当前位置：文档之家 › 高产谷氨酸菌选育研究进展 精品

高产谷氨酸菌选育研究进展 精品

  • 格式：docx
  • 大小：102.52 KB
  • 文档页数：3

Ξ 高产谷氨酸菌选育研究进展

甄卫军, 张石峰, 曾宪贤

( 新疆大学 离子束生物工程中心, 新疆 乌鲁木齐 830008)

摘 要: 对目前谷氨酸菌种选育技术及其发展进行了综述, 同时重点报道了离子束生物工程技术应用于谷氨酸

菌株选育方面的研究 1 研究表明, 以 D 110、D 110B 为出发菌, 采用低能 N + 离子注入技术已经筛选到两株高产菌株

D 5221、B 3263 , 其 10 批次摇瓶平均产酸幅度分别达到 8. 4% 、7. 5% , 比出发菌分别提高 35. 48% 和 25% , 摇瓶发酵

平均糖酸转化率可以达到 43% , R G% (残糖) 达到 2% 以下, 说明其代谢活力强于出发菌 1

关键词: 谷氨酸菌; 选育; 发酵; 离子束生物工程

中图分类号: O 53; Q 93 文献标识码: A 文章编号: 100022839 (2002) 0220209203

前 言 0

味精的工业化生产工艺路线是以谷氨酸生产菌株发酵法生产谷氨酸, 原料为淀粉和糖蜜 1 谷氨酸生

产菌株具有较大的自然变异能力, 通常负变异频率高于正变异频率, 结果往往造成菌种的衰老, 菌株活

力减退 1 因此国内味精行业普遍存在着产酸率水平低, 糖酸转化率低, 成本高, 能耗高等瓶颈问题 1 因此

优良生产菌种的选育, 则一直是味精发酵工业上的主要研究课题之一1 1

传统选育技术

20 世纪 60 年代中期至 70 年代初, 国内主要是从自然界中筛选出一批谷氨酸高产菌株, 比如 A s1.

299、A s1. 542、T 6213 等, 以供生产使用 170 年代开始, 一些院校、科研院所和生产厂家联合或单独开展遗

传育种工作, 将野生株谷氨酸生产菌进行有目的的定向改造, 或者采用物理诱变因子紫外线 (U V )、Co 60

和铜激光等, 或者采用化学诱变因子硫酸二乙酯 (D E S)、亚硝基胍、氯化锂、香豆素等以及这些理化因子

的复合诱变, 用来处理菌株进行常规的诱变育种 1

目 前, 国内各味精厂使用的谷氨酸生产菌株主要有2 : 北京棒杆菌 (A s1. 299)、7338、S2941、D 110、

W T H 21; 钝 齿 棒 杆 菌 (A s1. 542 )、HU 7251、B 9、B 9217236、F 2263; 天 津 短 杆 菌 ( T 6213 )、FM 82027、FM 842415、U 29、

CM TC 6282、T G3、T G866、D 85 等 1 其中以淀粉为原料的厂家所使用的菌株多为 B 9、T 6213、7338.

20 世纪 80 年代初, 郑善良等3 以 T 6213 为出发菌株, 用 Co 60 辐射诱变处理, 筛选得产酸能力有明显提

高的 FM 820 菌株, 该菌株适应于中糖发酵 1 与此同时, 张克旭等4 以 A s1. 299 为亲株, 突破了产酸率 10%

的大关, 但是, 必须采用吐温强制控制发酵 1 由于糖蜜原料发酵的厂家少, 仅限于新疆及内蒙、东北的有 1

关厂家, 因此推广受到限制 190 年代中期, 毛富根等5

株 L s168 菌株, 其遗传性比较稳定 1 采用激光对出发菌株 T 6213 进行辐射诱变, 选育出一

最近几年, 王岁楼等6 以 T 6213 为出发菌株, 经 Co 2Χ线、U V 和 D E S 复合诱变, 并且经过高温驯化, 获

得突变菌株 T Z2310, 具有耐高温, 不分解谷氨酸的特点, 在以淀粉原料发酵工艺中有良好的稳定性 1

云逢霖等7 以 T 6213 为出发菌, 经U V 线、N T G 等用原生质体等诱变方法, 选育出 S9114 菌株, 具有耐 高糖, 耐高谷氨酸, 不利用谷氨酸和产酸高的特性, 摇瓶产酸最高达 9. 69% 1

