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TUNEL细胞凋亡检测程序（Promega公司）一、原理与意义：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺（DAB）产生深棕色反应，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂1.器材：光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。
2.试剂：试剂盒含TdT 2×、Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×；3.自备试剂：1)1×PBS（pH 7.4，2.5L＝20.0157g 137mM NaCl＋0.499552g 2.68mM KCl＋0.50013075g 1.47mM KH2PO4＋7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；2)0.85％NaCl 500 ml＝4.25 g Nacl＋500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；3)4％多聚甲醛500 ml＝20 g多聚甲醛＋500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。
In situ cell death detection kit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）把荧光素（fluorescein）标记的dUTP（三磷酸脱氧尿甘）连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，HRP又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
■1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。
检测晚期凋亡.基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让和标记地进入细胞内，在地辅助下与核断裂地’结合，再用标记地链霉亲和素与上结合（每个链霉亲和素至少可以再结合个分子），最后用、过氧化氢与上地辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中阳性细胞地比例来判断细胞凋亡发生情况.罗氏试剂盒一、试剂、酶浓缩溶液×μ——末端脱氧核糖核酸转移酶（×）试剂、标记溶液×μ——含有核苷酸混合液地反应液（×）试剂、转化剂——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后℃保存）二、所需地溶液和仪器（）、配制、、饭盒、吹风机、甲醇溶液、、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）, 充分脱蜡和水化.脱蜡可以先度，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗次共、、、、乙醇浸洗×；②过氧化氢甲醇中浸洗，抑制内源性过氧化氢酶.③用蛋白酶（μ溶于中，）室温孵育分钟.④洗约*次，擦干样品周围地水.此阶段配制反应混合物——从试剂中取出μ标记溶液作为两个阴性对照；将试剂中取μ试剂中μ标记液中，配成μ 反应混合物混匀（即配即用，℃避光！）⑤标记反应：滴加μ地反应混合液，在湿盒中℃孵育分钟（为防蒸发和保证反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果.⑥信号转化和分析：擦干样品周围地水分，加入转化剂，湿盒中℃孵育分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次⑦加入μ 底物溶液，室温（℃）孵育，洗*次.（苏木素染秒，以免视野全染，需要摸索条件）⑧中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果.•稳定性：反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好地此液体必须将放入冰浴中.个人收集整理勿做商业用途、转化剂（即用型）：一旦融化此液体，需在℃保存（最多保存个月），并且不能反复冻存. 蛋白酶一般工作液浓度为,但浓缩液可配制，可用配制，也可用蛋白酶缓冲液（）；注意：)蛋白酶可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（）,所以要最优化孵育时间长短.时间一般为，左右地片子可以用，但左右地可用，最终通过摸索最佳时间.过长易脱片、过短起不到通透效果.)对于比较困难地组织，可以选用地枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），需修复)对照：阴性对照：经过固定和通透地细胞样品加入μ试剂以代替反应混合物，从标记步骤以下同上.阳性对照：经过固定和通透地细胞样品用细球菌地核酸酶或使之产生链缺口，从标记步骤以下同上.)操作流程：常规脱蜡、脱水处理——冲洗样品——滴加反应混合物，℃孵育分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观察分析——滴加转化剂，℃孵育分钟——洗样品——滴加底物溶液，室温孵育分钟——光镜下分析结果)假阳性多地原因有很多：封闭不全、显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强浸洗)显色时间:（）显色时间不是固定地，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深地棕褐色，这很可能说明你地抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你地抗体孵育时间；（）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面地封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你地抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗度过夜）；另一方面就是封闭时间过长.)