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一、实验目的细胞活力是细胞生物学研究中非常重要的指标，能够反映细胞在特定条件下的生长、代谢和功能状态。
本实验旨在通过多种方法检测细胞活力，了解细胞在不同条件下的生长情况，为后续实验研究提供依据。
二、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）2. 试剂：台盼蓝染色液、CCK-8试剂盒、Resazurin细胞活力检测试剂盒、ATP含量测定试剂盒、细胞培养液、培养基、PBS缓冲液等3. 仪器：显微镜、酶标仪、细胞计数板、细胞培养箱、超净工作台等三、实验方法1. 台盼蓝染色法（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）用PBS缓冲液洗涤细胞，加入适量的台盼蓝染色液，室温孵育5分钟。
（3）用PBS缓冲液洗涤细胞，观察细胞染色情况。
2. CCK-8试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl CCK-8试剂，避光孵育2小时。
（4）用酶标仪检测450nm波长下的吸光度（OD值）。
3. Resazurin细胞活力检测试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl Resazurin试剂，37℃孵育4小时。
（4）用酶标仪检测570nm和600nm波长下的吸光度（OD值）。
4. ATP含量测定法检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl ATP含量测定试剂盒，室温孵育10分钟。
（3）用酶标仪检测560nm波长下的吸光度（OD值）。
四、实验结果与分析1. 台盼蓝染色法通过显微镜观察，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色。
《绿原酸对体外培养成骨细胞活性影响的初步研究》一、引言随着人们对健康问题的关注度不断提高，骨骼健康成为了一个重要的研究领域。
成骨细胞作为骨骼形成和维持的主要细胞，其活性和功能的研究对于骨骼疾病的预防和治疗具有重要意义。
近年来，绿原酸作为一种具有生物活性的天然化合物，其在医学领域的应用受到了广泛关注。
本文旨在初步探讨绿原酸对体外培养成骨细胞活性的影响，为进一步研究其作用机制及潜在应用价值提供基础。
二、材料与方法1. 材料（1）成骨细胞：从新生小鼠的颅骨中分离并体外培养。
（2）绿原酸：购买自Sigma-Aldrich公司，纯度≥98%。
（3）实验试剂与仪器：包括细胞培养基、胰蛋白酶、MTT 试剂、酶标仪等。
2. 方法（1）成骨细胞的体外培养：采用适宜的细胞培养条件，对成骨细胞进行体外培养。
（2）绿原酸处理：将成骨细胞分为对照组和实验组，实验组加入不同浓度的绿原酸进行处理。
（3）活性检测：采用MTT法检测成骨细胞的活性，通过酶标仪测定吸光度，反映细胞的增殖情况。
（4）数据分析：采用SPSS软件进行数据分析，比较各组之间的差异。
三、实验结果1. 绿原酸对成骨细胞活性的影响实验结果显示，不同浓度的绿原酸对成骨细胞的活性产生了不同的影响。
在低浓度（0.1-1μM）下，绿原酸对成骨细胞的活性具有一定的促进作用；而在高浓度（>1μM）下，绿原酸则对成骨细胞的活性产生了一定的抑制作用。
2. 数据分析与图表展示通过SPSS软件对数据进行统计分析，绘制柱状图和折线图展示实验结果。
具体数据见表1和图1。
表1展示了不同浓度绿原酸处理后成骨细胞活性的变化；图1则直观地展示了各组之间成骨细胞活性的差异。
表1：不同浓度绿原酸处理后成骨细胞活性的变化（单位：%）| 绿原酸浓度(μM) | 对照组| 0.1μM | 0.5μM | 1μM | 5μM | 10μM || | | | | | | || 成骨细胞活性 | 100% | 110% | 120% | 130% | 95% | 85% |图1：不同浓度绿原酸处理后成骨细胞活性的变化折线图（请在此处插入折线图）四、讨论本实验初步探讨了绿原酸对体外培养成骨细胞活性的影响。
一、实验目的本实验旨在通过MTT/CCK8法检测细胞活力，计算细胞存活率，为后续细胞实验提供数据支持。
二、实验材料1. 细胞系：人胚胎肾细胞系HEK2932. MTT试剂：美国Sigma公司3. CCK8试剂：日本Dojindo公司4. 细胞培养箱：美国Thermo Fisher公司5. 酶标仪：美国BioTek公司6. 细胞培养瓶：美国Corning公司7. 无菌操作台：上海力辰科技8. 移液器：上海力辰科技三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁生长至约80%时进行实验。
2. 实验分组：将细胞分为对照组和实验组，实验组加入一定浓度的药物或化学物质处理。
3. 细胞活力检测：待细胞生长至实验所需状态时，按照以下步骤进行MTT/CCK8法检测。
（1）将细胞悬液以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板中，每组设3个复孔。
（2）培养24小时后，对照组加入100μl无药物培养液，实验组加入100μl含有药物或化学物质的培养液。
（3）继续培养24小时后，对照组加入20μl MTT试剂，实验组加入20μl CCK8试剂。
（4）培养4小时后，使用酶标仪检测各组吸光度（OD值）。
4. 数据分析：根据OD值计算细胞存活率，计算公式如下：细胞存活率 = （实验组OD值 - 空白组OD值）/（对照组OD值 - 空白组OD值）×100%四、实验结果实验结果显示，随着药物浓度的增加，实验组细胞存活率逐渐降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。
