山东宁阳大枣快繁体系的建立

Ｃ…ＮＥＳＥ　ＨＯＲＴ　ｌ　ＣＵＬＴＵＲＥ　ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ　

山东宁阳大枣快繁体系的建立　

冯殿齐　刘　静赵进红　张　虹　黄艳艳王玉山　

（山东省泰安市泰山林业科学研究院，山东泰安２７１　ｏｏｏ）　

摘要：为探讨山东宁阳大枣组培快繁技术，以宁阳大枣新生枝条为外植体，通过诱导愈伤组织形成及不定茅分　

化，对建立高效的快繁体系进行研究。试验结果表明：同一基因型的不同取材部位其培养效果间差异不大；枣树　

新生枝条是建立无菌外植体的合适的外植体材料，适宜枣树分化愈伤组织的培养基是ＭＳ＋ＢＡ１．Ｏｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．Ｏｍｇ／　Ｌ＋ＮＡＡＯ．０１ｍｇ／Ｌ＋琼脂０．７５％＋蔗糖３％。适宜不定芽诱导的适宜培养基是ＭＳ＋ＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０５ｍｇ／　

Ｌ＋琼脂０．７５％＋蔗糖５％。　

关键词：枣树；外植体；愈伤组织；再生植株　

宁阳大枣又称圆铃大枣，主要品种有‘圆红’、　‘长　红’和‘酸铃’，为山东省名优特产之一　宁阳大枣在　生产上用常规方法繁殖速度慢，多年来一直受到枣疯病困　扰，极大地限制了大枣产业化的快速健康发展。国外从５０　年代起就开始对枣疯病进行研究，我国对枣疯病的防治技　术也进行了大量的探索，发现有５０多种植原体病害危害枣　树生长，因此，加强对枣疯病株“脱毒”和枣树无毒苗培　养技术的研究开发为当务之急。利用组织培养技术进行快　速繁殖可在短期内提供大量优质的脱毒苗，为进一步利用　生物技术培育转基因抗病新品种奠定基础。　ｌ材料与方法　

１．１　材料来源　

自泰山林业研究院苗木繁育基地剪取两个品种当年新　生枣头枝条为外植体。　１．２无菌体的建立　

１．２．１　外植体处理　去掉多余叶片，用自来水冲洗１０ｍｉｎ　后，在超净工作台上进行外植体消毒，先用７０％的酒精消　毒ｌ５ｓ，再用０．１％升汞消毒，用无菌水冲洗４～５遍，滤纸　吸干后接于启动培养基上。每瓶接３株。无菌室培养条件：　培养温度２５±１℃，光照时间为１２ｈ／ｄ，光照强度为２０００　Ｌｘ。　１．２．２　无菌体建立试验设计对宁阳大枣不同品种和部位　的外植体建立进行Ｌ　（２　）正交试验设计（见表１　ｏ　

表１无菌体建立试验设计Ｌ　（２　）　

１　２　长红　圆红　５　６　枣头　枣吊　

第一作者简介：冯殿齐（１９５６－），男，研究员；主要从事林果　良种培育。　

一６—　１．３分化培养　

１．３。１　试验设计对‘圆红’、　‘长红’两品种外植体按　照４因素３水平正交试验设计，接种后每１　０ｄ调查１次分化的　数目、颜色、大小、分化芽数及新生侧芽数、新侧芽生长　量、颜色（见表２）。　

表２正交试验设计Ｌ。（３　）　

１　２　３　１．Ｏ　２．Ｏ　３．Ｏ　０．５　１．Ｏ　１．５　０．０１　０．Ｏ５　０．１０　

１．３．２培养条件培养温度２５±１℃，光照时间为１２ｈ／ｄ，　光照强度为２０００Ｌｘ。　２结果与分析　

２．１无菌体建立　

按照试验设计，外植体接种后每天观查，记录第１０ｄ结　果（见表３）。　

表３宁阳大枣外植体接种第１　０ｄ调查　

由表３看出，组合１和组合２的污染率为零，生长势强，　培养中生长状况一直良好；组合３的污染率３３．３％，生长势　中等偏弱；组合４的污染率最高，生长势最弱，且随时间延　长生长势滑落较明显。　２．２不同组合分化培养试验分析　

选择ＢＡ、ＫＴ、ＮＡＡ三种激素进行正交试验设计，培　养第４０ｄ时，利用‘长红’品种的枣头进行分化培养，结果　与极差分析见表４。　由极差分析结果可以看出：ＢＡ对愈伤组织颜色、

