探究铁皮石斛原球茎的生长和分化

铁皮石斛的茎段快繁的种植技术铁皮石斛是兰科石斛属多年生附生草本植物，因其茎节处呈黑褐色，又名黑节草，具有益胃生津、滋阴清热、清咽利嗓，提高人体免疫能力、抗肿瘤、抗衰老等功效，主要分布于云南广南、邱北、马关、文山及怒江与恩梅开江的分水岭一带，海拔1600米以下，以及江南各省。

多附生在亚热带人迹罕至的深山密林阴湿悬崖峭壁处、树上或长青苔的岩石上。

铁皮石斛的种子极小、无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培；而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为的过度采挖和破坏生态环境，其资源已濒临灭绝，因而被国家列为重点维护的药用植物之一，铁皮石斛组织培养快速繁殖被国内外学者广泛关注。

铁皮石斛的茎段快繁直接取材于幼嫩茎段，具有取材易、速度快、污染率低、繁殖系数高等优点，可在短期内为生产提供大量栽培用苗，因而能有效维护这一宝贵资源。

1、外植体的消毒。

石斛茎段在无菌操作台上用75％的酒精进行外表消毒，去掉灰尘，再用0.1％的升汞灭菌58分钟，用无菌水冲洗3次，此过程中应不时摇晃烧杯，使其充分灭菌。

2、试验过程。

将已经灭菌的石斛茎段，无菌条件下切成至少带有一个茎节的茎段，接种于诱导培养基中诱导出芽，将芽再诱导出原球茎，原球茎再分化，再壮苗，便可将生长健壮的植株移栽。

3。

培养基基本培养基为N6附加0.75％琼脂，3％白糖，PH值为5.8培养基进行惯例高温高压灭菌，温度为121℃，1.1Mpa15分钟即可。

激素添加如下①诱导茎节发芽：N6＋BA 2.5毫克／升；②诱导芽形成原球茎：N6＋BA 2.5毫克／升＋IBA 0.5毫克／升；③诱导原球茎分化为植株：N6+BA1.5毫克／升+NA A 1.2毫克／升＋香蕉汁5％；④生根壮苗培养：N6+NA A2.5毫克／升+土豆汁10％。

或基本培养基为MS附加0.75％琼脂，3％白糖，pH5.81芽增殖培养基：MS＋NA A 0.10.5毫克／升＋BA 0.52.0毫克／升；2壮苗培养基：MS无激素培养基；3生根培养基：1/2MS+IBA 0.1毫克／升。

铁皮石斛种胚萌发和原球茎质量控制
张铭;朱峰;魏小勇;罗紫娟
【期刊名称】《浙江大学学报（理学版）》
【年(卷),期】2000(27)1
【摘要】本文讨论了植物生长素对铁皮石斛种胚萌发和ＡＢＡ对原球茎质量的影响，实验结果表明ＮＡＡ在０．０５－２．０＊１０＾－６范围内都能促进种胚萌发，而２，４－Ｄ促进种胚萌发的浓度范围很窄，仅在浓度为０．５＊１０＾－６时能促进种胚萌发；０．５＊１０＾－６ＡＢＡ则能显著促进原球茎的生长及其质量的提高。

【总页数】1页(P92)
【作者】张铭;朱峰;魏小勇;罗紫娟
【作者单位】浙江大学西溪校区生命科学学院;杭州赛狮生物技术公司
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.718.4
【相关文献】
1.铁皮石斛兰种子萌发及其原球茎的快繁培养条件研究 [J], 宋顺;许奕;林妃;黄东梅;李羽佳;李艳霞;李敬阳
2.黑节铁皮石斛原球茎诱导、再分化以及腋芽萌发和生根的初步研究 [J], 李丹;王馨彩;尹明华
3.印度梨形孢对铁皮石斛种子萌发和原球茎生长的影响 [J], 许凤来;朱志炎;何勇;田志宏
4.印度梨形孢对铁皮石斛种子萌发和原球茎生长的影响 [J], 许凤来;朱志炎;何勇;田志宏
5.^(137)Cs γ射线辐照对铁皮石斛种胚原球茎的诱变研究 [J], 詹忠根;徐程;席玙芳
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铁皮石斛组织培养方案报告一、实验目的了解铁皮石斛培养的方法和步骤，熟练掌握外植体的取材、消毒、接种、初代培养的操作过程。