邱玉棠等8 利用 U V 线、氯化锂、香豆素等多因子复合诱变和高温驯化, 选育出琥珀酸、生物素营养

Ξ 收稿日期: 2001201209

基金项目: 新疆维吾尔自治区自然科学基金项目 (项目编号: 20001)

乌鲁木齐市重大科技攻关项目 (项目编号: Y 0010)

作者简介: 甄卫军 (19692) , 男, 讲师, 现为中国科学院在读硕士研究生 1 210 新疆大学学报 (自然科学版) 2002 年

双缺陷型的耐高糖、耐高谷氨酸且温度适应范围大 (32℃- 48℃) 的突变菌株 GM H - 9081

由于国内味精行业多采用 T 6213 为谷氨酸生产菌种, 经过连续多年的使用, 噬菌体的危害相当严重 1

国内谷氨酸基因资源相当贫乏, 在工业生产中, 可选择的菌株少, 选育抗噬菌体的菌株很有意义9 .

杨汝德10 利用传统选育技术经过反复多次筛选, 得到抗噬菌体菌株 U 29 , 可以抗 B 721 和 B 271 两种噬菌

体 1 阮法华等11 采用细胞融合技术选育得到抗噬菌体的非容源性菌株 ZG88 , 可以抗 T 6213 噬菌体 1

单志萍12 通过自发突变, 获得一株产酸较高的突变株 9217, 可以抗 T 6- 13 噬菌体 1

基因工程技术选育谷氨酸菌株的研究

20 世纪 70 年代后, 基因工程技术迅速发展, 在微生物育种方面得以应用 1 日本科学工作者首先用 2

基因工程方法, 将所需的某一供体微生物的遗传物质 DN A 提取出来, 在离体条件下切割后, 把它和供做

载体的 DN A 分子连接起来, 从而使基因得以转移出来 1 通过此法, 已经培育出一株高产菌株9 1 国内在

该领域仍处于起步阶段, 主要是采用细胞融合技术进行选育 1 张克旭等13 以 T G866 和 B 9 的原生质体进行

种间融合, 获得了兼有两亲株遗传形状的细胞个体大, 产酸高的融合子 F 263 和 F 288 , 经过摇瓶发酵, 发现融

合子稳定, 有一定的使用价值 1 国内吴其威14 利用克隆技术对天津短杆菌 T 6213 的八种氨基酸基因进行

了酶切定位研究, 为构造高产菌种打下了基础 1

张蓓等15 以 T 6213 为亲株, 利用物化复合诱变因子, 获得具有目的遗传标记寡酶素抗性和氟乙酸抗性

的两株突变株, 再以细胞融合技术选育出新的融合子, 通过摇瓶传代, 发现性状稳定 1

尽管近年来人们已迫切地研究利用原生质体融合及 DN A 重组等一系列的分子育种方法来选育 GA

高产菌, 由于发酵工业生产规模大, 反复扩大培养很容易引起质粒失活甚至丢失, 造成基因表达困难, 因

此采用基因克隆技术进行育种难度大6 1

离子束生物工程技术选育谷氨酸菌株的研究

1986 年中科院等离子体物理研究所余增亮研究员首创性地将离子束注入技术应用于农作物改良并

获得成功, 同时发现了离子注入对生物的诱变效应, 证实了质量 (离子) 生物效应的存在16 , 开辟了低能

离子与生物体相互作用的方向, 建立了质量、能量、电荷三因子作用的机制体系, 填补了重离子生物学的 3

空白17 1 离子束应用于生物技术, 是国际公认的拥有自主知识产权的研究成果18 1

现有的生产菌株对以往常用的物理和化学方法表现出不同的抗性, 离子束注入作为新的诱变源表

现出损伤轻、突变谱宽、突变率高和突变容易控制等特点19 , 离子束注入技术作为新型的诱变源在改良

微生物方面取得了丰硕的成果20 222 .