　表４接种后第４０ｄ分化结果与极差分析　中国园艺文摘２０１０年第２期　

注：愈伤组织颜色代表值黑色为５、黄色为４、透明色为３、黄褐色为２、褐色为１、无为０。下同。　

新生侧芽个数影响最大，ＮＡＡ对新侧芽生长、愈伤组　织大小影响最大。ＫＴ对新生侧芽个数、新侧芽伸长生　长影响力一般，对愈伤组织大小和颜色影响最小。培养　

基组合ＭＳ＋ＢＡ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０ｌｍｇ／　Ｌ最利于新生侧芽增殖；ＭＳ＋ＢＡ　１．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ　１．０ｍｇ／　Ｌ＋ＮＡＡ０．０ｌｒａｇ／Ｌ利于愈伤组织增大；培养基组合　ＭＳ＋ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ最利于　侧芽伸长生长，并且在ＭＳ＋ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ　１．５ｍｇ／Ｌ＋　ＮＡＡＯ．０５ｍｇ／Ｌ的培养基中愈伤组织颜色最深为黑褐色。　

２．３不同组合分化苗生长动态分析　

对不同处理每１０ｄ调查１次，记录‘长红’品种分化新　生侧芽生长情况（见图１～４）。　从图ｌ可以看出，各组合生长状态一直处于上升趋势。　直到第１０ｄ，各组合都有显著分化生长，新生侧芽的个数　均有增多，组合１、组合９新生侧芽个数达到２个以上；第　２０ｄ，除组合７有明显继续生长外，各组合新生芽个数明显　

一

７一　ＣＨ　Ｉ　ＮＥＳＥ　ＨＯＲＴ　ｌ　ＣＵＬＴＵＲＥ　ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ　

酞　嚣　＋组合ｌ　・一组合２　＋组合３　—静一组合４　—费一组合５　—・一组合６　＿垂＿组合７　一组合８　一组合９　＋对照ｃｋ　

０　１０　２０　３０　４０　培养天数（ｄ）　图１侧芽新生个数动态分析　

减少，可能是由于培养基内养分减少及瓶内环境变化导致　

的植株总体生长减缓，至第２０～３０ｄ各组合又出现一次明显　的分化，但分化速度低于第ｌＯｄ时；第３０～４０ｄ时，组合２、　组合９分化芽数持续增加，其余各组合增速明显降低。　

１０　

０　１Ｏ　２Ｏ　３０　培养天数（ｄ）　图２侧芽生长量动态分析　

从图２可以看出，各组合的侧芽生长量随时间变化呈不　断增长的趋势：前１０ｄ分化速度较快，组合３的侧芽生长量　增速最快；在１０～３０ｄ中除组合７外，其他组合生长都出现　明显减缓，第３０ｄ，组合９生长量增幅最大，超过６ｒａｍ；除　组合７外，在３０ｄ后各组合的生长速度都有明显增长，组合　９的侧芽生长量达到最大值；在第４０ｄ时，除组合４、组合　６外，其他组合的侧芽生长量均大于对照，但各组合生长　速度变缓，前４０ｄ组合４的侧芽生长量一直处于较低水平，　但在３０～４０ｄ期间组合４的生长量有急速增大，增幅超过　６ｒａｍ。综合分析侧芽生长量随时间变化曲线，组合７、８在　前２０ｄ的侧芽生长量增速最快，组合９￣１／Ｉ］芽生长量最大。　

Ｏ　ｌ０　２０　３０　培养天数（ｄ）　图３愈伤组织大小（直径ｍｍ）动态分析　

从图３可以看出，前２０ｄ各组合愈伤组织直径大小随时　间的变化不明显；２０ｄ后除组合６无明显变化外各组合愈伤　组织生长速度均显著加快；在２０～４０ｄ组合８的愈伤组织直　

一８一　径最大，且这个优势一直保持到最后；在４０ｄ时各组合的愈　伤组织的大小都达到最大值，组合１、３、５、８０９愈伤组织　直径明显大于对照及组合２、４、６、７、９的愈伤组织直径。　组合６的愈伤组织出现最晚，在第３０ｄ时直径才开始明显增　大。　

６　

面５　骚４　３　嚣ｚ　

１　０　０　ｌ０　２０　３Ｕ　４Ｕ　培养天数（ｄ）　注：颜色代表值黑色为５、黄色为４、透明色为３、黄褐色为２、褐　色为１、无为０。　图４愈伤组织颜色（分值）的动态分析　

从图４可以看出在从第２０ｄ开始愈伤组织颜色变化明　显，除组合６、９９ｂ，颜色值均迅速增大，组合ｌ的愈伤组织　颜色值增大速度最快；在３０ｄ后组合１～８的愈伤组织颜色值　增大速度降低，组合１颜色迅速加深由黄色变为黄褐色，组　合９的愈伤组织颜色值显著增大到最高值５。　３　结论　

