蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表达分析

三叶草基因工程研究进展摘要 三叶草作为优良的牧草，具有营养丰富、品质优良、适口性好等特点。

现代生物技术的不断发展为三叶草育种和种质创新提供了新的技术手段，笔者从三叶草再生和遗传转化体系，转基因三叶草在品质改良、抗病性、抗虫性、抗逆性及作为植物反应器等方面的研究进展进行了全面综述，分析了三叶草基因工程研究中存在的主要问题，并对其应用前景和研究方向进行了展望。

关键词 三叶草 再生体系 转化体系 转基因中图分类号前言三叶草属，也称车轴草属，全球约250余种，原产亚洲南部和欧洲东南部。

野生种分布于温带及亚热带地区，为栽培历史较悠久的牧草之一，现已遍布世界各国，其中栽培面积最大的是西欧、北美、大洋洲和原苏联地区。

三叶草主要用作反刍动物的饲草饲料。

是一种世界性分布与栽培的优良豆科牧草。

该属在农业上有经济价值的有25种，其中最重要的约10种。

我国是世界上第2草地大国，三叶草在我国广泛种植，常见的野生种有白三叶、红三叶、草莓三叶草和野火球4种；引自国外的有杂三叶、绛三叶、地三叶和埃及三叶4种；目前栽培研究较多的是白三叶、红三叶及地三叶[1]。

三叶草具有生态适宜性强、侵占性强、耐践踏、利用年限长、营养丰富、产量高、耐粗放栽培管理、抗病虫危害和种植利用成本费用低等优点。

作为我国最重要的豆科牧草之一,三叶草不仅是重要的饲料作物,还在土壤改良、水土保持以及生态环境保护方面发挥着积极的作用。

但是,三叶草缺乏含硫氨基酸、较不耐旱、抗虫性差、易感染苜蓿花叶病毒等问题,常规育种难以解决,通过基因工程方法将目的基因导入三叶草是改良三叶草品质,增强其抗病、抗虫、抗逆能力的有效手段.近年来随着植物基因工程研究的进展,越来越多的转基因成功的报道也不断出现。

三叶草通过生物技术研究,可实现高蛋白基因、固氮基因、病虫害基因及抗逆性基因等转移,培育造福人类的牧草新品种，而必将会极大地促进畜牧业发展，促进地被覆盖和生态建设，对当地人民生活水平和生活环境的提高和改善具有重要的实践意义。

紫玉兰‘红元宝’Ml3GT1基因的克隆及表达分析作者：王卓为戴梦怡程少禹王小德王亚玲申亚梅张超来源：《广西植物》2022年第08期摘要： UDP-类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）是花青素生物合成途径的重要催化酶之一。

为研究其在紫玉兰花青素苷合成途径中的作用，该文以紫玉兰品种‘红元宝’（Magnolia liliflora ‘Hongyuanbao’）为材料，根据转录组测序获得的3GT序列设计引物，利用RT-PCR技术克隆花青素苷生物合成途径中的结构基因Ml3GT1，并对其进行生物信息学和表达模式分析。

结果表明：（1）Ml3GT1基因的cDNA序列长度为1 863 bp，其中最长开放阅读框（ORF）为1 374 bp，编码一条457 aa的肽链，相对分子质量为49.37 kDa，理论等电点（pI）为6.04。

（2）氨基酸序列比对显示其具备典型的植物次生产物糖基转移酶信号序列（PSPG box）。

（3）系统发育分析结果表明，Ml3GT1蛋白与小苍兰、矮牵牛、番薯等物种的3GT蛋白聚在一支。

（4）qRT-PCR结果显示Ml3GT1基因的表达具有时空特异性，在花中的表达量最高，在嫩叶和老叶中有少量表达，而在根和茎中几乎不表达;随着花的发育，Ml3GT1基因的表达量呈现先降低后升高的趋势，并在盛花期达到最高。

上述结果表明，Ml3GT1可能参与类黄酮3-O的糖基化修饰，本研究结果将为木兰属植物花色育种研究奠定基础。

关键词：紫玉兰，花色，糖基转移酶，基因克隆，表达分析中图分类号： Q943文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2022）08-1417-09Cloning and expression analysis of Ml3GT1 inMagnolia liliflora ‘Hongyuanbao’WANG Zhuowei1， DAI Mengyi1， CHENG Shaoyu1， WANG Xiaode1， WANGYaling2，SHEN Yamei ZHANG Chao（ 1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization for Garden Plants/Key Laboratory of National Forestry andGrassland Administration on Germplasm Innovation and Utilization for Southern Garden Plants/College of Landscape Architecture，Zhejiang A & F University， Hangzhou 311300，China; 2. Xi’an Botanical Garden，Xi’an 710061， China ）Abstract： UDP-flavonoid 3-O-glucosyltransferase （3GT） is one of the important catalytic enzymes in the anthocyanin biosynthesis pathway. To study the function of 3GT in anthocyanin biosynthesis of Magnolia liliflora，M. liliflora ‘Hongyuanbao’ was employed as materials. Primers were designed based on the 3GT sequence obtained from the transcriptome database of M. liliflora‘Hongyuanbao’， and the structural gene Ml3GT1 in anthocyanin biosynthesis pathway was cloned by RT-PCR （reverse transcription-PCR）， and its bioinformatics and expression pattern were analyzed. The results were as follows：（1） The cDNA sequence length of Ml3GT1 was 1 863 bp， and the open reading frame was 1 374 bp， encoding 457 amino acid residues. The relative molecular weight of Ml3GT1 was 49.37 kDa， and its isoelectric point was 6.04. （2） The deduced amino acid sequence of Ml3GT1 contains a conserved plant secondary product glycosyltransferase signature sequence （PSPG box）. （3） Results of the phylogenetic analysis showed that Ml3GT1 protein was closely relative to 3GT proteins from Freesia hybrida， Petunia × hybrida， and Ipomoea batatas. （4） Results of fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） revealed that Ml3GT1 has spatio-temporal specificity， with the highest expression level in flowers， the lower expression level in young leaves and old leaves， and little expression in roots and stems; With the development of flowers， the expression level of Ml3GT1 gene decreased first， then increased， and showed the highest expression level at the fully-flowering period. These results suggest that Ml3GT1 may be involved in flavonoid 3-O-glycosylation. This study will lay a foundation for the flower and color breeding of Magnolia plants.Key words： Magnolia liliflora， flower color， glycosyltransferase， gene cloning，expression analysis花色是观赏植物重要的品质性状之一，花青素苷（anthocyanin）是由花青素苷元（anthocyanidin）和糖組成的糖苷，是影响花色的一类重要色素物质（戴思兰和洪艳，2016）。

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄菌代谢产物在４０～５０℃温度范围内抑菌率差异不显著，高于６０℃时代谢产物抑菌率显著下降（Ｐ＜０．０５）；研究显示几种盐离子对代谢产物的抑菌率均有一定的负作用；紫外线照射处理１０ｍｉｎ内该菌代谢产物抑菌性能稳定，紫外线照射处理时间大于１５ｍｉｎ时抑菌率逐渐下降。

