考马斯亮蓝法测蛋白浓度

实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。

二实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。

其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。

该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三实验材料1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品2. 主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。

3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。

此溶液在常温下可放置一个月。

四实验步骤标准曲线制作：取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。

摇匀后放置2min ，用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

表1 低浓度标准曲线制作管号 0 1 2 3 4 51mg/ml标准蛋白(ml)0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250（ml）555555蛋白浓度（mg /ml）00.02 0.040.060.080.10OD595nm00.3390.4910.6010.7750.799上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=7.7329x+0.11422．未知蛋白质浓度的测定另取2 支10mL 试管，按下表取样。

考马斯亮蓝测蛋白实验报告
马斯亮蓝测蛋白实验是化学分析技术中应用最为广泛的技术之一，其原理是利用马斯
亮蓝将蛋白中的氨基酸氧化，产生具有一定的比色性的氧化物，通过计算氧化物的吸光度
来直接测定蛋白质的含量。

马斯亮蓝测蛋白实验根据特定实验条件和工艺，可以准确定量蛋白质含量。

在实验中，研究人员先使用8.5pH碱性缓冲液将样品稀释到一定浓度，然后加入溶液彻底混匀，使原
有蛋白受到最大程度的破坏。

之后加入一定量的马斯亮蓝将样品进行氧化处理，在得到的
氧化物中可以测得蛋白质的吸光度，蛋白质浓度与马斯亮蓝的加入量之间的关系可以进行
定量分析，从而得到实验报告。

马斯亮蓝测蛋白实验的光谱测定结果，表示得到的样品中的蛋白浓度在一定限度之内，可以得到较准确的实验数据。

因为影响马斯亮蓝测蛋白实验结果的诸多因素，包括温度，
时间，pH，样品浓度等，研究人员必须要有严谨的工作态度，控制实验过程，以期得到准
确的结果。

注意：
1.马斯亮蓝测蛋白实验要求使用核酸的处理显示更令人印象深刻的比色性能，因此，
在选择核酸提高反应效果时，必须使用天然的硫酸盐，而不能使用过量神经酸合成有机化
合物。

2.使用高浓度马斯亮蓝，要特别注意实验过程中样品原有物质，不同物质之间的性质，可能会阻碍实验结果。

3.样品应该在柔和条件下恒温，不能长时间受热或冷却，以确保测试不受干扰。

总之，马斯亮蓝测蛋白实验应用广泛，具有精确、快速、经济等特点。

将会在生物化
学实验室的研究中发挥重要作用。

准确的测试方法和技术操作，是实验的基本要求，实验
结果更好地反映出所测样品的性质特点。

用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。

实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。

此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。

蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。

此反应重复性好，精确度高，线性关系好。

标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。

强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。

Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。

但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中的细节问题一、本文概述本文旨在深入探讨考马斯亮蓝法（Coomassie Brilliant Blue, CBB）在蛋白质含量测定中的细节问题。

考马斯亮蓝法是一种常用的生物化学技术，其基本原理是通过考马斯亮蓝染料与蛋白质的结合，形成有色化合物，从而实现对蛋白质含量的定量测定。

该方法因其操作简单、灵敏度高、适用范围广等优点，在生物学、医学、农学等领域得到了广泛应用。

然而，在实际应用中，考马斯亮蓝法也存在一些细节问题，如染料的选择、溶液的配制、样品的处理等，这些问题都可能对测定结果产生影响。

因此，本文将从染料的选择与配制、样品的处理、测定条件的优化等方面，详细阐述考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中的细节问题，以期提高该方法的准确性和可靠性，为相关领域的研究提供有益参考。

二、实验原理考马斯亮蓝法（Coomassie Brilliant Blue Method）是一种常用的蛋白质含量测定方法，其基本原理是利用考马斯亮蓝染料与蛋白质之间的相互作用。

考马斯亮蓝染料是一种阴离子染料，它在酸性条件下能与蛋白质结合，形成有色化合物，这种化合物在特定波长下具有最大吸光度，通常是在595nm。

当考马斯亮蓝与蛋白质结合时，染料的最大吸收峰会从原本的465nm 红移至595nm，并且吸光度与蛋白质含量成正比。

因此，通过测定595nm处的吸光度，可以推算出蛋白质含量。

该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点，因此在生物化学、分子生物学、蛋白质组学等领域得到了广泛应用。

