细胞的细菌、真菌污染及排除

细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。

3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。

4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。

5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。

6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。

7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。

二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。

24小时就满视野都是了。

污染源大多数情况下是培养用血清。

图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。

长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。

培养液澄清。

低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。

图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。

常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。

本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。

关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。

细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。

在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。

1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。

其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。

1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。

最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。

过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。

在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。

对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。

除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。

一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。

另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。

1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。

在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。

此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。

高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。

细胞培养污染的途径、危害及预防措施污染是细胞培养技术中面临的主要问题。

由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。

某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。

培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。

培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。

由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。

随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。

此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。

因此，熟悉细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染，保证实验体系的稳定性和可靠性。

1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。

细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库，当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。

每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。

同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。

为了保证培养细胞系的完整性，必须进行具体的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。

具体的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。

经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。

培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。

随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。

应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。

细胞无菌检测总结背景介绍在细胞培养实验中，细胞的无菌性是一个十分重要的指标。

细胞的无菌性检测可以帮助我们确定培养过程中是否发生了细菌、真菌或其他微生物的污染。

若发生了污染，可能会对实验结果产生严重的影响。

因此，进行细胞无菌检测是非常必要的。

常用的细胞无菌检测方法1.培养基菌落法：将培养基均匀地涂布在含有细胞的培养皿上，然后在适当的温度下孵育一段时间。

观察培养皿上是否有菌落的生长。

若出现了菌落，则说明细胞培养中存在细菌或真菌的污染。

2.DNA分子检测法：通过提取细胞培养物的DNA，使用示踪探针或荧光染料进行PCR反应，扩增并检测常见的细菌和真菌的DNA序列。

若检测到了目标DNA序列，则说明细胞培养物中存在细菌或真菌的污染。