利用ＬＢ培养基培养时，菌株Ｇ１０形成的生物膜Ｄ５７０ｎｍ平均值为１．１２５，利用Ｌａｎｄｙ培养基培养时，Ｄ５７０ｎｍ平均值为１．６３２。

有研究显示，生防菌生物膜的形成能力与其防效呈正相关［９－１０］。

内生细菌Ｇ１０菌株为芽孢杆菌，利用其产芽孢的优势，相对耐受不良环境的能力强，结合以往关于该菌对芝麻立枯病生防的研究，该菌在芝麻苗根部定殖能力强，温室试验防效为８０％，田间小区试验防效为６１％；该菌株有作为生防制剂的开发潜力。

参考文献：［１］ＷａｈｉｄＯＡＲＡ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｓｏｍｅｓｅｓａｍｅ（ＳｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍＬ．）ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓａｇａｉｎｓｔｒｏｏｔｒｏｔｄｉｓｅａｓｅ（ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＫüｈｎ）ｕｎｄｅｒｆｉｅｌｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，２００７，４７（３）：３２１－３２７．［２］ＡｍａｒｅｓａｎＮ，ＪａｙａｋｕｍａｒＶ，ＫｕｍａｒＫ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｏｎｔｏｍａｔｏ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）ａｎｄｃｈｉｌｌｉ（Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ）ｓｅｅｄｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，６２（２）：８０５－８１０．［３］王　刚，沈永红，王俊芳，等．蜡样芽孢杆菌Ｂ３－７菌株对小麦全蚀病菌的抑制作用［Ｊ］．河南大学学报（自然科学版），２００５，３５（１）：６２－６４．［４］ＱｉａｎＳ，ＬｕＨ，ＭｅｎｇＰ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｎｕｌｉｎｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎＤｉｎＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｆｍｂＪ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，１７９：２６０－２６７．［５］ＲｙａｎＲＰ，ＧｅｒｍａｉｎｅＫ，ＦｒａｎｋｓＡ，ｅｔａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ：ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００８，２７８（１）：１－９．［６］王俊芳，王　淼，郭妍伟，等．芝麻内生细菌Ｇ１０菌株对芝麻立枯病的生防作用［Ｊ］．北方园艺，２０１１（１）：１６６－１６８．［７］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２００１：１２０．［８］沈　萍，陈向东．微生物学实验［Ｍ］．４版．北京：高等教育出版社，２００７：１４２．［９］ＤｏｇｓａＩ，ＯｓｌｉｚｌｏＡ，ＳｔｅｆａｎｉｃＰ，ｅｔａｌ．ＳｏｃｉａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｎｄｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，５２（２）：１４９－１５７．［１０］ＹａｎｇＰ，ＳｕｎＺＸ，ＬｉｕＳＹ，ｅｔａｌ．ＣｏｍｂｉｎｉｎｇａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｓｔａｇｅｓｏｆｃｏｔｔｏｎｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｏｆＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｗｉｌｔ［Ｊ］．ＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２０１３，４７（５）：１７－２３．鲁京慧．紫茎泽兰叶浸提液对４种冰草的化感作用［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（９）：９０－９４．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．０９．０２０紫茎泽兰叶浸提液对４种冰草的化感作用鲁京慧（河北旅游职业学院，河北承德０６７０００） 摘要：利用生物检测法研究紫茎泽兰叶浸提液对４种冰草的化感作用。

浙江农业学报 Acto Agr/cw/加rae , 2016,28(11):1822 -1827http://w w 瓮巧云，赵彦敏，张贺，等.玉米ZmKEM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析[J].浙江农业学报，2016,28( 11 ): 1822 -1827.DOI：10. 3969/j. issn. 1004-1524. 2016. 11. 03玉米Zw及EM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析瓮巧云1,赵彦敏2,张贺1,宋晋辉1,马海莲1,袁进成1,刘颖慧1,*(1.河北北方学院农林科技学院，河北张家口075000; 2.张家口市广播电视大学，河北张家口075000)摘要:B3超家族基因是植物中特有的一类转录因子，参与植物生长发育、形态建成及抗逆境胁迫等过程。

从玉米黄早4中获得一个含有2个B3-D N A结合域的基因，为B3超家族基因，命名为Zm没EM。

该基因全长1 047 b p，编码含有349个氨基酸的蛋白。

B la st比对结果表明，ZmKEM和谷子含有B3结构域蛋白、高粱的假定蛋白相似性分别为81%和84%。

基因是组成型表达，在根中表达量最高。

同时基因的转录水平可以为干旱、盐、冷和热所诱导。

因此，ZmREM可能参与玉米多种非生物胁迫应答途径。

关键词：玉米;REM转录因子;基因克隆;非生物胁迫中图分类号:S513 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2016) 11-1822-06Cloning of ZmREM and its expression analysis in maize under stressWENG Qiao-yun'，ZHAO Yan-min2，ZHANG H e'，SONG Jin-hui'，MA H ai-lian'，YUAN Jin-cheng'，LIU Ying-hui1，*(1. College o f Agriculture and Forestry，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China; 2. Zhangjiakou Radio& TV University，Zhangjiakou 075000，China)Abstract ：The plant-specific B3 superfamily constituted a large transcription factor superfamily. They play central roles in plant development，morphogenesis and stress-resistance. Taking total RNA of maize as template，REM gene was cloned by use the method of reverse transcription polymerase chain reaction ( RT-PCR). Length of 1 047 bp cD-NA sequence that encoding 349 amino acids was obtained. CD search result showed that it contained two B3-DNAdomains and was named as Zm REM.Blast result indicated that Zm REM had 84% and 81% homolog^^ with Sorghumbicolor hypothetical protein and Setaria italica B3 domain-containing protein. In various tissues，gene expression in root was the highest. The expression of Zm REM in maize was induced by heat，high-salt，cold and PEG treatment.These results suggested that Zm REM might be a stress related gene of maize.K ey w o rd s：maize (Zea mays L. ) ；REM transcription factor；gene cloning；abiotic stressM超家族基因广泛存在于拟南芥、水稻、番 能的特征可分为5个家族，包括ABI3-VP1、ARF 茄、玉米等多种植物，是植物中特有的一类转录 （生长素响应因子）、HSI (high-level expression of 因子[l-5]。

冰草属牧草改良干旱草地的建植试验
马瑞昌;郭迎冬
【期刊名称】《草食家畜》
【年(卷),期】1998(000)004
【摘要】在旱作地禾草引种筛选的基础上，选用综合性状优良的冰草属牧草两个品种，诺丹冰草（ＡｇｒｏｐｈｒｏｍｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍＰａｓｃｏｐｙｒｕｍＳｍｉｔｈｉｉ）和沙芦草在新疆乌鲁木齐县郊区严重退化的干旱土质荒漠草地上进行旱作单播建植试验。

