)早接种菌株cl1.35的NAM培养基中的c(As)o空白AM培养基的c(As")空白NAM培养基的c(As")△空白AM培养基的c(As)-V-空白NAM培养基的c(As)图4菌株clI-35的砷氧化能力Fig.4Arseniteoxidizingabilityofcll一350.0052mmol/L,As氧化效率达到99.47%,环境中积累的c(As")为0.9196mmol/L.在菌株生长停滞期(0～16h),NAM培养基中菌株长势更好,AM培养基中菌株几乎没有生长(见图2),NAM培养基中As"被氧化得更迅速,同时开始大量积累As".而在AM培养基中,虽然也有部分As"被氧化,但是As"的积累却不明显.因此,可能菌株cll一35仅仅利用砷氧化作为一种解毒机制,而不是以As"为电子供体为细胞生长提供能量.而在对数生长期,在AM培养基中菌株生长更为迅速,同时含砷Minimal培养基中As开始大量积累,其中的C(As")超过了NAM培养基.同时绝大部分As"在对数生长期结束时都已经被氧化,但培养基质中却没有出现等量的As",这有可能是因为As与磷酸基团有类似的结构,通过磷酸通道蛋白(phosphatetransporter,Pit/Pst)进入细胞,并在细菌体内聚集.CAI等研究发现,很多微生物都含有与砷解毒有关的基因,经常在一起成簇出现,可称为"砷解毒基因岛"或"砷解毒基因簇".可以推测在该株多功能砷氧化菌中,同时拥有亚砷酸盐氧化酶和砷酸盐还原酶的表达基因.氧化和还原2个过程在菌株中同时发生,很可能存在动态平衡,且氧化速率远大于还原速率.根据SANTINJ等的研究,砷的氧化解毒机制中存在下列反应:2H3AsO3+O2=HAsO4一+H2AsO4一十3H而反硝化反应是产碱的,因此在NAM培养基中砷氧化的动态平衡反应能向反应式右边移动. 此外,由于NO一可以作为供同化作用的电子受体,因此在NAM培养基中生长得更为繁盛,同时也导致了细菌活性更大,解毒能力更强,体内能够积累更多的As".这些因素都导致了砷氧化的动态平衡反应能向上述反应式右边移动,在宏观上表现为NO一增强了砷氧化的能力.3结论a.筛选出一株同时具有反硝化和砷氧化功能的菌株cll一35,经鉴定为革兰氏阴性菌,属于Achromobactersp..b.As"对菌株cll一35的生长有明显的抑制作用,而NO一的存在缓和了这种抑制.在O～16h, cl1.35在AM培养基中没有生长,在32h达到对数期顶峰,并立即进入衰亡期;而在NAM培养基中, 0～16h菌株有缓慢生长,且在48h后才进入衰C.As"的存在促进了菌株cll一35的反硝化作用.在NM培养基中NO一的去除率为53.65%,而在NAM培养基中NO一的去除率为75.27%.d.在含NO,一和不含NO一的条件下,cll一35对As"的氧化效率都达到了99%以上,而在含NO一的条件下,菌株的生长趋势更好,氧化速率更快.在含NO一的条件下,16h内As"的氧化效率就达到了84.96%,而不含NO一的条件下,As"的氧化效率为36.64%.参考文献(References):[1]CULLENWR,REIMERKJ.Arsenicspeciationinthe environment[J].ChemicalReviews,1989,89:713—764. 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吴丽红，李晓惠，杨　芳，等．１株用于生物强化的高效反硝化菌的筛选鉴定［Ｊ］．江苏农业科学，２０１４，４２（１２）：３７１－３７３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１４．１２．１２５１株用于生物强化的高效反硝化菌的筛选鉴定吴丽红１，李晓惠１，杨　芳１，王　丹２（１．辽宁科技学院生物医药与化学工程学院，辽宁本溪１１７００２；２．辽宁大学药学院，辽宁沈阳１１００３６） 摘要：从生物脱氮工艺的反硝化段活性污泥中分离到７株反硝化菌，考察了其脱氮能力后优选出代表菌株ＦＨ２，该菌在４００ｍｇ／ＬＮＯ３－－Ｎ浓度下，对ＮＯ－３－Ｎ的去除率为１００％，且脱氮过程中亚硝酸盐基本无积累，表现出了很强的脱氮能力，可作为生物强化法处理高浓度氨氮废水的菌源。

通过对该优势功能菌株进行形态观察、生理生化试验及１６ＳｒＤＮＡ的序列测定和同源性分析，结果表明该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ）。