然而，考马斯亮蓝法也存在一些细节问题需要注意，如染料与蛋白质的结合受pH值、温度、离子强度等多种因素影响，因此在进行蛋白质含量测定时，需要严格控制实验条件，以获得准确的结果。

考马斯亮蓝法主要适用于测定分子量较大、结构稳定的蛋白质。

对于分子量较小或结构不稳定的蛋白质，可能需要采用其他方法进行测定。

由于考马斯亮蓝染料与蛋白质的结合是非特异性的，因此该方法不能用于测定蛋白质的种类或结构。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量注意事项
考马斯亮蓝法是一种常用的测定蛋白质含量的定量分析方法，以下是在进行考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时需要注意的一些事项：
1. 样品处理：样品的处理对测定结果有重要影响，需要遵循实验步骤，保证样品的准确性和可重复性。

2. 样品浓度：样品的浓度应在试剂工作范围之内，过高或过低的浓度可能会导致测定结果的失真。

若样品浓度超过试剂浓度范围，需要进行适当的稀释或浓缩。

3. 样品纯度：测定蛋白质含量时，需要保证样品的纯度。

若样品中含有其他干扰物质，可能会影响测定结果。

因此，在测定前应选择适当的样品纯化方法，去除干扰物质。

4. 操作技巧：操作时需要严格按照实验步骤进行，尤其是在各种试剂的加入和混匀过程中需要注意操作技巧。

加入试剂时要避免泡沫的产生，混匀时要均匀、彻底，确保各组分充分反应。

5. 器皿选择：选择合适的器皿进行测定，尽量避免对试剂和样品的吸附或反应影响。

常用的器皿有比色皿、离心管、量筒等。

同时需要注意器皿的清洁，避免残留其他物质对测定结果的影响。

6. 光程选择：根据试剂的要求，选择合适数值的比色皿或离心管，保证样品的透光性和光程的准确性。

较精确的测定需要较
准确的光程值。

7. 记录结果：测定完毕后，准确记录测定的结果。

如果需要比较多组或者多种样品之间的差异，需要对每个样品分别测定，并进行统计分析。

总之，进行考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，需要注意样品处理、样品浓度和纯度、操作技巧、器皿选择、光程选择以及结果记录等方面的事项。

只有遵循操作规范，才能得到准确可靠的测定结果。

蛋白质浓度测定：考马斯亮蓝法和紫外光吸收法——学习指南
l 学习重点
1. 掌握考马斯亮蓝法的基本原理和操作。

2. 掌握紫外光吸收法的基本原理和操作。

l 知识要点
1. 蛋白质含量常用的测定方法：凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret 法）、Folin-酚试剂法（Lowry 法）、考马斯亮蓝法（Bradford 法）和紫外吸收法。

2. 考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝G250与蛋白质的疏水微区结合，可快速呈现出蓝色，在595nm 处有最大吸收。

SO +
考马斯亮蓝G250
3. 紫外吸收法：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 处。

酪氨酸
色氨酸
苯丙氨酸
l 试剂
1. 0.1mg/mL 标准蛋白质溶液。

2. 0.9% NaCl 溶液。

3. 0.01%考马斯亮蓝G250溶液。

4. 未知浓度的蛋白质样品。

l 仪器
旋涡混合仪、紫外可见分光光度计、移液器 l 操作
l 注意事项
1. 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时应注意其线性范围。

2. 应尽快完成比色测定，时间放置过长，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物易凝集沉淀。

3. 紫外法测定蛋白质样品时应选用
石英比色皿。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验概要bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。

coomassie brilliant blue g-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。

灵敏度比lowry法高4倍，与bca法相当。

反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。

操作简便，只需要一种反应试剂。

实验原理考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

主要试剂考马斯亮蓝g-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝g-250粉末溶于5ml 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10ml 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（h3po4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5ml移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100ml。

后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。

长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的od值较低，对仪器要求较高。

标准牛血清白蛋白（bsa）：精确称取4mg bsa粉末，溶于1ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，-20℃保存。

（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg bsa 粉末，溶于10ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。