二、实验器材超净工作台、高压灭菌锅、电磁炉、长镊子、培养皿、酒精灯、接种工具、烧杯、玻璃棒、移液管、培养箱、剪刀、培养瓶等。

三、实验步骤配方：根据不同阶段，培养基配方有所差异。

如表110%香蕉（w/w）+MS +3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/L NAA1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀；4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2ml NAA（0.1mg/ml），混合均匀；5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。

分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。

注意事项：①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ的顺序；③煮沸时，小心溶液溢出；④分装时不要污染培养瓶瓶口。

灭菌：1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；3）打开电源和排气阀，调节电压至220V；4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min；6）关闭电源，使之自动降温至0℃。

10min后，打开排气阀和锅盖；7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。

表2 灭菌时间统计注意事项：①启动灭菌前，应检查水位、电源、排气阀、安全阀、排气管等，确保正常；②灭菌锅底部应铺垫一层报纸，以防培养瓶机械破损；③灭菌电压不宜超过220V，否则灭菌锅会剧烈摇晃，造成不必要的损害和安全隐患；④当温度达到121℃后，调节电压至135V，并且时不时注意温度的变化，确保温度介于121-122℃之间；⑤气压降至0后，不宜立即揭盖；最好在5-10min后揭盖，这样才能缓和内外“气压和温度差”；⑥揭盖5-10min后，再转移锅内培养基，以免烫伤。

铁皮石斛生长过程组培部分：在进行组培前，首先我们要进行选种，选种的时候要挑选石斛粗壮，长度在20CM到25CM 左右的石斛作为授粉接代。

授粉的的花经过6个月左右的生长发育成成熟的种子。

接下来就要采收种子进行播种。

开始组培过程的第一步，播种时间一般在当年的11月左右，播种的时候需要将种子的一头剪开一个小口子，然后轻轻的往组培瓶里面撒种子。

已经进入组培瓶的种子要经过3个月左右的生长会成长成为绿豆大小的圆球茎。

第二部就是对圆球茎进行分散，那么我们就需要进行转瓶进行分散圆球茎，一瓶圆球茎分散成多瓶圆球茎。

之后圆球茎生长3个月左右就会发出很嫩的石斛苗，一般有3片左右的小叶子。

接着就要开始第三次的转瓶了，把这些小苗再分散到新的组培瓶里面，这次要分布的均匀，不能有堆集情况的出现，尽量分散，分布合理。

同样的这次的转瓶后也需要3个月的左右的生长，待小苗长到有3厘米左右的高度时我们又要进行第四次转瓶，第四次转瓶的时候要求要更加的严格，每一瓶的数量都要进行控制，要选择生长的粗壮的优秀苗进行转瓶，这一次也是在决定成熟的石斛的品质。