五、讨论本实验通过MTT/CCK8法检测细胞活力，结果表明药物或化学物质对HEK293细胞具有抑制作用，随着药物浓度的增加，细胞活力逐渐降低。
这为后续细胞实验提供了数据支持，有助于了解药物或化学物质对细胞的毒性作用。
六、实验总结本实验采用MTT/CCK8法检测细胞活力，操作简便、快速，结果准确。
通过本实验，了解细胞活力测试的基本原理和方法，掌握MTT法（MTT比色法）测定细胞活力的操作步骤，并分析细胞在不同条件下的活力变化。
实验时间：2023年4月10日实验地点：细胞生物学实验室实验材料：1. 细胞系：人肺上皮细胞（A549）2. MTT试剂：3-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）3. DMSO（二甲基亚砜）4. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素5. 细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、吸管、试管、离心机、酶标仪等实验方法：1. 细胞培养：将人肺上皮细胞（A549）接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至新的培养瓶中。
3. 实验分组：将传代后的细胞分为实验组和对照组，实验组细胞在特定条件下培养，对照组细胞在正常培养条件下培养。
4. 细胞接种：将实验组和对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为5×104个。
5. 细胞培养：将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。
6. MTT实验：向每孔细胞中加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。
7. 终止培养：弃去孔内液体，向每孔加入150μl DMSO，振荡混匀。
8. 比色：用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度（OD）值。
9. 数据分析：计算实验组和对照组的细胞活力，并比较两组间的差异。
1. 实验组细胞活力较对照组显著降低，说明特定条件下细胞活力受到抑制。
2. 不同浓度药物处理的实验组细胞活力呈剂量依赖性下降，说明药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验结论：通过MTT法测定细胞活力，可以有效地评估细胞在不同条件下的生长状态。
本实验结果表明，特定条件下细胞活力受到抑制，且药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验讨论：1. MTT法是一种简单、快速、灵敏的细胞活力测定方法，适用于多种细胞系和药物筛选实验。
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。
目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。
其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。
细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。
然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。
此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。
因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。
胞内羟基自由基测定机理：2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。
这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。
尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。
因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。
此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。
胞内羟基自由基测定方法：在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。
用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。
胞内超氧阴离子自由基测定机理：一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。
DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。
根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。
活性氧：活性氧(reactive oxygen species , ROS)是体内一类氧的单电子还原产物,，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2 %的氧生成的，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮等。
ROS 的产生主要是线粒体由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。