连续三年观察测定表明，在干旱地区，播种当年幼苗成活率，建植效果与当年降水量和平的土壤含水量密切相关。

接近或高于年均降水量，实施草地补播，旱作建植是可行的。

【总页数】3页(P48-50)
【作者】马瑞昌;郭迎冬
【作者单位】新疆农业大学草原系;新疆农业大学草原系
【正文语种】中文
【中图分类】S812.8
【相关文献】
1.适宜我国北方草地改良、植被恢复、生态治理的优良牧草"强劲"细茎冰草(Endure Slender wheatgrass)抗逆性极强的植被恢复水土保持饲用植物品种 [J],
2.种植牧草改良盐碱化草地试验研究 [J], 胡克霞;沈景林;赵云国;梁广民;刘春义;王峰;冯文忠;李艳茹;宁芳
3.北美三种冰草属牧草引种试验 [J], 海宝;郭丽珍;等
4.黄土高原半干旱区狼尾草属牧草品比试验 [J], 张怀山;赵桂琴;代立兰;杨世柱;王平
5.江西沟地区建植多年生人工草地的牧草引种试验 [J], 张洪军;窦声云;石玉龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

旱作条件下冰草属5种牧草农艺性状的评价马玉宝;徐柱;李临杭;祁娟【期刊名称】《草业科学》【年(卷),期】2008(025)011【摘要】为了筛选出优良的牧草材料用于寒冷的干旱与半干旱地区草地改良与建设,研究对不同来源冰草属Agropyron的5种牧草进行农艺性状评价比较.试验结果表明:所有供试材料均能完成全生育期,年均生育时间119～124 d,越冬率高达93%以上;同时供试材料间各项测试性状也有显著差异.综合考虑鲜草、干草及种子产量等指标,供试的5种牧草中,采自河北的冰草A.cristatum表现第一,来自美国的细茎冰草A.trachycaulum表现第二,而来自山西的光穗冰草A.cristatum 、美国的沙生冰草A.desertorum、甘肃的蒙古冰草A.mongolicum表现一般.【总页数】5页(P45-49)【作者】马玉宝;徐柱;李临杭;祁娟【作者单位】中国农业科学院草原研究所,内蒙古,呼和浩特,010010;中国农业科学院草原研究所,内蒙古,呼和浩特,010010;中国农业科学院草原研究所,内蒙古,呼和浩特,010010;甘肃农业大学草业学院,甘肃,兰州,730070【正文语种】中文【中图分类】Q945.1【相关文献】1.9种冰草属牧草抗旱性评价 [J], 康桂兰2.青藏高原6份披碱草属牧草农艺性状及生产性能评价 [J], 闫志勇;周青平;刘文辉;颜红波;周改娥3.高寒地区5份披碱草属牧草农艺性状评价 [J], 梁国玲;周青平;刘文辉4.披碱草属牧草生物学特性及农艺性状评价 [J], 贾振宇;米福贵;张跃华;孙娜;王雪婷5.旱作条件下施肥对老芒麦和冰草种子产量及构成的影响I-氮、磷、钾对牧草种子产量及构成的影响 [J], 贺晓;李青丰;索全义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

草地早熟禾PpSWEET1b基因克隆及功能研究张然;李根;牛奎举;钱永强;马晖玲【期刊名称】《中国草地学报》【年(卷),期】2024(46)1【摘要】SWEETs糖转运蛋白是一类在真核生物和原核生物中均存在的促进糖通过细胞膜流动的转运蛋白之一,参与调控植物的生长发育和胁迫响应过程。

以草地早熟禾品种蓝月为材料,以叶片cDNA为模板克隆PpSWEET1b基因,采用花序侵染法转化拟南芥,获得了PpSWEET1b拟南芥过表达株系,并研究干旱和低温胁迫对转基因和野生型拟南芥生长、生理及基因表达的影响。

结果表明:干旱和低温胁迫下,PpSWEET1b过表达植株生长状态均优于野生型,叶片MDA含量显著低于野生型,但葡萄糖含量较野生型显著增加,抗旱性和抗寒性明显增强;PpSWEET1b过表达植株可能协同SWEET2和SWEET3共同参与了对低温的响应。