脱片产生地原因和如何防止脱片:（）多聚赖氨酸玻片质量地问题.我原先是买地，迈新按说也是不错地，可是都脱成什么样子了.后面补做第二批时用地病理科老师自己做地片子，要好一点.（）组织切地不好，切片机地问题例如比较老地旧地机器切地厚或者不均匀，或者切片者手法不好等.（）组织地问题，越是有坏死之类越容易脱.（）没烤好，时间短温度不够之类.（）操作地时候甩地太猛了，有脱片嫌疑地片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水.（）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用地时候尽量用泡地，不要冲.个人收集整理勿做商业用途。
TUNEL 法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体 DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体 DNA 首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为 50-300kb 的大片段。
然后大约 30 ﹪的染色体 DNA 在 Ca ²+和 Mg²+依赖的核酸内切酶作用下, 在核小体单位之间被随机切断, 形成 180~200bp 核小体 DNA 多聚体。
DNA 双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列 DNA 的3’ -OH 末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT 的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的3’ -末端,从而可进行凋亡细胞的检测, 这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL 。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂,因而没有3’ -OH 形成,很少能够被染色。
低分子量的DNA 分离后,也可使用 DNA 聚合酶进行缺口翻译(nick translation ,使低分子量的DNA 标记或染色,然后分析凋亡细胞。
TUNEL 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征, 可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定, 并可检测出极少量的凋亡细胞, 灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
一、过氧化物酶标记测定法原理:脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛 [(digoxigenin -11-dUTP]在 TdT 酶的作用下, 可以掺入到凋亡细胞双链或单链 DNA 的 3-OH 末端, 与 dATP 形成异多聚体, 并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合。
在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应, 特异准确的定位出正在凋亡的细胞, 因而可在普通光学显微镜下进行观察。
TUNEL 细胞凋亡检测
1.二甲苯中脱蜡5-10分钟，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟，无水乙醇5分钟，
90%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
2.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K（用pH7.4~8.0 10mM Tris），20-37℃作用15-30
分钟（不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索），用PBS洗涤3次（注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
）。
3.标记液准备：从标记液中取100μl作为两个阴性对照，然后将TdT酶溶液（50μl）
加入到剩下的标记液（450μl）中，混匀。
4.样品的标记：在样品上加50μl 生物素标记液，37℃避光孵育60分钟（注意：孵
育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少标记液的蒸发）。
5.用PBS洗涤3次。
6.Mounting media 封片观察染色情况。
1.将细胞爬片在空气中风干，加入4% PFA 室温固定1h，PBS清洗3次。
2.破膜液（0.1% Triton X-100 in 0.1% 柠檬酸钠）4℃破膜2min，PBS清洗三次。
3.标记液准备：从标记液中取100μl作为两个阴性对照，然后将TdT酶溶液（50μl）
加入到剩下的标记液（450μl）中，混匀。
4.DNAase 处理阳性对照片，PBS洗涤三次。
5.样品的标记：在样品上加50μl 荧光标记液，37℃避光孵育60分钟（注意：孵育
时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少标记液的蒸发）。
6.用PBS洗涤3次。
7.Mounting media 封片观察染色情况。
tunel 染色原理
引言概述：
Tunel染色是一种常用的细胞学技术，用于检测细胞凋亡。
通过检测DNA断裂末端的3'-OH基团，Tunel染色可以准确地识别凋亡细胞，并在细胞核内形成明亮的荧光信号。