基本信息：氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体, 人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中, 就会感到憋气的痛苦甚至死亡。
所以, 自从1770 年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来, 氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。
可是, 科学技术迅速发展起来的今天, 我们知道, 不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性, 与一般的金属铁一样, 处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈” , 当然这种腐蚀与铁不同, 它体现在人体的细胞水平上。
特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。
1969 年McCord 与Fridovich 发现, 在生化反应过程中O2 获得一个电子还原生成超氧自由基(O-2 ), 进而经过红血球的分离精制后获得O-2 的清除灭活酶, 并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase , SOD)。
这一发现激发了大批的科学研究者致力于O-2 的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究, 去探索解明SOD 在生理学上的意义。
同时由O-2 衍生出来的过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,O2)也受到了人们的重视。
所谓的活性氧, 概括地说, 是指机体内或者自然环境中由氧组成, 含氧并且性质活泼的物质的总称:主要有一种激发态的氧分子, 即一重态氧分子或称单线态氧分子(O2);3 种含氧的自由基, 即超氧阴离子自由基(O-2 )、羟自由基(·OH)和氢过氧自由基(HO2);2 种过氧化物, 即过氧化氢(H2O2)和过氧化脂质(ROOH)以及一种含氮的氧化物(NO)等。
大血藤对破骨细胞活性及成骨细胞增殖分化作用的研究该研究采用1α，25-（OH）2VitD3诱导兔骨髓细胞法获得破骨细胞，以形态学观察、HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色来鉴定破骨细胞，用TRAP+细胞计数、TRAP活力测定和骨吸收陷窝的数量及面积来检测大血藤对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。
培养MC3T3-E1Subclone14（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14）细胞，用MTT法、碱性磷酸酶活力测定检测大血藤对其增殖和分化的影响。
结果表明大血藤醇提物和水煎物低、中、高剂量组（2，20，200mg·L-1）对破骨细胞分化及骨吸收功能具有抑制作用，并具有剂量依赖性。
大血藤醇提物和水煎物低、中剂量组具有促进MC3T3-E1Subclone14细胞增殖分化的作用，说明大血藤对骨质疏松有一定的防治作用，这种作用可能是通过抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞增殖分化来实现的。
标签：大血藤；破骨细胞；成骨细胞；骨吸收；增殖分化大血藤为木通科植物大血藤Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils.的干燥藤茎，味苦，性平，归大肠、肝经，具有清热解毒，活血，祛风止痛的作用，用于跌扑肿痛，风湿痹痛等[1]。
关于骨质疏松的中医病因病机，各医家都有自己的论述。
目前较为一致的观点是：骨质疏松的发生与肾、脾、瘀等都有关系，其中肾亏为主，脾虚为辅，血瘀是促进因素[2-3]。
因此，中药防治骨质疏松症多从补益肝肾、强筋壮骨、益气养血、活血化瘀入手。
大血藤为传统中药材，是一种强壮补血药[4]，可能具有抗骨质疏松方面的药理作用。
本文旨在研究大血藤对破骨细胞活性和成骨细胞增殖及分化的作用，为抗骨质疏松药物的开发提供理论依据。
1材料1.1动物及细胞48h内新西兰大白兔，购自贵州省畜牧研究所实验基地，清洁级，合格证号SCXK（黔）2012-001；MC3T3-E1Subclone14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14，购自中国科学院细胞库。
国骨质疏松杂志２０１５年５月第２１卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ。Ｍａｙ ２０１５，Ｖ０１ ２１．Ｎ０．５ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＷＷＷ．ｗａｎｆａｎｇｄａｔｅ．ｔｏｍ．ｃｎ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６－７１０８．２０１５．０５．００１ ５１９
・论著・
检测破骨细胞内活性氧水平方法的实验探究与应用
史俊 杨柳 黄强 刘建 罗卓荆 第四军医大学西京医院骨科，西安７１００３２