此外,以叶片DNA 为模板克隆了PpSWEET1b基因的启动子序列,顺式作用元件预测发现,其含有多个与胁迫和激素响应、光响应相关的元件。

综合以上结果表明,草地早熟禾PpSWEET1b基因在耐旱和耐寒方面发挥着重要作用,可为草坪草抵抗非生物胁迫生物育种提供新的优异基因资源。

【总页数】14页(P11-24)【作者】张然;李根;牛奎举;钱永强;马晖玲【作者单位】甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心;中国林业科学研究院生态保护与修复研究所/国家林业和草原局草原研究中心【正文语种】中文【中图分类】S688.4【相关文献】1.草地早熟禾PpGA2ox基因启动子的克隆及功能分析2.草地早熟禾查尔酮合成酶基因PpCHS1克隆、功能与表达分析3.草地早熟禾Phosphate Starvation Response 2基因的克隆及表达分析4.草地早熟禾蛋白激酶OSK4基因的克隆及对非生物胁迫响应分析5.草地早熟禾蛋白激酶CIPK24基因克隆及非生物胁迫响应分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第31卷第4期V o l.31N o.4草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2023年4月A p r.2023d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2023.04.006引用格式:谢宏,李舒文,董迪,等.蒺藜苜蓿M t D W F1基因克隆㊁亚细胞定位及表达特征分析[J].草地学报,2023,31(4):984-991 X I E H o n g,L IS h u-w e n,D O N G D i,e ta l.C l o n i n g,S u b c e l l u l a rL o c a l i z a t i o na n dE x p r e s s i o nP a t t e r no f M t DW F1G e n e i n M e d i c a g o t r u n c a t u l a[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2023,31(4):984-991蒺藜苜蓿M t D W F1基因克隆㊁亚细胞定位及表达特征分析谢宏1,李舒文1,董迪1,王梦迪1,贾薇1,晁跃辉1*,赵彦2(1.北京林业大学草业与草原学院,北京100083;2.内蒙古农业大学草原与资源环境学院,内蒙古呼和浩特010018)摘要:D e l t a24-甾醇还原酶(D e l t a24-s t e r o l r e d u c t a s e,D W F1)是油菜素内酯(B r a s s i n o s t e r o i d e,B R)合成途径中的关键酶,在植物生长发育中起着关键性的作用㊂为了研究D W F1基因在蒺藜苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u l a)中的功能,本试验从蒺藜苜蓿R108中克隆M t D W F1基因全长序列,该基因开放阅读框(O R F)1704b p,编码567个氨基酸,分子量65.911 k D,理论等电点为8.53㊂亚细胞定位显示,该蛋白定位于细胞质内㊂进化分析表明,蒺藜苜蓿M t D W F1蛋白与鹰嘴豆(C i c e r a r i e t i n u m)㊁红三叶(T r i f o l i u m p r a t e n s e)及豌豆(P i s u m s a t i v u m)亲缘关系较为接近㊂M t D W F1基因在蒺藜苜蓿根㊁茎㊁叶中均有表达,在茎和叶中的表达水平较高㊂外源激素脱落酸(A b s c i s i c a c i d,A B A)能够明显提高M t D W F1表达,水杨酸(S a l i c y l i c a c i d,S A)能够显著降低M t D W F1表达水平㊂同时,经油菜素内酯诱导后,M t D W F1表达水平整体呈现增加趋势㊂本研究为进一步探索M t D W F1基因在蒺藜苜蓿发育过程中的作用提供理论研究基础㊂关键词:M t DW F1;蒺藜苜蓿;基因克隆;表达分析;亚细胞定位中图分类号:Q785文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)04-0984-08C l o n i n g,S u b c e l l u l a rL o c a l i z a t i o na n dE x p r e s s i o nP a t t e r no f M tD W F1G e n e i nM e d i c a g o t r u n c a t u l aX I E H o n g1,L I S h u-w e n1,D O N G D i1,WA N G M e n g-d i1,J I A W e i1,C H A O Y u e-h u i1*,Z H A O Y a n2(1.S c h o o l o fG r a s s l a n dS c i e n c e,B e i j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y,B e i j i n g100083,C h i n a;2.C o l l e g e o fG r a s s l a n d,R e s o u r c e sE n v i r o n m e n t,I n n e rM o n g o l i aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,H o t t o t,I n n e rM o n g o l i a010018,C h i n a)A b s t r a c t:D e l t a24-s t e r o l r e d u c t a s e(DW F1)i s a c r u c i a l e n z y m e i n t h eb i o s y n t h e s i so fb r a s s i n o s t e r o i d sa n dh a s a s i g n i f i c a n t r e g u l a t i o no n p l a n t g r o w t h a n dd e v e l o p m e n t.T o e x a m i n e t h e f u n c t i o no f t h e DWF1g e n ei n M e d i c a g o t r u n c a t u l a,t h ef u l l-l e n g t hs e q u e n c eo f t h e M t DWF1g e n e w a sc l o n e df r o m M.t r u n c a t u l a (R108).T h e o p e n r e a d i n g f r a m e o f M t DWF1w a s f o u n d t ob e1704b p i n l e n g t h a n d e n c o d e d a p e p t i d e o f 567a m i n o a c i d sw i t h am o l e c u l a rw e i g h t o f65.911k D a a n d a p r e d i c t e d i s o e l e c t r i c p o i n t o f8.53.T h e p r o-t e i no f t h eM t DW F1w a s l o c a l i z e d i n t h e c y t o p l a s ma s d e t e r m i n e d b y s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a n a l y s i s.E v o-l u t i o n a r y a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h eM t DW F1p r o t e i no f M.t r u n c a t u l a i s c l o s e l y r e l a t e d t o t h o s e o f C i c e r a r i e t i n u m,T r i f o l i u m p r a t e n s e,a n d P i s u m s a t i v u m.T h e M t DWF1g e n ew a s e x p r e s s e d i n t h e r o o t s,s t e m s, a n d l e a v e s o f M.t r u n c a t u l a,w i t hh i g h e r e x p r e s s i o n l e v e l s o b s e r v e d i n s t e m s a n d l e a v e s t h a n t h a t i n r o o t s.E x o g e n o u s a p p l i c a t i o n o f a b s c i s i c a c i d(A B A)c a u s e d t h e M t DWF1e x p r e s s i o n