D 110 菌是以甜菜糖蜜为原料的谷氨酸产生菌 1 新疆是我国的重要甜菜糖料基地, 因此糖蜜资源非常

丰富, 但是由于各个糖厂甜菜糖蜜成分的不均一性, 加之 D 110 菌经过近 20 年的连续使用, 已经出现了较

大的衰退, 使得生产不稳定 1 因此利用人工诱变来选育高产的谷氨酸生产菌是生产厂家急需解决的问题

1 优良的菌株应具有耐高糖、耐高谷氨酸、糖蜜适应性稳定、倍增时间短, 同时不分解利用谷氨酸和细胞

渗透性好等特点 1

表 1 初筛菌与出发菌的摇瓶发酵结果

菌株号 乳酸% 转化率% GA % OD pH R G%

D 110 (出发菌)

D 5221 (初筛菌)

D 110B (出发菌)

D 3263 (初筛菌) 6. 2 2. 4 36. 39 1. 18 6. 7 2. 4

8. 4 2. 6 42. 8 1. 25 6. 5 1. 85

6. 0 2. 6 38. 05 1. 21 6. 7 2. 3

7. 5 2. 5 39. 1 1. 3 6. 6 2. 0

以D 110 和D 110B 为出发菌经过初步的一次和二次离子注入, 通过初筛和摇瓶 10 个批次的复筛, 得到了

两株较高产酸的菌株 1 其发酵结果见表 1, 两株高产菌株 D 和 B , 其多批次摇瓶平均产酸幅度分别

第 2 期 甄卫军等: 高产谷氨酸菌选育研究进展 211

达到 8. 4% 、7. 5% , 比出发菌分别提高 35. 48% 和 25% 1 初筛菌的糖酸转化率和产酸率均比出发菌高, 说

明其代谢活力较强 1

参考文献:

张克旭, 邱志成, 林瑾琳等 1 味精生产问答[M ]1 北京: 轻工业出版社, 1989, 1231

张克旭 1 氨基酸发酵工艺学 1 中国轻工业出版社 [M ]1 北京: 轻工业出版社, 1995, 781

郑善良, 郭荣根, 严建孙等 1 谷氨酸产生菌 FM 82027 菌株在 30 吨发酵罐中各种水解糖浓度的发酵工程研究[J ]1 氨基

酸杂志, 1986, (4) : 12217

张克旭, 高年发, 冯星如 1 关于谷氨酸高产菌W T H 21 菌的选育 [J ]1 食品与发酵工业, 1985, (3) : 222251

毛福根, 阮法华, 王志仁 1 耐高糖谷氨酸产生菌 L S168 的激光育种 [J ]1 发酵科技通讯, 1995, (1) : 5291

王岁楼, 张一震, 李志 1 谷氨酸高产菌 T Z2310 的诱变选育及其发酵的研究 [J ]1 中国调味品, 1997, (9) : 162181

云逢霖, 周婉冰 1 高产谷氨酸高产菌 S9114 的选育及生产实绩 [J ]1 华南理工大学学报, 1994, 22 (1) : 562621

邱玉棠, 李巍, 林小平 1 温度适应范围大的谷氨酸生产菌 GM H 2908 的选育、发酵及其应用效果 [J ] 1 微生物学杂志,

1994, 15: 17222.