本文将详细介绍Tunel染色的原理，包括染色步骤、染色反应的机理、染色结果的解读以及其在研究中的应用。
正文内容：
1. Tunel染色的步骤
1.1 细胞固定和透化
1.2 凋亡诱导
1.3 染色反应
1.4 洗涤和封片
1.5 观察和分析
2. Tunel染色的机理
2.1 DNA断裂
2.2 TdT酶介导的标记
2.3 荧光探针的结合
2.4 染色信号的放大
2.5 荧光显微镜观察
3. Tunel染色结果的解读
3.1 正常细胞
3.2 凋亡细胞
3.3 背景噪声
3.4 阳性对照和阴性对照
3.5 图像分析和数据统计
4. Tunel染色在研究中的应用
4.1 细胞凋亡机制研究
4.2 肿瘤治疗效果评估
4.3 神经退行性疾病研究
4.4 肝脏损伤评估
4.5 胚胎发育研究
总结：
Tunel染色是一种可靠而广泛应用的细胞学技术，通过检测细胞凋亡的DNA断裂末端，可以准确地识别凋亡细胞。
在实验中，正确的染色步骤和机理的理解对于获得准确的结果至关重要。
Tunel染色在细胞凋亡机制研究、肿瘤治疗效果评估、神经退行性疾病研究、肝脏损伤评估以及胚胎发育研究等领域都具有重要的应用价值。
通过深入了解和熟练掌握Tunel染色的原理和操作技巧，我们可以更好地应用这一技术来推动相关领域的研究进展。
TUNEL说明书1 介绍TUNEL是提供单细胞水平细胞凋亡的稳定系统，能够迅速、快捷、精确的检测出凋亡细胞。
该试剂盒可以通过测定核DNA片段检测组织切片和培养细胞的凋亡细胞。
多数高等真核生物的细胞都通过启动自身的细胞自杀程序实现程序性死亡或细胞凋亡。
凋亡在发育、内环境稳定和一些疾病中具有重要作用。
凋亡具有某些特定的形态学特征，包括细胞膜起泡，细胞核和细胞质固缩，染色质浓缩，并且不发生局部炎症反应。
细胞死亡与此相反，它的特点是细胞肿胀，染色质絮凝，细胞膜完整性破坏，细胞溶解和产生及局部炎症反应。
凋亡过程中，内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶被激活，DNA被降解而形成末端为3’－OH、含180～200碱基对的不同倍数的核苷酸片段。
TUNEL 可用于多种细胞凋亡的检测，已经经过验证的应用范围: Vibratome® 神经组织切片, Jurkat 细胞, HL-60细胞这本技术小册子包括检测组织切片和茴香霉素诱导的HL-60细胞的细胞凋亡。
检测原理: DeadEnd™ Colorimetric TUNEL 系统使用改良的TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)对凋亡细胞的断裂DNA进行末端标记。
使用末端脱氧核苷转移酶(TdT)将生物素标记的核苷被掺入到DNA的3′-OH末端。
然后，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin HRP)结合在上述生物素标记的核苷上，可以通过过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)检测到。
用这种程序，凋亡细胞的核被染成深棕色。
2 产品内容G7361平衡缓冲液（G327B）——4.8ml末端脱氧核苷酰酶酸转移酶（M828B）——20ul抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶（G714A）——40ul生物素化的核苷混合物（G715A）——20ul蛋白酶K（V302A）——10mgG7362塑料盖玻片（G326B）——2020X SSC（G329B）——20mlDAB 20X 色原体（G716A）——200ul20X DAB底物缓冲液（G717A）——200ul20X过氧化氢（G718A）——200ul储存条件: 将平衡缓冲液, TdT酶, 生物素标记的核苷混合物和蛋白酶K 储存于–20°C。
罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
细胞凋亡检测之Tunel法的实验步骤如今，细胞凋亡检测是目前非常热门的研究方向，它不仅可以用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究，还能应用于临床诊疗、新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及肿瘤的基因治疗等，对于相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价也具有举足轻重的地位。
目前研究组织体内细胞凋亡最广泛的方法是什么呢?无疑是——Tunel 法，它不仅能检测早期基因组的断裂，还能能通过标记的多少，进行半定量研究。
首先，我们先来看一下细胞凋亡和细胞坏死的区别：Tunel法应用Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
Tunel法详细的实验步骤1. 常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5min;2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min;3. PBS漂洗2次;用Proteinase K工作液(20ug/ml)处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;4. 加入含2%过氧化氢的PBS，室温反应5min，PBS漂洗2次5. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
6. 玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
7. 加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30min，PBS 漂洗3次;8. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm);9. 玻片干后加50μl DIG-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