该菌反硝化能力强，且具有芽孢微生物的特点，以该菌做为菌源进行生物强化反硝化脱氮研究有很好的应用前景。

关键词：氨氮废水；反硝化脱氮；生物强化；优势反硝菌；筛选鉴定 中图分类号：Ｘ１７２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１４）１２－０３７１－０３收稿日期：２０１４－０２－２７基金项目：辽宁省教育厅科学技术研究项目（编号：Ｌ２０１１２２５）。

作者简介：吴丽红（１９８０—），女，辽宁阜新人，硕士，讲师，从事污（废）水生物处理研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｌｉｈｏｎｇ１９８０＠１６３．ｃｏｍ。

氮、磷是废水中常见的无机营养物，是引起湖泊富营养化的主要因素。

大量含氮废水排入水体不仅引起水体富营养化、造成水体黑臭，而且增加水处理的难度、成本，甚至对人类产生毒害。

含氮废水对环境的影响已引起研究人员的重视［１］。

目前，国内外普遍采用物理法、化学法、生物法处理高浓度氨氮废水，这些方法各有优点，同时也都存在不足［２－４］。

低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选及鉴定好氧反硝化过程是在无氧条件下发生的，它在自然界，特别是水体中扮演着重要的角色，它可以有效地去除水体中氧化态氮，防止氮垂直蔓延现象。

其研究以及应用价值日趋受到重视。

近年来，由于气候变暖和空气污染，国内外陆源氮污染严重，使得硝化活性的抑制已成为当前水环境研究的主要方向之一。

因此，掌握和研究低温低碳氮比下好氧反硝化微生物的自然界分布，以及其分类学、生理特性，以及其反硝化降解能力及其功能基因的研究，将有助于分析其调控反硝化的分子机制，为抑制水体的氮污染提供科学依据，同时为好氧反硝化应用提供技术支持。

低温低碳氮比下好氧反硝化菌的筛选鉴定一般有多种途径，其中主要包括分子生物学技术、细胞生物学技术和底物浸泡-无氧脱氮法。

多种分子生物学手段可用于研究指定的好氧反硝化菌的定量和定性，检测其真菌等类型，以及其反硝化DNA序列，并进行克隆定序。

细胞生物学技术可用于研究传统的好氧反硝化菌离子力学性质，特别是其对氧化态氮，特定氧化剂以及不同底物的反硝化特性，以及其他有利气体，离子营养物质和其他反硝化因子的吸收特性。

底物浸泡-无氧脱氮法是一种通过浸泡或淋洗被研究物质，再经过长时间的放置，使其无氧状态下，而有效地去除土壤中的氮素，以测定好氧反硝化菌的反硝化能力。

此外，反硝化实验室可以根据样品的种类，采用不同的技术方法，结合并行测序、宏基因组学等获取好氧反硝化菌群体的初步结构数据，并具体分析不同反硝化菌株的反硝化机制。

总之，为了充分发挥低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选鉴定，反硝化研究者需要选用恰当的技术，结合物种和品系特性，采取合适的方法，有效地获得其反硝化机制相关信息，从而为抑制水体中氮素污染提供更多的科学依据。

反硝化菌培养流程
反硝化细菌的培养需要遵循以下步骤：
1. 富集培养：首先，需要准备适合反硝化细菌生长的培养基。

常用的培养基成分包括KNO3、柠檬酸钠、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O和陈海水（或蒸馏水）。

将这些成分溶解于水后，调整pH至，然后分装于试管或烧瓶中。

在121℃的蒸汽下灭菌20分钟以杀死有害微生物。

接着，在富集培养液的试管中分别加入少量的海泥、池泥或河泥。

在20℃或25-30℃下培养5-15天或3-10天。

如果培养液变混浊，有气泡产生，或者检验到有氨和亚硝酸产生，则说明有反硝化细菌生长。

2. 分离培养：在富集培养的基础上，可以通过适当的分离培养基进行反硝化细菌的分离。

分离培养基的成分包括葡萄糖、酒石酸钾钠、KNO3、
K2HPO4、CaCl·2H2O和陈海水（或蒸馏水）。

将这些盐类溶于水中，调整pH至，然后装入烧瓶中。

在121℃的蒸汽下灭菌20分钟。

将经过富集培养的反硝化细菌接种到分离培养基中，继续在20℃或25-30℃下培养。

通过观察和检测，可以挑选出具有优良反硝化性能的菌株。

请注意，上述步骤仅为反硝化细菌培养的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。

同时，工作人员应确保实验操作的安全性，穿戴适当的防护装备，并遵循相关的实验室安全规定。

Isolation,Identification and Nitrogen Removal Characteristics of Heterotrophc Nitrificationand Aerobic Denitrifying Bacteria 作者： 孙巍[1,2,3];宋玉文[1];洪维祎[1];夏春雨[1,2,3]
作者机构： [1]龙岩学院;[2]福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室;[3]福建省生猪疫病防控工程技术研究中心,福建龙岩364000
出版物刊名： 龙岩学院学报
页码： 82-88页
年卷期： 2017年 第5期
主题词： 异养硝化 好氧反硝化 分离鉴定 脱氮性能
摘要：从龙岩市某污水处理厂的活性污泥中富集分离纯化得到一株具有较高脱氮能力的异养硝化-好氧反硝化菌,命名为LT-11。