（１）宁阳大枣无菌外植体的建立以采用１～２年生苗截　干后春季新发出的嫩梢为试材，利用０．１％升汞溶浸泡　５～６ｍｉｎ灭菌后，获得无菌外植体效果最好，以‘长红’　品种生长势较强。　（２）选择‘长红’品种的枣头进行分化培养，试验结　果得出，影响新生侧芽分化和愈伤组织大小的最佳培养　基配方为ＭＳ＋ＢＡ１．０＋ＫＴ１．５和１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０ｌｉｎｇ／　Ｌ；影响新生侧芽生长量和愈伤组织颜色的最佳培养　基配方为ＭＳ＋ＢＡ３．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１．Ｏｍｇ／Ｌ和１．５ｍｇ／　Ｌ＋ＮＡＡ０．０５ｍｇ／Ｌ，由此得出，减少ＫＴ的浓度有利于愈　伤组织的分化，增加ＫＴ的浓度有利于愈伤组织颜色生长，　但从影响因子的大小来看ＫＴ影响力一般。　（３）从各组合分化培养动态分析结果得出，侧芽分化生　长在接种１０ｄ内呈现迅速上升趋势，但到第２０ｄ时分化生长　明显下降，到第３０ｄ时分化生长速度又开始达到新的高峰，　

一直持续到第４０ｄ，生长速度缓慢上升；愈伤组织分化生长　在接种２０ｄ内生长缓慢，到第３０ｄ时生长速度加快，一直到　第４０ｄ，生长速度呈直线上升趋势。　

参考文献：　［１］王义平，李永红．枣树组织培养育苗技术［Ｊ］．山西水土保持科　技，２ｏ０１，（３）：４５—４６．　［２］赵薇，彭建营．枣树组织培养研究进展［Ｊ］．生物技术通报，　

２００７．（３）：５７—６２．　［３］王玖瑞，刘孟军，代丽．枣组培中的品种差异及辣椒枣的组培快　郁　邻　组组组组组组组组组对　｝｛｝｝｝｝｝ｊ　Ｉ｝　５　２　５　１　５　Ｏ　２　ｌ　０　

郁　黜　组组组组组组组组组对　｝｛｝｝＝＝ｆ｝　创组｝５

４中国园艺文摘２０１０年第２期　

景天基于ＷＲＫＹ转录因子分子标记体系的初步建立　

牛艳秀　赵娜　冷平生。赵福宽　

（１．北京农学院生物技术系，北京１　０２２０６；２．北京农学院园林系，北京１　０２２０６）　

摘要：用ＣＴＡＢ法提取三七景天基因组ＤＮＡ，根据已报道的辣椒ＷＥＫＹ的转录因子保守区域设计引物，对影响　ＰｃＲ扩增反应的主要因素进行初步研究，建立景天基于转录因子的分子标记技术体系。在２Ｏ　Ｊ的反应体系中，　ｄＮＴＰｓＯ．４ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＮＡ模板３０ｒｉｇ。扩增程序为：９４口Ｃ预变性４ｍｉｎ，反应前７个循环在９４。Ｃ　３０ｓ、６０　Ｃ　５０ｓ、７２。Ｃ　１ｍ｝ｎ条件　

下进行，随后５个循环在９４。Ｃ　５０ｓ、６０。Ｃ　５０ｓ、７２。Ｃ　４５ｓ条件下进行，随后１　５个循环在９４。Ｃ　５０ｓ、４８。Ｃ　５０ｓ、７２　Ｃ　１ｒａｉｎ、　

９４。Ｃ　３０ｓ、４０。Ｃ　５０ｓ、７２℃１ｒａｉｎ条件下进行，最后７２　Ｃ延伸１　Ｏｍｉｎ。　关键词：三七景天；转录因子；分子标记　

转录因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）是具有同真核启动子特　定ＤＮＡ序列结合活性的蛋白质分子，其主要功能是激活或　抑制基因的转录反应。ＷＲＫＹ蛋白是近年来发现的一类植　物特有的转录因子，该类转录因子含有ＷＲＫＹ结构域，能　特异性识别与其互作的顺式元件ｗ一盒，与植物防御反应　

第一作者简介：牛艳秀（１９８４一），女，硕士研究生；研究方向为　

蔬菜育种与生物技术。　通讯作者：赵福宽，教授。Ｅ－ｍａｉ１：ｚｈａｏｆｕｋｕａｎ￣ｓｉｎａ．ＣＯＩｌｌ　项目来源：北京市科委“百合与特色宿根花卉种苗生产关键技术　

研究”资助项目（Ｚ０８０００５０３２５０８０１７）。　密切相关　。目前已从不同植物中克隆到多种ＷＲＫＹ转录　因子，其中仅拟南芥就含有１００多种ＷＲＫＹ成员　。生物的　进化程度越高，其基因组越复杂，基因数量越多，而转录　因子所占比例也越高　。在生物体内，同一个转录因子可能　与多个生长发育和生理代谢过程有关，而同一代谢过程则　又可受多个转录因子的调节　Ｊ。　三七景天（Ｓｅｄｕｍ　ａｉｚｏｏｎ）为景天科多年生草本　，簇　生，茎直立，叶互生，小花密集，花型整齐，园林中常用　来布置花坛或地被植物，有很好的药用价值　。对三七景天　资源进行分子标记分析，可以方便对其进行深入系统的研　究，从而可以加速对现有种质资源的鉴别、保护、合理利　用。本文目的在于建立三七景天基于ＷＲＫＹ转录因子的分　子标记反应体系，为分子标记技术在三七景天种质资源上　的进一步研究与应用奠定基础。