袁品坦 1 谷氨酸菌种选育的进展及其回顾[J ]1 发酵科技通讯, 2000, 39 (1) : 152201

杨汝德, 张玉木奚, 陈连就 1 抗噬菌体突变株 U 29 的选育 [J ]1 发酵科技通讯, 1986, (2) : 492541

阮法华 1T 6213 ×A s1. 299 细胞融合抗噬菌体新种 ZG88 J ]1 发酵科技通讯, 1989, (1) : 1261

单志萍, 吴燕, 陆茂林等 1 谷氨酸产生菌 T 6213 抗噬菌体突变株的选育[J ]1 发酵科技通讯, 1990, (2) : 192231

合集下载

诱变法筛选高转化率谷氨酸棒杆菌

诱变法筛选高转化率谷氨酸棒杆菌

第４０卷第２期　２０１１年４月　发酵科技通讯　

诱变法筛选高转化率谷氨酸棒杆菌　

胡炎华　黄南　张祖栋　李岩　

（梅花生物科技集团股份有限公司　河北廊坊０６５００１）　

摘　要：以谷氨酸棒杆菌ＭＨ０２１为出发菌株，经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）三次诱变处理，磺胺胍和丙二酸　抗性平板筛选，得到一株高转化率谷氨酸菌株。在含有８０ｇ／Ｌ葡萄糖的发酵培养基中进行摇瓶发酵　２８ｈ，糖酸转化率较原始菌株提高了２２．１％。　

关键词：谷氨酸棒杆菌谷氨酸诱变　筛选　

利用微生物发酵法生产谷氨酸已有５Ｏ多年　的历史＿ｌＪ，目前我国多采用生物素亚适量型菌株　

进行发酵生产。２００８年报道的平均产酸约为　１０５ｇ／Ｌ左右，糖酸转化率约为５５％．与国外进行　

的谷氨酸强制发酵平均产酸为１２０ｇ／Ｌ　１６０ｇ／Ｌ，　糖酸转化率高于６０％的水平有不小差距ｌ２Ｊ。在现　有条件和设备一定的情况下，通过不同方法定向　

选育高产和高效谷氨酸生产菌株，是提高产酸水　平、降低生产成本的有效手段之一。相对于构建　

基因工程菌株而言，利用传统物理或化学诱变方　法进行处理，进而获得特异性的突变菌株的方法　

在操作上更具有简便易行的优点，国内在这方面　已有很多报道ｌ３－７１。获得的菌株也为后续的原生质　

体融合或通过其他手段筛选高产谷氨酸菌株打　下了良好的基础［４＿６】。本研究在传统诱变的基础　上，采用丙二酸和磺胺胍作为平板筛选条件．经　

摇瓶发酵复筛，得到具有这两种物质抗性的菌　株，该菌株的糖酸转化率较出发菌株有明显提高，　

对继续进行诱变或通过其他方式筛选谷氨酸优良　菌具有重要意义　

１试验材料与方法　

１．１试验材料　

１．１．１菌株　

出发菌株：谷氨酸棒杆菌ｆＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　

ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＭＨ０２１，本公司研发部保藏菌株。　１．１．２培养基（ｇ／Ｌ）　完全培养基：葡萄糖５，牛肉膏ｌ０，蛋白胨　１０，ＮａＣ１　５，琼脂１５，ｐＨ　７．０－７．２。　基本培养基：葡萄糖５，硫酸铵２，Ｋ　ＨＰＯ　

谷氨酸的发酵和提取工艺综述

谷氨酸的发酵和提取工艺综述

⾕氨酸的发酵和提取⼯艺综述

综述：⾕氨酸的发酵与提取⼯艺

第⼀部分⾕氨酸概述

⾕氨酸⾮⼈体所必需氨基酸，但它参与许多代谢过程，因⽽具有较⾼的营养价值，在⼈体内，⾕氨酸能与⾎氨结合⽣成⾕氨酰胺，解除组织代谢过程中所产⽣的氨毒害作⽤，可作为治疗肝病的辅助药物，⾕氨酸还参与脑蛋⽩代谢和糖代谢，对改进和维持脑功能有益。另外，众所周知的⾕氨酸钠盐即味精有很强烈的鲜味，是重要的调味品。1996、1997、1998年味精年产量分别为55.0万吨、56.64万吨、59.03万吨。尽管如此，我国⼈均年消耗味精量还只有400g左右，⽽台湾省已达2000g。因此，中国将是世界上最⼤的潜在味精消费市场，也就是说，味精⽣产会稳步发展。这也意味着⾕氨酸的⽣产不断在扩⼤[1]。

