新生BALB／c小鼠大脑皮质神经元细胞培养方法的建立

神经元细胞培养1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。

2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。

4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。

重复上述步骤2～3 次。

5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。

6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。

7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。

(1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。

（+0.5mmol/L谷氨酰胺）鉴定1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常明显。

2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。

这就更能支持2的阳性表达了。

4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！错误之处还请赐教！TUJ1。

神经元原代培养_
神经元原代培养
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。

孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。

剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。

皮质碎片移到有0.025%胰酶的H BSS-2液中37°C消化15分钟。

胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/ mL庆大霉素）。

以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2湿温培养箱里进行培养。

每3天用吸管换液，一次换0.5mL。

体外培养8天细胞就能用于实验。

选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎组织的细胞连接还很少。

因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易发生损伤。

另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。

如果用的是乳鼠，一般是在培养36个小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。

另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、8天的、18天的细胞。

其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年的不同效应。

胚鼠大脑皮层神经元培养方法的改进
李红;陈晓蓉;赵正梅;思盼盼;张金秋;汤俊峰
【期刊名称】《四川解剖学杂志》
【年(卷),期】2009(017)002
【摘要】目的建立一种简单、高效的胚鼠大脑皮层神经元原代培养的方法 .方法17 d胎鼠大脑皮质,直接机械切碎后经200目滤网研磨过滤,得到细胞悬液进行培养.结果神经元生长良好,相邻细胞的突起交错形成网络,鉴定神经元纯度为(94.7±5.6)%.结论本方法简单可行,可以获得高纯度的胚鼠大脑皮层神经元.【总页数】2页(P8-9)
【作者】李红;陈晓蓉;赵正梅;思盼盼;张金秋;汤俊峰
【作者单位】安徽医科大学组织胚胎学教研室,合肥,230032;安徽医科大学组织胚胎学教研室,合肥,230032;安徽医科大学组织胚胎学教研室,合肥,230032;安徽医科大学组织胚胎学教研室,合肥,230032;安徽医科大学组织胚胎学教研室,合
肥,230032;安徽医科大学组织胚胎学教研室,合肥,230032
【正文语种】中文
【中图分类】R813.11
【相关文献】
1.鼠胚脑皮质及海马神经元原代培养方法的改进 [J], 孙海梅;季凤清;赵天德;岳旭;郭崇洁
2.苯丙氨酸对胚鼠大脑皮层神经元Rho GTPases基因表达的影响 [J], 张拥军;张
惠文;顾学范
3.鼠胚脊髓运动神经元原代培养方法的改进 [J], 鄂玲玲;周长满;徐忠涛;王常利;文天秀;苏剑斌
4.胚鼠大脑皮质神经元的最佳分离和培养方法的探讨 [J], 李胜富;毛萌;周晖;李幼平;孙明菡
5.新生大鼠大脑皮层和海马神经元体外培养方法及改进 [J], 付丽娟;苗巍;常彦忠;张宏丽
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新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定【摘要】［目的］探讨新生（spraguedaley,SD）大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况及培养分离，以获得纯化的少突胶质前体细胞，为今后细胞移植治疗研究提供良好的种子细胞。

［方法］出生48hSD大鼠取大脑皮层进行混合胶质细胞的体外培养，原代培养第9～10d时采用水平振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，继续用定向培养基传代培养。

相差显微镜观察少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况，免疫细胞化学技术进行细胞鉴定。

［结果］混合胶质细胞原代培养第9～10d时出现明显的细胞分层，少突胶质前体细胞散布于单层的星形胶质细胞表面，胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极突起，少数呈三极突起。