中图分类号：Ｒ３３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６．７１０８（２０１５）０５—０５１９．Ｏ５ 摘要：目的探究可以有效、准确且直观地检测破骨细胞内活性氧（ＲＯＳ）的方法，并应用其对破骨细胞分化过程中活性氧的 变化进行检测。方法培养ＲＡＷ２６４．７细胞系作为破骨前体细胞。控制细胞密度铺板后装载检测活性氧的２，７－双乙酸二氯 荧光素（ＤＣＦＨ・ＤＡ）荧光探针，分别检测阴性对照组（只加 —ＭＥＭ培养基）、阳性对照组（ＲＯＳｕｐ）、核因子Ｋ Ｂ受体活化因子配 体（ＲＡＮＫＬ）组（１００ｎｇ／ｍｌＲＡＮＫＬ）和Ｎ一乙酰左旋半胱氨酸（ＮＡＣ）组（１ＯＯｎＩｇ／ｍｌＲＡＮＫＬ＋１ｍＭＮＡＣ）破骨细胞的活性氧水平。 检测方法包括使用荧光显微镜观察不同组的荧光强度并对阳性细胞计数统计和使用流式细胞仪检测不同组的荧光强度并对 Ｍｅａｎ ＦＬ１一Ａ定量分析。结果 阴性对照组与阳性对照组比较，定性的荧光照片和阳性细胞计数统计，与定量的流式细胞术统 计图和Ｍｅａｎ ＦＬ１一Ａ统计分析，都显示阳性对照组的细胞内活性氧水平远高于阴性对照组（Ｐ＜０．００１和Ｐ＜０．００１）。同时， ＲＡＮＫＬ组的活性氧水平高于阴性对照组（Ｐ＜０．０５和Ｐ＜０．Ｏ１），而ＮＡＣ组的水平较ＲＡＮＫＬ组为低（Ｐ＜０．００１和Ｐ＜ ０．００１）。结论定性观察方法与定量检测方法结果均有效并且高度一致。两种方法的综合使用可以直观准确地检测破骨细 胞内的活性氧。使用该方法可验证破骨细胞分化过程中活性氧的增加，并且ＮＡＣ可抑制此变化。 关键词：骨质疏松；破骨细胞；活性氧；检测方法
ＩｎＶｅｓｔｉｇａｔｉＯｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＯＳ ｉｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ ＳＨＩ Ｊｕｎ，ＹＡＮＧ Ｌｉｕ，ＨＵＡＮＧ Ｑｉａｎｇ，ＬＩＵ Ｊｉａｎ，ＬＵＯ Ｚｈｕｏｊｉｎｇ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，Ｘｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｎ ７１００３２，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＬＵＯ Ｚｈｕｏｊｉｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ＲＯＳ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ，ａｎｄ ｔｏ ａｐｐｌｙ ｉｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＲＯＳ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＲＡＷ２６４．７ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｓ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．ＲＯＳ ｐｒｏｂｅ ｗｉｔｈ ＤＣＦＨ－ＣＡ ｗａｓ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＯＳ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ —ＭＥＭ ｏｎｌｙ），ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（ＲＯＳｕｐ），ＲＡＮＫＬ ｇｒｏｕｐ（１００ ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬ），ａｎｄ ＮＡＣ ｇｒｏｕｐ（１００ ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬ＋１ ｍＭ ＮＡＣ）．ＲＯＳ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｅｄ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＯＳ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎ ＦＬ１一Ａ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＲＯＳ ｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．００１，Ｐ＜０．００１）．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ＲＯＳ ｉｎ ＲＡＮＫＬ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），ａｎｄ ＲＯＳ ｉｎ ＮＡＣ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ＲＡＮＫＬ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜ ０．００１，Ｐ＜０．００１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｔｈ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ＲＯＳ ａｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ａｃｃｏｒｄａｎｔ．ＲＯＳ ｍａｙ ｂｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ａｎｄ ｉｎｔｕｉｔｉｖｅｌｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈａｔ ＲＯＳ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｏｓｔｅ０ｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ＮＡＣ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ；Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ；ＲＯＳ；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