通过菌落形态、生理生化和16S rDNA序列分析,LT-11初步鉴定为Pseudomonas putida。

通过单因素实验考查碳源、pH、温度及溶解氧对该菌株的脱氮性能影响。

结果表明：菌株LT-11最适碳源为琥珀酸钠,pH为7~7.5,温度为25~30℃,摇床转速180 r/min,该菌株氨氮去除率达90%以上。

同时该菌株具有良好的好氧反硝化能力,24 h硝酸盐氮（初始浓度50mg·L^-1）去除率接近80%,且没有亚硝酸盐氮积累。

好氧反硝化细菌LKX－1的分离、鉴定及初步应用研究刘立立;兰时乐;杨友才【摘要】A high efficient aerobic denitrifier was isolated from rice field to dispose the rural domestic sewage,then the strain was identified and its nitrogen removal effect was analyzed.The results showed that the strain was identified as Pseudomonas monteilii through analyzing the cell morphology,colony morphology, physiological and biochemical characteristics combined with 16S rDNA sequence.The preliminary studyon ni-trogen removal conditions of rural domestic sewage showed that with the glucose additive amount of 0.03%, inoculation amount of0.00015%,rotation speed of 120 r/min and cultural time of 48 hours,the removal rate of TN and NO -2 -N reached 91.55% and 96.33% respectively.%为筛选分离好氧反硝化细菌菌株用于农村生活污水处理，从水稻田中分离高效好氧反硝化细菌菌株，并进行鉴定及除氮效果分析。

结果表明，通过菌体、菌落形态特征和生理生化指标并结合16S rDNA 序列分析将该菌株鉴定为蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）；农村生活污水除氮条件初步研究结果表明，在葡萄糖添加量0．03％、接种量0．00015％、摇床转速120 r／min 和发酵处理时间48 h 条件下，总氮和亚硝酸盐氮去除率分别达到91．55％和96．33％。

硝化细菌分离与鉴定硝化细菌-一类专性化能自养（无机营养）细菌，包括亚硝化菌和硝化细菌两个菌群，一般种类不能生长在有机培养基中。

在有氧的条件下，亚硝化细菌群将氨氮转化亚硝酸氮，硝化细菌群将亚硝酸氮转化硝酸氮，两者常生长在一起。

硝化细菌分离比较困难，由于它生长缓慢，平均代时10-20h以上，且不同菌株间差异较大。

1.硝化细菌分离：1.1分离材料：氨场周围的土壤池塘或污水出水口污泥1.2培养基：1.2.1富集培养基：亚硝化细菌培养基：1）硫酸铵5g/l 磷酸二氢钾0.7g/l 硫酸镁0.5g/l 氯化钙0.5g/l 用5％碳酸钠调PH8.0 （硝化细菌用亚硝酸钾2 g/l代替硫酸铵5g/l）2）硫酸铵2g/l 氯化钠0.3g/l 硫酸亚铁0.03g/l磷酸氢二钾1.0g/l 硫酸镁0.03g/l 碳酸氢钠1.6g/l PH7.5-8.01.2.2分离培养基：亚硝化细菌培养基：甲液：硫酸铵11.0g 硫酸镁1.4g硫酸亚铁0.3g蒸馏水100ml乙液：磷酸二氢钾1.36g 蒸馏水100ml甲：乙=9:1 PH8.0-8.2硝化细菌培养基：硫酸铵2.0g磷酸氢二钾1.0g/l硫酸镁0.5g/l氯化钠2.0g/l硫酸亚铁0.4g/l碳酸钙5.0g/lPH7.5-8.0用亚硝酸钾2.5 g代替硫酸铵11.0g。

为增加硝化细菌的分离效果，在培养液中添加1％粉状碳酸钙和0.04ml/100ml微量元素溶液。

1.2.3BPY(肉膏蛋白胨酵母膏培养基)牛肉膏5g/l 酵母膏5g/l 蛋白胨10g/l 氯化钠5g/l 葡萄糖5g/l PH7.0（检查硝化细菌纯度用）1.3富集培养：取泥样1.0g或1.0ml活性污泥接入30ml/250ml三角瓶或10ml/18x180mm试管中，28-30℃130r/min震荡培养，每隔几天用格利斯试剂在白瓷板上检验亚硝酸根的生成，培养7-8d后培养液遇格利斯试剂呈红色，表明有亚硝酸盐存在。