s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d,w h i l e s a l i c y l i c a c i d(S A)s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d.B r a s s i n o s t e r o l(B R)t r e a t m e n t r e s u l t e d i na no v e r a l l i n c r e a s eo f M t DWF1e x p r e s s i o n.T h i s s t u d yp r o v i d e s a f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r i n v e s t i g a t i n g o nt h e r o l eo f t h e M t D-WF1g e n e i n M.t r u n c a t u l a d e v e l o p m e n t.K e y w o r d s:M t DWF1;M e d i c a g o t r u n c a t u l a;G e n e c l o n e;E x p r e s s i o na n a l y s i s;S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n收稿日期:2022-12-02;修回日期:2023-01-13基金项目:教育部草地资源教育部重点实验室开放课题资助作者简介:谢宏(1998-),女,汉族,内蒙古包头人,硕士研究生,主要从事草地植物遗传育种研究,E-m a i l:x i e h o n g2*******@163.c o m;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:c h a o y u e h u i@b j f u.e d u.c nCopyright©博看网. All Rights Reserved.第4期谢宏等:蒺藜苜蓿M t DW F1基因克隆㊁亚细胞定位及表达特征分析蒺藜苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u l a),豆科(L e g u-m i n o s a e),苜蓿属(M e d i c a g o L.),一年生牧草植物㊂因其倍性小(2n=16)㊁基因组小(5ˑ108b p)[1]㊁生长期短㊁自花授粉㊁结实率高及可固氮等优良性状,受到了越来越多研究者们的青睐[2-4],同时也成为了研究豆科生物和基因组学方面的模式植物[5]㊂油菜素内酯(B r a s s i n o s t e r o i d e,B R),是一类调控植物生长的固醇类激素[6],被称为第六类植物激素,是植物生长发育所需的天然植物生长调节剂[7],在植物的不同器官中均存在,参与种子萌发[8]㊁细胞伸长和分裂㊁叶片衰老以及增加抗旱㊁抗寒㊁抗病等不同逆境环境的抵抗[9]㊂研究发现,D W F基因家族与B R在植物生长发育过程中联系密切,很多成员都参与了B R的合成途径[10]㊂在拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)[11]中D W F1/D I M是一个双功能蛋白,催化24-亚甲基胆甾醇合成油菜素内酯,在d w f1/d i m突变体中,内源B R 的合成受阻其含量大量降低,造成D W F1基因的表达水平降低,从而导致植株生长速度减缓,植株表现矮化现象㊂在种子萌发时,D W F4与B R合成相关基因的表达量上调,导致内源B R含量增加㊂在D W F1蛋白序列中存在F A D结合结构域,具有F A D氧化还原酶特性㊂此外,D W F1在植物中的其他功能也得到了充分的研究,对甜瓜(C u c u m i s m e l o)中的D W F1基因进行克隆及表达分析,结果发现能促进根系及叶等组织的发育[12]㊂在水稻(O r y z a s a t i v a l)中,d w f1突变体的植株矮小,生长速度减缓,根㊁茎㊁叶等器官明显变脆,同时叶片数量也较少,结实率及千粒重均比野生型有一定的降低[13]㊂在玉米(Z e am a y s)中通过R N A i技术干扰D W F1,发现基因表达受到抑制,转基因植株变矮,同时这种抑制与植株的高度呈现正相关[14]㊂综上,DWF1基因在植株生长发育过程中发挥着重要的作用,然而在豆科模式植物蒺藜苜蓿中关于DWF1基因相关的研究较少㊂因此,本试验以蒺藜苜蓿为研究材料,从蒺藜苜蓿中通过克隆得到M t DWF1基因,对其进行生物信息学分析㊁亚细胞定位及结合q R T-P C R分析该基因的表达特征,初步探讨M t DWF1的功能,为后续深入研究该基因的功能机制提供理论基础㊂1材料与方法1.1试验材料试验所用的野生型蒺藜苜蓿(生态型R108)种子于北京林业大学保存㊂蒺藜苜蓿种子经4ħ春化3d后放置于光照16h/25ħ黑暗8h/23ħ至根系发育㊂然后移栽至直径12c m花盆中,并于25ħ光照16h/24ħ黑暗8h条件下生长㊂反转录试剂盒㊁P r i m e S T A R MA X㊁限制性内切酶㊁p M D19-T克隆载体均来自于T A K A R A公司;纯化试剂盒㊁D N A 提取试剂盒购自于OM E G A公司;D L5000D N A M a r k e r购自艾克瑞公司;荧光定量T B G r e e n订购于康维公司;大肠杆菌感受态D H5α来自于天根公司;利福平㊁卡那霉素㊁A B A,S A和B R购于S i g m a 公司,农杆菌感受态E HA105为实验室保存㊂其他试剂均采自于进口分装或国产分析纯㊂1.2试验方法1.2.1引物设计基于已经公布的蒺藜苜蓿R108参考基因组(R108_HM340_v1.0),通过软件P r i m-e rP r e m i e r5.0进行引物设计㊂其中,M t DW F1-F/ R用于M t DWF1基因全长的克隆,引物3302Y-M t-DW F1-F/R用于构建亚细胞定位植物表达载体构建,引物3302Y-F和3302Y-R用于植物表达载体检测,引物M t DW F1-R T-F/R用于M t DWF1基因荧光定量检测,引物M t A c t i n-F和M t A c t i n-R用于内参基因A c t i n荧光定量检测㊂表1引物列表T a b l e1 P r i m e r l i s t引物名称P r i m en a m e引物序列(5'-3')P r i m eS e q u e n c e(5'-3')M t DW F1-F A A T T A A C T C T T T A A G A G C T G T A GM t DW F1-R A T A A A A G A C A C T G G A A A C T C A A AM13-F T G A T C T G G C T G G T C G T G A C C T T AM13-R A T G C C T G C T G C T T C C A T T C C T A TM t DWF1-R T-F C C T A A G A G G A A G A A G A T T T G G G T T G AM t DW F1-R T-R A G G C A C A G T G A C C C T G G T A A T C TM t A c t i n-F T G A T C T G G C T G G T C G T G A C C T T AM t A c t i n-R A T G C C T G C T G C T T C C A T T C C T A T 3302Y-M t DWF1-F C A T G G T G G G G G A C T C T T G A C A T G T C A G A T C T T G A G G C T C C 3302Y-M t DWF1-R T A G G T A C A C G C G T A C T A G T C G T C T G C C G G T T G A T C A A C T T 1.2.2M t D W F1基因克隆取长势一致的蒺藜苜蓿健康叶片作为植物材料,将其放在盛有液氮的研钵中充分研磨,按照R N A提取试剂盒提取蒺藜苜蓿总R N A㊂以提取的总R N A为模板,利用反转录试剂盒进行反转录获得蒺藜苜蓿c D N A㊂以蒺藜苜蓿c D N A 为模板,以D W F1-F/R为引物获得M t D W F1基因的目的条带㊂对P C R产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,条带大小正确后,利用O M E G A纯化试剂盒进行纯化操作㊂纯化后的P C R产物与克隆载体p M D19-T 进行连接㊂然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态D H5α中,将其放在涂有氨苄抗生素的固体L B培养基上,挑取单菌落,使用引物M13F-47/R-48进行菌589Copyright©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷体P C R鉴定,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,选取扩增目的条带大小的P C R产物送公司进行测序㊂1.2.3亚细胞载体构建以含有M t D W F1克隆质粒为模板,用3302Y-D W F1-F/R为引物进行P C R扩增㊂在50ħ下使用无缝连接酶将纯化后的P