⾕氨酸⽣产⾛到今天就⽣产技术⽽⾔已有了长⾜进步,⽆论是规模还是产能都今⾮昔⽐,与此同时各⼚家还在追求完美, 这是⾏业进步的动⼒,也是⽣存之所需。实际上⽣产⼯艺是与时俱进的,没有瑕疵的⼯艺是不存在的。如:配⽅及提取⽅法现在是多种多样,有单⼀⽤纯⽣物素的,也有⽤⽢蔗糖蜜加纯⽣物素的, 还有加⽟⽶浆⼲粉或麸⽪⽔解液及⾖粕⽔解液等等;提取⽅法有:等电-离交、等电-离交-转晶、连续等点-转晶等等[2]。

本综述简述⾕氨酸⽣产的流程及发酵机制，着重介绍⾕氨酸的提取⼯艺。

第⼆部分⾕氨酸⽣产原料及其处理

⾕氨酸发酵的主要原料有淀粉、⽢蔗糖蜜、甜菜糖蜜、醋酸、⼄醇、正烷烃(液体⽯蜡)等。国内多数⾕氨酸⽣产⼚家是以淀粉为原料⽣产⾕氨酸的，少数⼚家是以糖蜜为原料进⾏⾕氨酸⽣产的，这些原料在使⽤前⼀般需进⾏预处理。(⼀)糖蜜的预处理

⾕氨酸⽣产糖蜜预处理的⽬的是为了降低⽣物素的含量。因为糖蜜中特别是⽢蔗糖蜜中含有过量的⽣物素，会影响⾕氨酸积累。故在以糖蜜为原料进⾏⾕氨酸发酵时，常常采⽤⼀定的措施来降低⽣物素的含量，常⽤的⽅法有以下⼏种:(1)活性炭处理法; (2)⽔解活性炭处理法;（3）树脂处理法。(⼆)淀粉的糖化

高产谷胱甘肽酿酒酵母菌株的诱变选育研究

高产谷胱甘肽酿酒酵母菌株的诱变选育研究

高产谷胱甘肽酿酒酵母菌株的诱变选育研究

郝淼闻;俞志敏

【摘 要】考察了半胱氨酸(CYS)添加量和添加时间对酿酒酵母(Saccharomy

cerevisiae Y08)合成谷胱甘肽(GSH)的影响.结果表明:在发酵开始时添加半胱氨酸,能够增强菌体合成GSH能力,当添加量达到0.05％时,GSH产量达到最大值(52.28mg·L-1).在发酵稳定期(10h)添加半胱氨酸,胞内GSH含量增加不显著,GSH产量仅提高了10.57％.为降低半胱氨酸对菌体生长的抑制,对酿酒酵母原生质体进行复合诱变,筛选半胱氨酸抗性突变菌株.结果表明:半胱氨酸对半胱氨酸抗性突变菌株的生长抑制作用减轻,抗性菌株能够在含有0.4％半胱氨酸的发酵液中正常生长,GSH产量和胞内GSH含量比未加半胱氨酸时均有显著提高,分别提高了29.28％和29.64％,且性状稳定.

