RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南讲解学习

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。

加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。

e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。

弃上清，收集白细胞沉淀。

每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。

2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。

取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。

如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。

5. 4 ℃10 000rpm离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。

（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）6. 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置20-30min。

植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA。

可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。

7. 4 ℃10 000rpm离心10min，去上清。

离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

8. 加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。

每使用1ml Trizol至少加1ml 乙醇。

9. 4 ℃10 000rpm离心2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

10. 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。

加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。

如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。

RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事项：1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ：加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 ℃放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。

如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70 ℃长期保存。

预防RNase污染，应注意以下几个方面：1. 经常更换新手套。

因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。

但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。

注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

不同组织或细胞RNA提取预期得率植物叶片100-200ug/g叶片动物组织200-400ug/g肝脏组织动植物培养细胞5-10ug/106细胞大肠杆菌2-10ug/mlDH5α过夜菌血液3-5ug/ml人全血问题指南：低得率A. 样品裂解或匀浆处理不彻底B. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65A. 检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。

低离子浓度和低pH条件下A280会较高。

B. 样品匀浆时加的试剂量太少。

C. 匀浆后样品未在室温放置5min。

D. 水相中混有有机相。

E. 最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解A. 组织取出后没有马上处理或冷冻。

B. 样品或提取的RNA沉淀保存于-5~-20℃，未在-60~-70℃保存。

C. 细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。

D. 溶液或离心管未经RNase去除处理。

E. 电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。

DNA污染A. 样品匀浆时加的试剂体积太少。

B. 样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。

蛋白和多糖污染A. 样品中蛋白、多糖含量高。

B. 样品量太大。

C. 水相中混有有机相。

D. 第6步中加入RNA助沉剂可以帮助去除这些污染。

RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。

1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

5、融解RNA一般使用TE。

6、保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于- 70℃。

用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。

来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。

当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。

氯化锂法提取总RNA：本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丢失的缺陷。

试验试剂：1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】试验步骤：1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。

2、匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。

3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。

4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。

5、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。

6、70％乙醇洗沉淀一次。

真空干燥。

7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。

蛋白酶－热酚法－本方法适合于病毒RNA的提取试验试剂：1、蛋白酶K（终浓度50ug/ml）2、2×缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL试验步骤：1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。

2、加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。

3、离心，取上清，氯仿抽提一次。

4、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。

5、70％乙醇洗沉淀一次。

真空干燥。

6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。

RNA提取实验经验心得总结一：实验的准备实验之前必须先准备好相关的试剂和实验用品．试剂：１.TRIZOL,一步法提取ＲＮＡ用的，最好是INVITROGENE的，１００ml850RMB,不过也有国产的，便宜些．这个试剂是非常关键的，也是不能省的，经常有很多朋友不想买这个，嫌贵，个人感觉是非买不可，不然用其他办法自己配的话也不便宜，而且配的过程中很毒．2.异丙醇，无水乙醇，三氯甲烷（氯仿），ＤＥＰＣ３.逆转录酶等．一般如果做的次数不是很多的话可以买试剂盒的，里面什么都有，ＰＲＯＭＥＧＡ的也不是很贵，记得是３０次的６００多．但是如果实验室做得比较多的话，还是自己分开买的比较好．Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶个人觉得ＰＲＯＭＥＧＡ的最好，而且不贵，其他公司我用得也不多，反正一直用ＰＲＯＭＥＧＡ，还有ＤＮＴＰ，oligod(T)n,RNA酶抑制剂，除了逆转录酶买ＰＲＯＭＥＧＡ的，其他的几样我都是买的ＴＡＫＡＲＡ的，因为promega的其他几样都很贵，这样配起来用一点也不比原装的差．当然实验室比较富裕的也可以买好的，不过话说回来，咱们花的经费大多数还是民脂民膏，这些不太关键的地方省着点比较好（我是不是太罗嗦了！）４.用具．各种大小的枪头和ＥＰ管。