细菌常见的生化反应试验（一）什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。
生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。
在培养基中加入可与被测终产物反应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应（二）生化试验的方法：1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。
2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。
3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。
4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
（三）生化试验的注意事项1.待检菌应是新鲜培养物，培养18~24h。
2.待检菌应是纯种培养物。
3.遵守观察反应的时间。
观察结果的时间，多为24或48小时。
4.应做必要的对照试验。
5.提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。
（四）检验细菌的生化试验范围:1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验（三）V-P试验（四）甲基红（Methyl Red）试验MR（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验（一）糖醇类发酵试验1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解1~2种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。
3、结果观察和记录：•产酸产气，阳性，以“⊕”表示•产酸不产气，阳性，以“+”表示•不产酸产气，阴性，以“-”表示应用：沙门氏菌可发酵葡萄糖但不发酵乳糖。
大肠埃希菌可发酵葡萄糖及乳糖。
有些菌可发酵同一种糖类，其发酵产生的代谢产物也不尽相同。
如大肠埃希菌和志贺菌均可发酵葡萄糖，但前者产酸产气，而后者仅产酸，故可利用此试验来鉴定细菌。
（二）葡萄糖氧化发酵OF试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。
氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。
2、方法：取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h天，每天观察结果。
应用：可用于鉴别肠杆菌科细菌（发酵型）与非发酵菌（氧化型或产碱型）。
也可用于鉴定葡萄球菌（发酵型）和微球菌（氧化型）。
3、结果观察与记录（三）V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的O2氧化为二乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与培养基中的蛋白胨中精氨酸等所含的胍基生成红色化合物，即V-P试验阳性，称V－P（+）反应。
应用：本试验常与甲基红试验一起使用。
二者结果通常相反。
即如大肠埃氏菌、沙门菌、志贺菌等甲基红呈阳性反应，而VP反应则为阴性。
沙雷菌、阴沟肠杆菌等，VP反应为阳性，而甲基红反应为阴性。
2、试验方法（1）奥梅拉（O’Meara）法（2）贝立脱（Barritt）氏法（3）快速法（１）奥梅拉法将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃培养48h，每1mL培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h ，或在48~50 ℃水浴放置2h后判定结果。
（2）贝立脱法将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养2天，每2mL培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1 ℃培养4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。
（3）快速法将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。
不产酸的培养物不能使用。
3、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P +（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P - （四）甲基红试验（MR）1、原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃或30 ℃（以30 ℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。
3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。
应用：主要用于大肠埃希菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）的鉴别。
•肠杆菌中许多细菌甲基红试验为阳性，如沙门菌、志贺菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌等为阳性，但肠杆菌属和克雷伯菌属为阴性。
（五）七叶苷水解试验１、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。
2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于36±1 ℃培养24h,观察结果。
3、结果观察与记录（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为+ （2）培养基不变色者，为阴性，记录为-（六）甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。
2、试验方法:取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于36±1 ℃培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。
3、结果观察与记录（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一）靛基质（吲哚）试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。
吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。
应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
2、试验方法所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂或（2）欧-波试剂将待检菌小量接种于培养基中，于36±1 ℃培养24~48h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。
或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。
3、结果观察与记录：呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+无红色者，为阴性反应，记-（二）硫化氢（H2S）试验1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。
3、结果观察与记录培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记-应用：用于肠道杆菌鉴定试验，如：沙门氏菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属及变形杆菌等为阳性；肠道杆菌中其他菌属为阴性，沙门菌属中的甲型副伤寒沙门菌也为阴性。
（三）尿素酶试验1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。
以此鉴别细菌。
应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定。
奇异变形杆菌和普通变形杆菌尿素酶阳性，雷氏普罗威登斯菌和摩氏摩根菌阳性，斯氏和产碱普罗威登斯菌阴性。
2、试验方法：挑取大量培养18~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。
培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。
如阴性应继续培养至4天，作最终判定。
3、结果观察与记录：培养基变呈粉红色，为阳性，记+培养基颜色不变，为阴性，记-（四）氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。
胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。
2、试验方法：取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1 ℃培养1~4天，每天观察结果。
3、结果观察与记录：试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-。
阳性反应试验管颜色变化过程：紫色→黄色→紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。
在培养的早期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液pH 下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，pH又回升至碱性，指示剂显紫色。
应用：沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试剂均为阳性。
志贺菌除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌均阳性。
故可作为肠杆菌科细菌鉴定的重要方法。
此外，对链球菌和弧菌科细菌的鉴定也有重要价值。
（五）苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。
2、试验方法：从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1 ℃培养18~24h后，加入氯化铁溶液4~5滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。
3、结果观察与记录试验管立即出现绿色，为阳性，记+无色为阴性，记-。
应用：本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌鉴定。
变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌均为强阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。
（六）明胶液化试验1、原理：有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。