【期刊名称】《沈阳农业大学学报》

【年(卷),期】2013(044)006

【总页数】5页(P832-836)

【关键词】半胱氨酸;酿酒酵母;谷胱甘肽;生物合成

【作 者】郝淼闻;俞志敏

【作者单位】大连工业大学学报编辑部,辽宁大连116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连116034

【正文语种】中 文

【中图分类】Q93

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种含有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成[1-2]。GSH上的活性巯基易与氧化物质和毒素结合，通过生物转化，将其排除体外，起到抗氧化和解毒的作用[3-4]。GSH不仅可用于广谱的解毒药物，更可用于延缓衰老和提高免疫力等功能性食品的基料[5]。发酵法生产GSH是目前最普遍的GSH生产方法，生产菌株以积累GSH的酿酒酵母(Saccaromy cerevisiae)为主[6]。半胱氨酸是菌体合成GSH的关键前体氨基酸[7]，在GSH生产过程中添加半胱氨酸可以显著提高GSH的产量，但半胱氨酸对菌体生长具有抑制作用。采用传统的化学诱变剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等)和物理诱变剂(紫外线和X射线)对酵母进行诱变，可以筛选得到GSH高产菌株[8-10]。童群义等[11]采用紫外照射、紫外照射+LiCl联合处理、亚硝基胍等诱变处理，获得一株高产GSH的酿酒酵母优良菌株S.cerevisiae JN-5-8。贾学杰等[12]对酵母菌进行硫酸二乙酯诱变、紫外诱变及两者的复合诱变，ZnCl2、乙酸氨酸抗性交替筛选得GSH的单倍体F4（a，Arg-，ZnCl2r，Ethr）。然而，采用复合诱变方法筛选半胱氨酸抗性菌株尚未见到报道。本试验在研究半胱氨酸对S.cerevisiae Y08的GSH生产性状的影响的基础上，对菌株进行紫外-亚硝酸复合诱变，在含有不同浓度半胱氨酸的高渗培养基上筛选半胱氨酸抗性菌株，所筛选到的菌株能够在发酵初期较高浓度的半胱氨酸环境下正常生长，并可以利用半胱氨酸高产GSH。

微生物发酵产聚谷氨酸工艺研究

微生物发酵产聚谷氨酸工艺研究

微生物发酵产聚谷氨酸工艺研究

摘要：谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。以枯草芽孢杆菌纳豆亚种为出发菌株，考察不同碳氮源及NaCl 浓度、谷氨酸、种龄、接种量对微生物发酵产γ- 聚谷氨酸的影响，以提高γ- 聚谷氨酸的产量。方法：该菌菌种活化后，接入种子培养基，于37℃、200 r/min 震荡培养18 h，然后按2 %接种量接入不同发酵培养基进行发酵培养。γ- 聚谷氨酸分离纯化后，根据其产量筛选最适发酵培养基组成及发酵条件，并对产物进行分析测定。

关键词：γ- 聚谷氨酸；纳豆菌；发酵；优化培养

一、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto），系作者筛选，由本校微生物教研室罗兵教授鉴定确认，于实验室保存。

1.1.2 培养基斜面培养基：大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 7.5 g/L，琼脂20 g/L。

种子培养基：大豆蛋白胨20 g/L，葡萄糖30 g/L，谷氨酸钠25 g/L，NaCl 5 g/L。液体发酵培养基：大豆蛋白胨30 g/L，葡萄糖40 g/L，谷氨酸钠30 g/L，NaCl15 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，KH2PO4 4.0 g/L，Mg-SO4 0.5 g/L，CaCl2 0.25 g/L 及少量生物素[1]。以上培养基pH 均为7.0-7.2，在121℃下高压灭菌20 min。

1.1.3 试剂γ-PGA 标准品为Sigma 公司产品；系列葡聚糖标准品（Shodex P-82 standard 标准品， 分子量（Mr） 分别为5900，11800，22800，47300，112000，212000，404000，788000）为SHOWA DENKO 公司产品；叠氮钠、硫酸钠、蛋白胨、葡萄糖、谷氨酸等均为国产分析纯。

1.2 方法