C R产物与酶切质粒产物进行连接后转入大肠杆菌感受态,并将其菌液涂在含有50m g㊃L-1卡那霉素的抗生素固体L B培养基上进行挑选,将其置于37ħ恒温箱中培养8h,挑取生长于抗生素培养基上的单菌落进行P C R扩增并取4μL用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,将条带大小符合的P C R产物送公司测序㊂1.2.4农杆菌转化用C a C l2冻融法将3302Y-D W F1重构质粒转入到E H A105农杆菌的感受态中,并将其放置冰上30m i n,液氮速冻1m i n,37ħ水浴5 m i n,冰上5m i n,向管中加入1m L的L B溶液,放置在28ħ培养箱中振荡4h,5000r㊃m i n-1,弃上清,将剩余菌液涂于含有利福平和卡那霉素抗生素的L B 培养基上,28ħ暗处理2d后,挑取单菌落,利用引物3302Y-F和3302Y-R对菌落进行P C R检测,条带大小符合的产物送至公司测序,测序后将比对正确的农杆菌菌液加甘油保存于-80ħ的冰箱中㊂1.2.5亚细胞定位将构建好的35S::M t D W F1:G F P农杆菌菌液加到含50m g㊃L-1的利福平和50 m g㊃L-1的卡那霉素抗生素的L B溶液中,黑暗条件下在培养箱振荡1~2d后,至O D600为0.6~0.8;以健康生长一个月左右的烟草为材料,用注射器将菌液注射到烟草叶片下表皮细胞中,注射后将烟草放置于人工气候箱黑暗处理48h,制作叶片玻片,将玻片倒置在共聚焦显微镜下,观察烟草叶片中G F P荧光信号的分布情况,最终确定目的基因所在位置㊂1.2.6生物信息学分析从N C B I(h t t p s://w w w. n c b i.n l m.n i h.g o v/)数据库中下载M t D W F1的基因序列,将其在(h t t p s://i r i s.a n g e r s.i n r a.f r/o b h/)中与蒺藜苜蓿R108基因组序列比对,获取M t D W F1的基因序列㊂同时于N C B I网站上对M t D W F1蛋白质进行保守结构域分析㊂利用D N A M A N分析M t D W F1的开放阅读框及编码氨基酸序列,用P r o t P a r a(h t-t p s://w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)分析蛋白质等电点和分子量,用(h t t p s://s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/ s e r v i c e s.p h p s i g n a l p-5.0)进行蛋白质信号肽的预测㊂利用S O P M A(h t t p s://p r a b i.i b c p.f r/h t m/s i t e/ w e b/h o m e)对M t D W F1蛋白一级㊁二级㊁三级结构进行预测,C e l l-P L o c网站(h t t p://w w w.c s b i o.s j t u.e d u.c n/b i o i n f/C e l l-P L o c/)去预测M t D W F1蛋白在细胞内的定位情况㊂通过M E G A11软件构建同源蛋白系统进化树㊂1.2.7M t DWF1实时荧光定量表达分析选取长势一致健康的蒺藜苜蓿植株根㊁茎㊁叶三个组织,液氮速冻后,迅速放入-80ħ的冰箱,对其进行组织差异性表达分析㊂以李殷睿智[15]和舒思晨[16]的实验方法为参考,确定A B A,S A及B R浓度分别为10μm o l㊃L-1,0.5m m o l㊃L-1及0.1μm o l㊃L-1㊂选取长势一致的蒺藜苜蓿植株叶片,对叶表面均匀喷施1次进行激素诱导,分别于喷施激素的第0,0.5, 1,3,6,9,12h这7个不同时间点采取植株叶片组织后,立即用液氮进行速冻㊂随后将上述样品研磨后,分别提取植物的总R N A,并进行反转录㊂使用引物M t A c t i n-F和M t A c t i n-R作为荧光定量的内参基因,引物M t DW F1-R T-F/R按照试剂说明书进行q R T-P C R分析㊂反应结束后,根据2 әәC t法[17]使用E x c e l2010进行数据分析㊂1.2.8数据分析通过E x c e l2010对数据进行整理及图标制作,利用软件S P S S26.0进行单因素方差分析㊂2结果与分析2.1蒺藜苜蓿M t D W F1基因的克隆以DW F1-F/R为引物对蒺藜苜蓿c D N A进行P C R扩增㊂结果显示,如图1获得条带清晰㊁条带大小约1700b p,将其产物送至生物公司测序,测序结果表明所克隆的碱基序列与蒺藜苜蓿M t DWF1基因序列一致,初步表明蒺藜苜蓿M t DWF1基因克隆成功,将正确的克隆载体命名为p M D-M t D-WF1㊂可用于后续试验㊂图1蒺藜苜蓿M t D W F1基因的克隆F i g.1 C l o n i n g o f M t DW F1g e n e o f M e d i c a g o t r u n c a t u l a689Copyright©博看网. All Rights Reserved.第4期谢 宏等:蒺藜苜蓿M t DW F 1基因克隆㊁亚细胞定位及表达特征分析2.2 蒺藜苜蓿M t D W F 1亚细胞定位分析通过C e l l -P L o c 网站分析,推测M t DW F 1蛋白定位于细胞质㊂将成功构建的35S ::M t DWF 1:G F P 载体转化烟草,黑暗培养48h,使用激光聚焦显微镜对转化后的烟草进行观察,捕捉激光信号㊂结果显示从细胞质捕获到强烈的G F P 信号(图2)㊂表明M t DW F 1蛋白的亚细胞定位在细胞质中㊂图2 M t D W F 1亚细胞定位F i g.2 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fM t DW F 12.3 M t D W F 1基因的生物信息学分析通过P C R 克隆技术得到的M t DWF 1基因开放阅读框1704b p,编码567个氨基酸(图3),利用N C B I 网站以及B l a s t 工具对M t DW F 1进行同源比对,对M t DW F 1蛋白的保守结构及特性进行分析预测,发现在109~199位氨基酸之间含有F A D -b i n d -i n g-4结构域(图4),该位点是F A D 结合位点,M t -DWF 1其分子式为C 3018H 4620N 788O 829S 22,分子总质量65.911k D ,理论等电点为8.53㊂其正电荷残基数量为78,负电荷残基数量为73;不稳定系数是36.23,经预测,其蛋白性质稳定㊂二级及三级结构预测(图5),结果显示,M t DW F 1蛋白主要由α螺旋及无规则卷曲构成,其分别各占二级结构总比例的42.5%和36.33%,含有延伸链16.23%和β转角4.94%㊂通过S i g n a l 5.0网站,进行信号肽预测(图6),结果显示,M t DW F 1蛋白中不含有信号肽㊂亚细胞定位预测结果显示,M t D W F 1蛋白定位于细胞质㊂使用M E G A11软件对M t D W F 1蛋白构建系统发育进化树,结果表明(图7)蒺藜苜蓿M t D W F 1蛋白与鹰嘴豆(C i c e r a r i e t i n u m )㊁红三叶(T r i fo l i u m p r a t -e n s e )和豌豆(P i s u m s a t i v u m )亲缘关系较近,与蒺藜苜蓿M t D W F 1蛋白同源的物种大多为豆科植物㊂图3 蒺藜苜蓿M t D W F 1基因D N A 序列和氨基酸序列F i g .3 T h eD N Aa n da m i n o a c i d s e qu e n c e s o f M t DW F 1g e n e o f M e d i c a go t r u n c a t u l a 789Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草 地 学 报第31卷图4 M t D W F 1蛋白保守结构域预测F i g.4 P r e d i c t e dd o m a i no fM t DW F 1p r o t e in 图5 M t D W F 1蛋白二级结构和三级结构预测F i g .5 P r e d i c t i o no f t h e s e c o n d a r y a n d t h e t e r t i a r y st r u c t u r e s o fM t DW F 1p r o t e in 图6 M t D W F 1蛋白信号肽预测F i g .6 P r e d i c t e d s i g n a l p e pt i d e o fM t DW F 1p r o t e in 图7 M t D W F 1蛋白进化树分析F i g .7 E v o l u t i o n a r y t r e e a n a l ys i s o fM t DW F 1p r o t e i n s 889Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第4期谢 宏等:蒺藜苜蓿M t DW F 1基因克隆㊁亚细胞定位及表达特征分析2.4 组织差异性分析对蒺藜苜蓿根茎叶进行荧光定量分析,检测M t DWF 1基因在根茎叶中的表达水平㊂结果表明M t DWF 1基因在根茎叶中均有表达,在茎和叶中的表达量显著高于根,分别是根的1.45和1.46倍㊂M t DWF 