骨质疏松是一种全身代谢性骨病，具有骨量降 低，骨强度下降和骨微结构受损等多种病理特 征…。其本质是骨稳态的紊乱。骨的稳态，是一个 由骨吸收和骨形成共同维持的动态平衡 。在这 基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（２０１１ＣＢ９６４７０３） 通讯作者：罗卓荆，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 个过程中，唯一负责骨吸收的破骨细胞起着核心作 用 。在骨质疏松的病理过程中，骨吸收的活动强 度超过了成骨细胞主导的骨形成强度 。所以，关 于破骨细胞分化形成和功能的研究对于骨质疏松的 发病机制的阐释不可或缺。 核因子Ｋ Ｂ受体活化因子配体（ＲＡＮＫＬ）是破 骨细胞分化过程中的核心分子。其与破骨前体细胞 ５２０ 中国骨质疏松杂志２０１５年５月第２１卷第５期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ，Ｍａｙ ２０１５，Ｖｏｌ ２１，Ｎｏ．５ 细胞膜上的受体ＲＡＮＫ结合，可使细胞内的活性氧 （ＲＯＳ）增多。ＲＯＳ与破骨细胞的分化密切相关 。 但是，细胞内的活性氧变化迅速，不易检测。所以， 使用准确且直观的方法来测定破骨细胞内的ＲＯＳ 有着重要意义。目前有研究更多着眼于破骨细胞内 氧化应激过程中相关蛋白的变化，而规避直接检测 细胞内ＲＯＳ。。 。有研究采取定性观察ＲＯＳ的方法， 比较直观，但是缺乏对相应干预的总体ＲＯＳ水平的 整体了解 。也有研究定量检测了ＲＯＳ的水平，比 较准确，但是数据晦涩枯燥，不易使读者理解 。 有鉴于此，我们利用２，７．双乙酸二氯荧光素（ＤＣＦＨ． ＤＡ）荧光探针，将定性观察和定量检测有机结合，更 加准确、直观地反映破骨细胞内ＲＯＳ的水平。同 时，我们以此方法确证了破骨细胞分化过程中的 ＲＯＳ变化。 １材料与方法 １．１实验材料 所用培养基，包括ＲＰＭＩ．１６４０培养基和 ．ＭＥＭ 培养基，还有胎牛血清（ＦＢＳ）均购自美国ＧＩＢＣＯ公 司。青．链霉素购自中国Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司。ＲＡＷ２６４．７ 破骨细胞系购自美国ＡＴＣＣ公司（产品号：ＣＲＬ． ２２７８），重组小鼠可溶性ＲＡＮＫＬ蛋白购自美国Ｃａｌｉ． Ｂｉｏ公司。Ｎ一乙酰左旋半胱氨酸（ＮＡＣ）购自美国 Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司。所有培养瓶、培养板等耗材购 自丹麦Ｎｕｎｃ公司。活性氧检测试剂盒购自中国碧 云天生物公司。 １．２方法 １．２．１ ＲＡＷ２６４．７破骨细胞系培养：使用ＲＰＭＩ． １６４０（含１０％ＦＢＳ）培养ＲＡＷ２６４．７细胞系，环境 条件为３７ ｏＣ、５％ＣＯ：，每２天换液一次。用 ０．２５％ＥＤＴＡ胰酶消化Ｐ７代ＲＡＷ２６４．７细胞， １ ２００ ｒ／ｒａｉｎ离心８ ｍｉｎ，弃上清液。用ＰＢＳ重悬， 清洗后１ ２００ ｒ／ｍｉｎ离心８ ｍｉｎ，弃上清液。用 一 ＭＥＭ培养基（含１０％ＦＢＳ）重悬，调整细胞浓度至４ Ｘ １０ 个／ｍｌ，将细胞接种至十二孔细胞培养板中， 每孑Ｌ Ｉ．５ ｍ１。置于细胞培养箱中培养，３７℃、５％ ＣＯ 、饱和湿度培养。１ ｄ后换液，分别换为０【．ＭＥＭ 培养基（含１０％ＦＢＳ），加入ＲＡＮＫＬ（１００ ｎｇ／ｍ１）的 仅一ＭＥＭ培养基（含１０％ＦＢＳ），加入ＲＡＮＫＬ（１００ ｎｇ／ｍ１）和ＮＡＣ（１ ｍＭ）的 一ＭＥＭ培养基（含１０％ ＦＢＳ），培养６ ｈ。阳性对照孔暂时不换液。 １．２．２装载ＲＯＳ探针：按照试剂盒的要求原位装 载探针。用仅．ＭＥＭ培养基（无ＦＢＳ）以１：１ ０００的 比例稀释ＤＣＦＨ．ＤＡ，使终浓度达到１０ Ｍ。去除细 胞培养液，加入１ｍｌ稀释后的ＤＣＦＨ－ＤＡ。置于３７ ℃、５％ＣＯ 、饱和湿度细胞培养箱内，孵育２０ ｍｉｎ。 孵育完成后，用仅．ＭＥＭ培养基（无ＦＢＳ）洗涤细胞 三次，以充分去除未进人细胞内的ＤＣＦＨ ＤＡ，防止 液体荧光强度本底过高。 ＲＯＳｕｐ是一种混合物，浓度为５０ ｍｇ／ｍｌ。其在 刺激细胞２０～３０ ｍｉｎ后可以显著提高活性氧水平， 可作为阳性对照使用。探针装载后，以１：１ ０００的比 例稀释ＲＯＳｕｐ，加入阳性对照孔。３０ ｍｉｎ后用０【一 ＭＥＭ培养基（无ＦＢＳ）洗涤细胞三次。 阴性对照组（只加 ．ＭＥＭ培养基）、阳性对照 组（ＲＯＳｕｐ）和实验干预组全部干预和装载探针结束 后，可以进行细胞内ＲＯＳ的定性和定量的观察。 １．２．３荧光显微镜观察分析细胞内ＲＯＳ：装载探针 后，使用Ｚｅｉｓｓ荧光显微镜观察各组的荧光强度。放 大２００倍，每组随机观察５个视野，计数其中的阳性 细胞数。 １．２．４ 流式细胞仪观察分析细胞内ＲＯＳ：装载探针 后，用细胞刮将细胞刮起收集，使用Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６流式 细胞仪检测各组荧光强度，即细胞内ＲＯＳ的强度， 并使用ＣＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ软件进行分析。各组细胞内ＲＯＳ 的强度如结果图中所示。平均ＦＬ１－Ａ量（Ｍｅａｎ ＦＬ１． Ａ）可作为ＲＯＳ强度的定量依据。 １．３统计学分析 所有数据均按照均值±方差表达，并且每个 值均是三次独立重复实验的最小值。方差分析等统 计学分析使用统计学软件ＳＰＳＳ １９得出。｜Ｐ值＜ ０．０５表示有统计学意义。