选好了之后在组培室继续生长3个月左右。

等这次石斛苗成长到5-6CM高的时候就要进行最后一次转瓶了，这次跟上次一样需要对石斛苗进行筛选，在上一次筛选了的情况下再次筛选出更加优秀的石斛苗进行转瓶。

这一次需要的生长时间要长一些，需要在组培瓶里面生长到4月份左右。

经过了1年多生长的石斛终于完成了从种子到强壮的石斛苗的脱变。

苗子长大了肯定就需要种植了，但是不能直接进入种植状态，因为在温室里面生长出来，它还没有经过大自然的风吹雨打就像襁褓中的婴儿一样，需要适应温室外的气候。

那么我们在这个时候会关掉组培室所有的设备。

打开窗户，从室内开始让石斛苗适应自然气候，在室内经过7到10天的锻炼后就要把石斛苗运出组培室，进入专门的大棚进行更加直接的适应。

这个时间一般也需要10到15天。

在这一步之后，在揭开瓶盖，练苗3天左右的时间，在经过这样的锻炼后，石斛苗就基本已经适应了外界的气候。

铁皮石斛原球茎的增殖培养研究
王丽斌;孔祥莹;戈振扬
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2009(037)011
【摘要】为探索最适宜铁皮石斛原球茎增殖的固体培养基配方,以获得高质量的组培苗,为工厂化育苗提供技术支撑,在相同的实验室培养条件下,把同一阶段的原球茎接种于不同激素比的4种培养基中,培养周期为60 d,每隔15 d取样检测1次,对不同生长状况的试验结果进行分析研究.结果表明,在基本培养基1/2 MS中加入浓度为1.0 mg/L的6-BA、0.5 mg/L的NAA和浓度为20%的马铃薯提取液进行固体培养,铁皮石斛原球茎的增殖效果好.
【总页数】3页(P27-29)
【作者】王丽斌;孔祥莹;戈振扬
【作者单位】昆明理工大学,现代农业工程学院,云南,昆明,650224;昆明理工大学,现代农业工程学院,云南,昆明,650224;昆明理工大学,现代农业工程学院,云南,昆明,650224
【正文语种】中文
【中图分类】S567.23~+9
【相关文献】
1.铁皮石斛原球茎增殖培养基配方的优化 [J], 戴传云;刘腾飞;管天冰;刘万宏
2.浅析铁皮石斛原球茎增殖培养基配方的优化 [J],
3.沼肥对铁皮石斛原球茎增殖培养的影响 [J], 李思梅;苏有勇;李关艳;廖小华;李珍;马汶绢
4.铁皮石斛与铁皮石斛原球茎质量比较的研究进展 [J], 韦丽文;辛宁;李培泰;时显芸
5.铁皮石斛种子、原球茎和类原球茎体的超低温保存研究 [J], 王君晖;张毅翔;刘峰;黄纯农;葛霁光
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铁皮石斛圆球茎增殖影响因素的研究孙丹;朴炫春;郑艳艳;李美兰;廉美兰【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2010(038)032【摘要】[目的]探讨培养基的不同组成对铁皮石斛圆球茎增殖的效果及影响,为提高其组培种苗的商业化生产效率提供技术参考.[方法]以无菌播种获得的铁皮石斛圆球茎为材料,对影响铁皮石斛圆球茎增殖的几种因素进行了研究.[结果]铁皮石斛圆球茎在1/2 MS培养基中增殖效果较好;在1/2 MS+NAA 0.5 mg/L培养基中加入BA 2.0 mg/L可促进铁皮石斛圆球茎增殖;培养基中加入天然物质有利于铁皮石斛圆球茎的增殖生长,以加入椰子汁100 ml/L为最佳.[结论]铁皮石斛圆球茎在1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+BA 2.0 mg/L+椰子汁100 ml/L培养基上增殖效果最佳,增殖系数达到4.8.【总页数】2页(P18150-18151)【作者】孙丹;朴炫春;郑艳艳;李美兰;廉美兰【作者单位】延边大学农学院园艺系,吉林龙井,133400;延边大学农学院园艺系,吉林龙井,133400;延边大学农学院园艺系,吉林龙井,133400;延边大学农学院园艺系,吉林龙井,133400;延边大学农学院园艺系,吉林龙井,133400【正文语种】中文【中图分类】S567【相关文献】1.铁皮石斛原球茎的增殖培养研究 [J], 王丽斌;孔祥莹;戈振扬2.铁皮石斛类原球茎增殖和分化的研究 [J], 林丛发;钟爱清;林云斌;陈芦根3.液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导、增殖的研究 [J], 苏钛;张晓南4.铁皮石斛原球茎增殖条件的研究 [J], 莫昭展;贝学军5.铁皮石斛原球茎诱导与增殖研究 [J], 王丽萍;梁淑云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长及次生代谢产物的影响铁皮石斛Dendrobium candidum Wall．Ex Lindl是《中华人民共和国药典》收载的5种石斛属植物之一，是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种，有着极高的药用价值。