3.常规培养法与生化法：将细胞培养物接种到适合生长的培养基中，并观察是否有菌落的形成。

如果菌落形成了，可通过进一步的生化试验来确定菌落的类型，从而确认是否存在细菌或真菌的污染。

细胞无菌检测的步骤与注意事项1.实验前准备：•实验器材和培养基的消毒：使用高温高压灭菌器或消毒液对实验所需的培养皿、培养液和其他器材进行消毒处理，确保其无菌性。

•实验操作区域的清洁：对实验操作区域进行彻底的清洁，包括试验台面、操作工具和周围环境。

•严密控制环境：保持实验室尽量干燥、无尘、无霉，确保实验环境的无菌性。

2.细胞培养无菌检测步骤：•提取样品：将要进行无菌检测的细胞样品轻轻地收集到一个无菌的容器中，注意避免任何可能的污染。

•培养基的制备：根据实验需要选择适当的培养基，并按照操作指导书的要求制备。

•培养基划线法：将培养基均匀涂布在培养皿中，然后将细胞样品均匀涂布在培养皿上。

•孵育：将培养皿放置在适当的温度和湿度下，孵育一段时间。

这段时间要根据细胞的生长特点和培养基的要求来确定。

•观察结果：在培养基上观察是否有细菌或真菌的生长。

若出现菌落，则可能存在细菌或真菌的污染。

3.注意事项：•注意无菌操作：在进行细胞无菌检测的过程中，保持无菌操作是非常重要的。

如何正确判别细胞培养中的细菌与真菌污染在进行细胞培养实验的过程中，细菌与真菌污染是一个常见但也十分令人头疼的问题。

当我们在观察和分析细胞时，准确判断细胞培养中的细菌与真菌污染是至关重要的。

本文将从不同的角度探讨如何正确判断细胞培养中的细菌与真菌污染。

一、观察细胞形态观察细胞形态是判断细胞培养中是否存在细菌与真菌污染的一种重要方式。

细菌和真菌的形态和生长方式有很大的差异。

细菌在培养皿中呈现为小圆点状或线状的结构，而真菌则可能形成大而明显的菌落或菌丝。

此外，真菌会产生孢子，看起来像是一串串小颗粒。

通过观察细胞周围的结构，可以初步判断是否存在细菌与真菌污染。

二、检测培养基上的生长情况细胞培养中的细菌与真菌污染通常会导致培养基上的生长情况发生变化。

如果培养基上有细菌或真菌的存在，通常可以观察到菌落的形成。

在培养过程中，我们可以观察细胞生长的速度、密度和均匀性等指标，如果存在污染，这些指标可能会出现异常情况。

在评估培养基上的生长情况时，需要结合细胞培养的实际要求进行综合判断。

三、使用染色试剂染色试剂在细胞培养中的细菌与真菌污染判别中发挥着至关重要的作用。

常用的染色试剂有格拉姆染色和甲苯胺蓝染色等。

通过染色试剂的使用，细菌和真菌会呈现不同的颜色和形态。

细菌会呈现出紫色或蓝色，而真菌则通常呈现为绿色或红色。

通过对样品进行染色和观察，可以明确判断是否存在细菌与真菌污染。

四、利用PCR技术PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的基因检测技术，可以用于检测和鉴定细菌和真菌。

通过PCR技术，可以对细胞培养样品中的DNA进行扩增和分析，从而确定是否存在细菌与真菌污染。

PCR技术可以选择合适的引物，针对不同的细菌和真菌进行特异性扩增，提高判断污染的准确性。

五、更加严格的无菌操作在细胞培养实验中，更加严格的无菌操作是避免细菌与真菌污染的关键。

在实验过程中，我们应该始终保持实验室台面、培养皿、试管等工作区域的清洁。

在进行细胞培养前，用酒精或其他消毒液对操作台面进行清洁和消毒，避免细菌的传播。

最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。

并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。

待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。

孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。

其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。

预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。

，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。

一、细菌污染状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

预防和补救：1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！2.可在培养液或血清中加支原体预防剂。

3.若细胞一旦污染，建议加支原体清除剂，能清楚常见的革兰氏阴性和阳性菌。

二、霉菌及真菌污染状态：肉眼观察培养基发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。

预防和补救：1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。

2.控制外来人员进出实验室。

3.对实验室及培养箱进行彻底消毒。

4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。

悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。

贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，丢弃，重复此操作数次。

三、支原体感染状态：镜下黑色，多为多形，培养液一般会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

预防和补救：预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加预防支原体的抗生素。

补救：向培养基中添加抗生素，（如氧氟沙星10 μg/ml、环丙沙星10 μg/ml、卡那霉素20~50 μg/ml、四环素10~50 μg/ml、庆大霉素200μg/ml等抗生素），或者向培养基中添加支原体清除剂清除支原体数天。

四、黑蛟虫状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。

听说你的细胞被污染了？导语学会正确地进⾏细胞培养是细胞实验的基础，然⽽⼩⼼翼翼的你，怎奈何体外细胞的脆弱，百密终有⼀疏。

你偶然的⼀个喷嚏，不经意得捋捋你的头发丝，对于这些丢失体外抵抗能⼒的细胞都可能是毁灭性的灾害。

但是，并⾮所有的细胞污染都是致命的，若是及时发现，还是可以得到挽救的。

今天咱们的主题就是：教⼤家辨别各种细胞污染及如何应对。

如下图：实验室常见的细胞污染，你都知道属于哪种污染吗？细胞培养中的常见污染主要包括：细菌、霉菌、⽀原体、⿊胶⾍、病毒和交叉污染等，每⼀种污染都有各⾃的特点。

如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；⽽⽀原体和病毒对细胞的影响则是⼀种缓慢长期的过程。

下⾯就具体看看每⼀种污染。

1. 细菌污染（较容易被发现）引起原因：操作不规范或⽆菌措施不到位等；细菌污染种类：⽩⾊葡萄球菌，⼤肠杆菌，假单孢菌、枯草杆菌等；细胞污染后的变化：①污染后由于有⼤量酸性物质产⽣，因此培养基会短时间内由红⾊变为黄⾊；②由于细菌⼤量增殖，培养基变浑浊，稍微振荡后可见培养基表⾯有漂浮物；③普通倒置显微镜⾼倍镜观察，胞浆内可见⼤量颗粒（如下图红⾊箭头）；④细胞⽣长缓慢，逐渐变圆脱落。