1基因在茎和叶的表达水平相似(图8)㊂为探究激素对M t DWF 1基因的作用,我们检测了M t DWF 1在A B A ,S A 及B R 处理下0,0.5,1,3,6,9,12h 的表达水平㊂研究表明,A B A 处理后,M t DWF 1表达量与对照相比呈现先增加后降低的趋势㊂0.5h 时表达量呈现逐渐增加趋势,并在6h 达到顶峰,此时M t DWF 1的表达量是对照的4.81倍㊂随后M t DWF 1表达量逐渐降低,但总体表达量高于对照(图9)㊂这些数据表明,A B A 可促进M t DWF 1的表达,促进作用在短期内较明显㊂S A 诱导后,M t DWF 1的表达量整体呈现下降趋势,前6h 呈现急速下降趋势,在6h 时达到最低,占对照组的4.5%,6h 之后,表达量有所回升,但是仍然低于对照组㊂12h 表达量占对照组的44.7%(图10)㊂结果表明,M t DWF 1对S A 较敏感,且S A 对M t DWF 1的表达具有明显的抑制作用㊂图8 M t D W F 1基因不同组织的表达分析F i g .8 E x p r e s s i o na n a l ys i s o f M t DW F 1ge n e i nd if f e r e n t t i s s u e s 注:不同小写字母表示差异显著(P <0.05)N o t e :D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t eas i gn i f i c a n td i f f e r e n c ea t t h e 0.05l e v el图9 M t D W F 1基因表达分析F i g .9 A n a l y s i s o f M t DW F 1g e n e e x pr e s s i o n 注:不同小写字母表示差异显著(P <0.05)N o t e :D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t eas i gn i f i c a n td i f f e r e n c ea t t h e 0.05l e v el图10 M t D W F 1基因表达分析F i g .10 A n a l y s i s o f M t DW F 1g e n e e x pr e s s i o n 注:不同小写字母表示差异显著(P <0.05)N o t e :D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t eas i gn i f i c a n td i f f e r e n c ea t t h e 0.05l e v e lB R 诱导后,M t DWF 1被快速诱导其表达量整体呈现上升趋势㊂在处理9h 时表达水平达到峰值,其表达量是对照组的5倍(图11)㊂结果表明,B R 对M t DWF 1的表达具有促进作用㊂图11 M t D W F 1基因表达分析F i g .11 A n a l y s i s o f M t DW F 1g e n e e x pr e s s i o n 注:不同小写字母表示差异显著(P <0.05)N o t e :D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t eas i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e a t t h e 0.05l e v e l989Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷3讨论DWF1基因是B R合成过程中的关键基因,能够多次参与B R的催化合成㊂目前,DWF1基因已在多种植物中被研究,但在蒺藜苜蓿中DWF1方面的研究还未见到报道㊂本研究成功在蒺藜苜蓿中克隆获得M t DWF1基因,该基因全长1704b p,共编码567个氨基酸㊂进化树结果分析(图8)该基因控制合成的蛋白质与鹰嘴豆㊁豌豆㊁红三叶等多个物种中的DW F1蛋白高度同源,其与鹰嘴豆相似度最高㊂DW F1蛋白含有F A D-b i n d i n g-4结构域保守区域㊂在已报道的拟南芥[18]㊁甜瓜(C u c u m i s m e-l o)[12]㊁棉花(G o s s y p i u mh i r s u t u m)[19]㊁马铃薯(S o-l a n u m t u b e r o s u m)[20]等物种中,DWF1主要都是参与B R的催化合成过程,同时在本试验中我们预测的蒺藜苜蓿DW F1蛋白质性质与以上这些物种中的DW F1蛋白质性质相同㊂因此,我们推测M t D-WF1在蒺藜苜蓿中也具有相似的功能,能够参与蒺藜苜蓿B R的催化合成过程㊂通过表达分析,发现M t DWF1在根㊁茎㊁叶组织中均有表达,说明其广泛存在于蒺藜苜蓿各个组织中,但其在不同的组织中的表达量具有差异性,在根中表达量最低,在叶中的表达量最高㊂这与DWF1基因在马铃薯[20]㊁玉米[14]和豌豆[21]的表达模式十分相似,推测DWF1基因在不同物种中可能具有相似的功能,因此可以利用在其他植物中获得的结果,推测M t DWF1基因可能参与了蒺藜苜蓿B R的催化合成过程㊂植物激素在植物生长发育过程中扮演着重要的角色,不同激素处理对基因的响应也存在着差异㊂A B A被称为 逆境激素 [22],在逆境胁迫下大量的脱落酸(A b s c i s i ca c i d,A B A)在植物中被积累㊂已有研究发现,玉米在外源喷施A B A激素后DWF4的相对表达量升高[23]㊂在本研究中,M t DWF1受A B A激素诱导后表达量也上调,因此我们猜测,该基因表达在受到A B A诱导后上调,M t DWF1可能会对逆境胁迫产生响应,这种响应可能是受到或部分受到A B A途径所影响㊂除了A B A,M t DWF1与其他激素也存在相互作用㊂在S A处理后,该基因的相对表达量随处理时间的增加基因的表达量受到抑制,暗示S A可能对M t D-WF1进行负调控从而实现对蒺藜苜蓿生长的调控㊂V r i e t等[24]发现,DWF1基因能够促进油菜素内酯的合成,同时B e s t等人[25]也发现DWF1基因参与着B R和G A信号的相互作用,从而调控植物发育㊂在本试验中我们通过B R激素处理后,发现M t D-WF1基因的表达量总体呈现上升趋势,这说明在外施B R激素的条件下,其促进了M t DWF1基因的表达,因此我们有理由猜测M t DWF1基因可能参与了蒺藜苜蓿植株的生长发育过程[20],对植株生长具有促进作用㊂综上所述,本研究为进一步探究蒺藜苜蓿M t DWF1基因功能提供了帮助,但关于其在蒺藜苜蓿中的具体功能及调控机制还需深入研究㊂4结论本研究成功克隆了蒺藜苜蓿M t DWF1基因并对其进行生物信息学分析显示,DWF1的开放阅读框1704b p,编码567个氨基酸㊂DW F1的序列上有一个典型的氧化还原酶的F A D保守结构域,无信号肽㊂亚细胞定位显示该蛋白定位于细胞质㊂表达分析结果表明,蒺藜苜蓿M t DWF1基因在茎及叶中的表达量最高,说明其在茎和叶中发挥作用㊂其表达受A B A,S A调节㊂B R可促进M t DWF1基因的表达,进而促进植株发育㊂总之,这些结果不仅为进一步探索M t DWF1基因功能的提供了思路,也从分子水平上研究其他豆科植物基因功能提供理论基础㊂参考文献[1] T R I E U A T,HA R R I S O N M J.R a p i d t r a n s f o r m a t i o n o fM e d i c a g ot r u n c a t u l a:r e g e n e r a t i o n v i a s h o o t o r g a n o g e n e s i s[J].P l a n tC e l lR e p o r t s,1996,16(1-2):6-11[2] V I K E R K B,S T E E L E M B,L A N K O VID,e t a l.P r e c l i n i c a ls a f e t y a s s e s s m e n t o fMV-s-N A P,an o v e l o n c o l y t i cm e a s l e sv i-r u s s t r a i na r m e dw i t h a n H.p y l o r i i m m u n o s t i m u l a t o r y b a c t e-r i a l t r a n s g e n e[J].M o l e c u l a rT h e r a p y-M e t h o d s&C l i n i c a lD e v e l o p m e n t,2022(26):532-546[3] E N D R EG,K E R E S Z T A,K E V E IZ,e t a l.Ar e c e p t o rk i n a s eg e n er e g u l a t i n g s y m b i o t i cn o d u l ed e v e l o p m e n t[J].N a t u r e,2002(417):962-966[4]李菲,何小红,张习敏,等.苜蓿14-3-3基因家族的鉴定与进化和特征分析[J].