近年来，由于过度采挖和生境的破坏，铁皮石斛的自然资源已濒临枯竭。

而铁皮石斛独特的生理和生态学特点，又使其目前的人工栽培技术还不够成熟，难以实现大面积栽培。

如何能够在保护铁皮石斛自然资源的前提下充分利用它为人类的健康保护事业作出贡献，成为目前一个急待解决的问题。

根据该植物与真菌形成菌根的特点，本论文对铁皮石斛原球茎与小菇属真菌MF24（Mycenasp．）诱导子的相互作用进行了系统研究；对MF24诱导子处理铁皮石斛原球茎、对照铁皮石斛原球茎、铁皮石斛原药材和金钗石斛原药材的化学成分进行了分析比较；对诱导子处理的铁皮石斛原球茎的次生代谢产物进行了研究：并以分离得到的铁皮石斛原球茎中的化学成分为标准，应用HPLC法分析了诱导子处理对原球茎中这些成分含量的影响，为解决铁皮石斛资源紧缺问题开辟新途径。

一、获得了真菌诱导子在铁皮石斛原球茎培养中的最佳工艺首次以来源于铁皮石斛的小菇属内生真菌MF24（Mycena sp．）为诱导子，对铁皮石斛原球茎与诱导子在固体培养基上相互作用过程中诱导子的处理方法、使用剂量、加入时间及与原球茎作用时间等因素对原球茎生长及次生代谢产物的影响进行了系统研究，获得二者相互作用的最佳工艺为：以MF24菌麦麸液体培养基摇床发酵培养的发酵液为诱导子，以250mL·L^-1(诱导子·培养基^-1)的剂量加入以1／2MS土豆固体培养基光照培养16周的铁皮石斛原球茎中，继续培养6周后收获。

与单独培养的原球茎相比，在此条件下培养的原球茎鲜重提高了50％，干重提高了28％，总生物碱含量提高了12％。

铁皮石斛体细胞胚胎发生研究本文以铁皮石斛原球茎为材料，在愈伤组织诱导及植株再生、体细胞胚胎发生的形态学过程、体胚发生过程中同工酶的变化以及体胚发生过程中的基因表达四个方面进行了研究，主要实验结果如下：1．以已分化出两片幼叶的原球茎为外植体，建立了通过愈伤组织的植株再生体系，探讨了不同外源激素对外植体出愈及愈伤组织分化的影响。

将外植体培养在附加2.0 mg l^-16-BA的1／2MS培养基上出愈率可达82％，继代2次后的愈伤组织在不添加外源激素的1／2MS基本培养基上能够很好地实现类原球茎再生，当类原球茎进一步培养在添加0.2 mg l^-1NAA的1／2MS培养基上可发育形成幼苗，将再生植株炼苗后移栽到蛭石中，成活率可达95％。

2．通过石蜡切片技术，以处于不同分化阶段的愈伤组织为材料，研究了体细胞胚胎发生的细胞学过程。

结果表明体胚既可起源于愈伤组织的表层，又可起源于愈伤组织内层的单个胚性细胞。

内起源体胚的早期胚胎发生过程与铁皮石斛体内胚胎发育过程相一致，主要经单细胞胚、二细胞胚、四细胞胚、五细胞胚以及球形胚；球形胚以后的发育过程与铁皮石斛种子体外萌发所经历的过程相一致，主要经球形胚、心形原球茎、子叶原球茎直至成苗。

3．在上述实验体系之上，以不同发育时期含体胚的愈伤组织为材料，进行了过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、酶酯、苹果酸脱氢酶、淀粉酶、乙醇脱氢酶的同工酶及过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶三种抗氧化酶的活性研究，结果表明这些酶在体胚发生过程中呈现一定的规律性变化，酯酶、细胞色素氧化酶、乙醇脱氢酶同工酶在心形原球茎期都出现新的特异性条带，而苹果酸脱氢酶同工酶中的一条酶带在心形原球茎时期消失；三种抗氧化酶活性都在单细胞体胚发生时期达到峰值。

4．在铁皮石斛体胚发生基础之上，用RT-PCR技术在体胚发生过程中检测到与胚胎发育相关的TIM和CUC基因，通过3’-RACE和5’-RACE获得了TIM和CUC mRNA序列，并初步对TIM和CUC进行了序列分析。