如下图所⽰：左：悬浮细胞污染后，可见悬浮细胞个体远⼤于杆状细菌，⽽细菌呈⿊⾊颗粒状并会有较快的运动速度；右：贴壁细胞，可看到球状细菌分布于细胞周围并做剧烈运动。

细菌污染的细胞（左悬浮细胞，右贴壁细胞）图⽚来源：UNC School of Medicine处理措施：在培养液中添加双抗（P/S）处理；可⽤抗⽣素的常⽤量的5~10倍作冲击疗法，⽤药24~48h后再换常规培养液；另外添加西司他丁钠和亚胺培南（泰能）处理细胞，适⽤于培养⽤具被打翻、使⽤了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况[1]。

裸⿏体内接种法是⽐较有效和彻底的除菌⽅法。

主要包括腹⽔接种和⽪下荷瘤分离细胞。

既能彻底清除污染细菌，⼜能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。

细胞污染的种类有哪些1. 异物污染细胞培养的一个常见问题是异物污染。

异物污染是指在细胞培养过程中，由于一些外部因素导致培养器具或培养介质中出现的异物。

这些异物可能包括灰尘、纤维、酵母、细菌、真菌、病毒等。

这些异物不仅会干扰细胞的生长和功能，还可能引起未知的变化和不确定的结果。

因此，在进行细胞培养实验时，要特别注意避免异物污染。

2. 细胞污染细胞污染是指在细胞培养的过程中，细胞本身受到一些外部因素的污染，从而导致细胞的变异、功能受损甚至细胞死亡。

细胞污染可以由以下几种常见的污染源引起：a. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的污染之一。

常见的细菌污染源包括实验环境中的空气、实验器具、培养介质等。

细菌污染会导致细胞生长受阻、感染和细胞凋亡等，严重时甚至会使细胞无法继续培养和使用。

b. 真菌污染真菌污染是指一些真菌，如酵母菌等进入细胞培养环境中并污染细胞。

真菌污染会引起细胞外观的改变、生长受阻、功能受损等问题。

在细胞培养实验中，应特别注意真菌污染的防控。

c. 病毒污染病毒污染在细胞培养中较为罕见，但一旦发生，对细胞的影响极大。

病毒污染会导致细胞的变异、功能失调甚至细胞死亡。

因此，进行细胞培养实验时，必须定期进行病毒检测，并采取相应的防控措施以避免病毒污染的发生。

d. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中，细胞株之间或批次之间发生的互相污染。

细胞培养实验室中经常同时进行多个细胞系的培养，因此，交叉污染的风险也相应增加。

交叉污染会导致细胞株的混杂和受污染细胞株的功能异常。

为了避免交叉污染，实验室应有严格的实验室操作流程，并定期检测细胞株的纯度。

3. 其他污染除了以上几种常见的细胞污染，还有一些其他类型的污染也可能影响到细胞培养实验的结果，例如：•化学物质污染：来自培养介质、溶液、培养基等中的化学物质可能对细胞产生毒性影响，导致细胞的变异或死亡。

•辐射污染：细胞培养过程中可能存在来自辐射源的污染，这可能会对细胞的遗传物质和生理功能产生不可逆的损害。

整理总结：细胞培养中的第一大害——————————污染★★★lwf991229(金币+3,VIP+0):不错,很详细,不过有的图片打不开~~污染是细胞培养第一大害！预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

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细胞污染的类型一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染。

一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。

即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。

最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。

培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变而呈现黄色。

也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。

所以，每天应仔细观察。

污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。

一般细菌污染进程很快，大约污染一两天后肉眼就能显著观察到。

二、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。

最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。

念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间（发生卵圆形物体污染的几率很大）。

个体细小，有增多趋势。

镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。

真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。