基因组学与应用生物学,2017,36(12):5238-5243[5] T A O Y Z,Z H E N GJ,X U Z M,e ta l.F u n c t i o n a l a n a l y s i so fZ m DW F1,a m a i z eh o m o l o g o ft h e A r a b i d o p s i s b r a s s i n o s t e-r o i d s b i o s y n t h e t i c DW F1/D I M g e n e[J].P l a n tS c i e n c e,2004, 167(4):743-751[6]何宇炯,徐如涓,赵毓橘,等.表油菜素内酯对油菜幼苗生长及其可溶性糖和蛋白质含量的影响[J].植物生理学通讯,1995, 31(1):37-39[7]曲善民,苏一诺,苗阳阳,等.芸苔素内酯对连作及非连作紫花099Copyright©博看网. All Rights Reserved.第4期谢宏等:蒺藜苜蓿M t DW F1基因克隆㊁亚细胞定位及表达特征分析苜蓿生产调控初探[J].草地学报,2019,27(4):874-881 [8]寇江涛.外源2,4-表油菜素内酯对N a C l胁迫下燕麦种子萌发和生理的影响[J].草地学报,2019,27(6):1562-1568 [9]邓天福,吴艳兵,李广领,等.油菜素内酯提高植物抗逆性研究进展[J].广东农业科学,2009(11):21-25[10]WA N GZY,B A IM Y,O H E,e t a l.B r a s s i n o s t e r o i ds i g n a l i n gn e t w o r ka n dr e g u l a t i o n o f p h o t o m o r p h o g e n e s i s[J].A n n u a l R e v i e wo fG e n e t i c s,2012,46(1):701-724[11]H O S S A I N Z,M C G A R V E Y B,AMY O T L,e t a l.D i m i n u t o1a f f e c t s t h e l i g n i n p r o f i l ea n ds e c o n d a r y c e l lw a l l f o r m a t i o ni nA r a b i d o p s i s[J].P l a n t a,2012,235(3):485-498[12]张瑾,金乌云,陈莹莹,等.甜瓜C m DW F1基因的克隆及表达分析[J].华北农学报,2019,34(5):8-14[13]吴国超.水稻矮脆突变体d w f1的特性与基因定位[D].重庆:西南大学,2014:35-36[14]陶亚忠.玉米与油菜素类固醇生物合成相关的基因Z m DW F1的克隆及其功能分析[D].北京:中国农业大学,2004:108 [15]L IY RZ,WA N G M D,G U O T,e t a l.O v e r e x p r e s s i o no f a b-s c i s i c a c i d-i n s e n s i t i v e g e n e A B I4f r o m M e d i c a g o t r u n c a t u l a, w h i c hc o u l d i n t e r a c tw i t hA B A2,i m p r o v e d p l a n t c o l d t o l e r a n c e m e d i a t e db y A B A s i g n a l i n g[J].F r o n t i e r si n P l a n tS c i e n c e, 2022,13(13):982715[16]舒思晨,王娟,王柏柯,等.外源M e J A和B R对番茄种子萌发及幼根生长的影响[J].农业工程,2022,12(3):138-143 [17]吴婧,范菠菠,张学峰,等.蒙古冰草E R F转录因子生物信息学及其表达分析[J].草地学报,2022,30(11):2910-2921 [18]C H O ES,D I L K E SBP,G R E G O R YBD,e t a l.T h e A r a b i d o p-s i s d w a r f1m u t a n t i s d e f e c t i v e i n t h e c o n v e r s i o n o f24-m e t h y l e-n e c h o l e s t e r o lt o c a m p e s t e r o li n b r a s s i n o s t e r o i d b i o s y n t h e s i s [J].P l a n t P h y s i o l o g y,1999,119(3):897-908[19]罗明,周建平,肖月华,等.棉花油菜素类固醇合成酶基因G h DW F1的克隆和表达分析[J].中国农业科学,2007(7):1337-1344[20]唐晓,邓孟胜,邹雪,等.马铃薯S t DW F1基因克隆及表达分析[J].浙江农业学报,2018,30(6):909-917[21]S C HU L T Z L,HU U B L,K E R C K H O F F SJ,e ta l.M o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no f t h eb r a s s i n o s t e r o i d-def i c i e n t I k b m u t a n t i np e a[J].P l a n tM o l e c u l a rB i o l o g y,2001,47(4):491-508 [22]刚爽.A B A对亚高温强光胁迫下番茄叶片光合作用影响及分子机制研究[D].沈阳:沈阳农业大学,2016:9-11 [23]段方猛,罗秋兰,鲁雪莉,等.玉米油菜素甾醇生物合成关键酶基因Z m C Y P90B1的克隆及其对逆境胁迫的响应[J].作物学报,2018,44(3):343-356[24]V R I E TC,R U S S I N O V A E,R E U Z E A U C,e ta l.F r o ms q u a-l e n e t ob r a s s i n o l i d e:t h es t e r o i d m e t a b o l i ca n ds i g n a l i n gp a t h-w a y s a c r o s s t h e p l a n tk i n g d o m[J].M o l e c u l a rP l a n t,2013,6(6):1738-1757[25]B E S T N B,H A R TW I G T,B U D K AJ,e t a l.N a n a p l a n t2e n-c ode s am a i z e o r t h o l o g of t h e A r a b i d o p s i s b r a s s i n o s t e r o i db i o-s y n t h e s i s g e n e DWA R F1,i d e n t i f y i n g d e v e l o p m e n t a li n t e r a c-t i o n s b e t w e e n b r a s s i n o s t e r o i d s a n d g i b b e r e l l i n s[J].P l a n t P h y s i o l o g y,2016,171(4):2633-2647(责任编辑刘婷婷)199Copyright©博看网. 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第29卷第10期草地学报2021年10月Vol29No(10ACTA AGRESTIA SINICA Oct(2021doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2021.10.004西藏野生垂穗披碱草EnPLAl基因克隆与表达分析姜惠娜】，敬松1,李晗玉】，余木子】，张新飞】，呼天明】，付娟娟-,苗彦军2*(1.西北农林科技大学草业与草原学院,陕西杨凌712100% 2.西藏农牧学院动物科学学院,西藏林芝860000)摘要：为探究&亚麻酸调控植物低温胁迫应答的分子机制，本研究从西藏野生垂穗披碱草〈Elymus nutans Griseb.)中克隆了其合成酶磷脂酶基因(EnPLAl),对其进行生物信息学、基因表达模式和亚细胞定位分析，并采用外源添加的方法分析&亚麻酸在西藏野生垂穗披碱草低温适应中的作用°结果表明:EnPLAl基因的编码序列(Coding sequence,CDS)全长为1305bp,编码434个氨基酸；分子量为47.44KD,等电点为6.05；EnPLA1蛋白为亲水性蛋白且偏酸性，含有1个高度保守的Lipase(class3)结构域和4个跨膜结构域；二级结构以&螺旋和无规则卷曲为主；EnPLA1蛋白与粗山羊草(Aegilops tauschii subsp.Tauschii),圆锥小麦(Tiicum turgidum subsp.Durum),大麦(Hordum vulgare subsp.Vulgare)的氨基酸序列相似性达80.76%，且该蛋白主要定位在细胞质。

EnPLAl基因在垂穗披碱草的根、茎、叶中均有表达，其中叶中表达高于茎和根；低温诱导叶和茎中EnPLAl基因表达(P V0.05),对根中表达影响较小；25$M-亚麻酸处理显著地提高植物的抗寒性°本研究为深入地阐明EnPLAl基因调控垂穗披碱草低温适应机制奠定基础,并为利用优良野生种质资源改良牧草及作物提供思路。