实验一 线粒体的超活染色

实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。

线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。

一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。

2.组织捣碎机或者匀浆器。

3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。

4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。

5.显微镜、冰浴。

6.分光光度计。

二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。

2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。

3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。

4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。

5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。

6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。

7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。

三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。

所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。

[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。

细胞生物学实验报告题目：小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察姓名：刘恋学号：201000140049 系年级：10级生科2班一、【实验目的】1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。

2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。

二、【实验原理】1．线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。

细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。

活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。

詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。

线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

不同细胞中线粒体的形态和数目不同。

在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。

线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。

线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。

2．活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。

它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。

活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。

碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。

但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。

一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。

线粒体染液-詹姆斯绿B Janus green B的使用及其原理60JanusgreenB中文名称：詹纳斯绿B英文名；小鼠肝细胞线粒体的JanusgreenB染色及观；1.实验目的：学习超活染色的原理及方法，用詹纳斯；（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、；（2）实验药品：蒸馏水、Ringer液、詹纳斯绿；（1）活体染色又称超活染色，是指对生命有机体的细；目的：显示生活中细胞的某种结构，不影响细胞的生命；应用：研究Janus green B 中文名称：詹纳斯绿B 英文名称：Janus green B 别名：健那绿；双氮嗪绿。

苏铁木精英文别名: Janus green；Diazine green；Diazine green S 。

化学式：C30H31N6Cl 定义：主要用于生物活体染色的一种碱性偶氮吖嗪染料。

能穿过细胞膜，进入细胞特异地显示线粒体。

詹纳斯绿B是一种活体染色剂，专一用于线粒体的染色。

它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合，从而出现蓝绿色。

原理是线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

必须指出的是，只有具有活性的细胞色素C氧化酶才能够把詹纳斯绿B氧化，从而使它显出颜色，因此，在实验过程中务必保持所取的材料的活性。

通常，需要把生物材料置于0℃～4℃的冰水浴低温中，并且操作要迅速。

Cas 编号: MDL 编号: 分子式: 中文别名: 2869-83-2 MFCD00011758 C30H31ClN6 EINECS 编号: 220-695-6 Beilstein 编号: 分子量: 511.06 詹姆斯绿B，健那绿，健那绿B，双氮嗪绿，真那氏绿，詹姆斯绿，烟鲁绿，3-(二乙基氨基)-7-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-5-苯基吩嗪翁氯化物3-Diethylamino-7-(4-dimethylaminophenylazo)-5-phenylphenazinium 英文别名: chloride Diazin Green S Union Green B C.I. 11050 棕色呈深棕色结晶性粉末，溶于水呈蓝色，微溶于醇。

【作 作
业】
一、绘图：人口腔上皮和小鼠肝细胞的超活染色结果。 绘图：人口腔上皮和小鼠肝细胞的超活染色结果。 线粒体和液泡系活体染色的原理是什么？ 二、线粒体和液泡系活体染色的原理是什么？
Experiment 10
线粒体和液泡系的活 细胞染色
【实验目的 实验目的】 实验目的
1．掌握细胞超活染色制作光镜标本的方法 ． 2. 了解线粒体和液泡系的基本形态、数量和分布 了解线粒体和毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构 而不影响细胞生命活动的一种染色方法。活染技术可用于研究生活状态下的细 胞形态结构及生理和病理变化。活体染色包括体内活染和体外活染两类。体外 活染又称为超活染色，是从活的动植物体分离出组织小块或部分细胞，以染液 浸染，使得染料选择性结合在细胞的特定结构上而显色。 詹纳斯绿 B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料毒 性小，是活体染色最重要的染料，对于线粒体和液泡系各具专一性。 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。詹纳斯绿 B 是线垃体的专一性活体染色剂，这是因为线粒体内的细胞色素氧化酶系可使染 料保持氧化状态呈蓝绿色，而在线粒体周围的细胞质中染料被还原为无色的色 基。 细胞内凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括 高尔基复合体、溶酶体、微体、吞噬泡等。中性红是液泡系专一的活体染色剂， 可将活细胞中液泡系染成红色，中性红染色可能与液泡中的某些蛋白有关。
【实验内容】 实验内容】
一、口腔上皮细胞线粒体的超活染色 1. 在洁净的载玻片上滴2-3d詹纳斯绿B和中性红混和染液。 2. 用消毒牙签在口腔颊部刮取口腔黏膜上皮，在染液中搅匀，染色15min。 3. 盖上盖玻片后镜检。可见细胞质中散在的被染成亮绿色的短杆状或颗粒状 线粒体。 二、小鼠肝细胞的超活染色 1. 小鼠颈椎脱臼处死，迅速打开腹腔，剪取肝脏边缘较薄的组织，置于含 Ringer液的平皿中，挤压去除组织中的血液，洗涤2-3次后吸去Ringer氏液。 2. 平皿内加詹纳斯绿B和中性红混和染液，注意让组织块上表面微露在染液 外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，使线粒体着色。 3. 染色25-30min，可见组织块边缘染成蓝色。将组织块用Ringer氏液洗涤1 次后转移至载玻片上，用镊子将组织块拉碎，使部分细胞或细胞群从组织块 脱离分散。 4. 去除稍大的组织块，使游离的细胞或细胞群留在载玻片上，盖上盖玻片， 镜检。可见肝细胞中含量丰富的线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。