经振荡分离后少突胶质前体细胞纯度达95％，少突胶质细胞特异性标记lig2反应阳性，胶质纤维酸性蛋白抗体反应阴性。

［结论］新生SD大鼠大脑皮层原代培养中少突胶质前体细胞能够维持在未成熟阶段，细胞分层后通过振荡法及差速贴壁法可以获得较高纯度的少突胶质前体细胞。

【关键词】少突胶质前体细胞;细胞培养；脱髓鞘化；脊髓损伤Keyrds：ligdendrytepreursrell;ellulture;deyelinatin;spinalrdinjury脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤，可以造成患者严重的神经功能损害。

目前，临床上尚无有效办法治疗脊髓损伤。

随着研究深入，人们对于脊髓损伤的病理过程有了更进一步的认识。

脊髓损伤不仅导致神经元丢失，同时还造成大量少突胶质细胞的死亡，从而引起残留神经轴突的脱髓鞘改变，进一步影响了脊髓神经功能的恢复。

近来不少研究显示通过髓鞘形成细胞移植治疗脊髓损伤，有利于脱髓鞘轴突的再髓鞘化，促进损伤脊髓的神经功能恢复［1,2］。

研究表明，少突胶质细胞不仅形成髓鞘包绕轴突，同时它还起着为其他神经细胞提供营养因子、促进轴突生长等作用［3］。

此外，少突胶质前体细胞是处于分化早期阶段的未成熟细胞，既能够定向分化为成熟少突胶质细胞，同时又具有一定的增殖与迁移能力［4］，更加适合于细胞移植治疗。

新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【摘要】目的探讨新生大鼠视皮层神经元的原代培养方法,以获取数量多、纯度高的视皮层神经元.方法取新生1d内的SD大鼠视皮层,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,倒置相差显微镜下计数后种植于6孔培养板内培养.培养24 h后用终浓度10μmol·L-1阿糖胞苷处理,抑制非神经元的生长,作用24h后半量换液,以后每隔1d半量换液1次.每天倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl染色法进行视皮层神经元鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养视皮层神经元的纯度.结果接种4h后,大部分细胞已贴壁,细胞立体感较强；接种后24h,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈多边形或三角形,细胞周围有或多或少的光晕；培养4d后,细胞突起伸长、增粗；培养6～8d后,细胞状态较佳,细胞胞体饱满,光晕明显,突起进一步伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状,非神经元细胞减少,为实验的最佳时间；培养14 d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果显示,原代培养的细胞中,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论本研究获得视皮层神经元的方法简单经济,通过形态学观察、Nissl 染色及免疫荧光染色可以对体外培养的视皮层神经元细胞进行准确鉴定.【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2013(033)008【总页数】3页(P733-735)【关键词】视皮层;神经元;原代培养;大鼠【作者】宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【作者单位】453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453000 河南省新乡市,解放军371医院;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室【正文语种】中文视皮层是视觉系统的高级中枢，培养观察视皮层神经元对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的基础研究具有重要的意义。

星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养
1、取新生24h内的C57BL/6J乳鼠，在超净工作台中用75％乙醇浸泡3～5min消毒，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨，取两侧大脑，体视镜下剥除脑膜，取出大脑皮质置于盛有HBSS液的无菌培养皿内。

2、用预冷的HBSS液漂洗2次，剪碎大脑皮质制成糜状，以0.25％的胰酶液，1:4与不完全培养基混合，37℃消化15min，并用含有10％胎牛血清的DMEM/F12-K完全培养基终止消化，轻轻吹打。

3、800g离心5min，弃上清。

4、用DMEM／F12完全培养基制成单细胞悬液，以70目滤网过滤，吸取细胞悬液接种至预先已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中培养。

0.5h后将培养基移至已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内继续培养。

5、24h后轻柔换液。

以后每隔2～3d换一次培养液，且每次换液前用HBSS 液剧烈振荡洗涤2次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

6、7至8天后，当星形胶质细胞汇合并且覆盖的小胶质细胞暴露在星形胶质细胞层上或已经与星形胶质细胞层分离时，在轨道摇床上以180rpm摇动T25烧瓶120分钟以分离收集小胶质细胞。

加入新鲜的细胞培养基，并在240rpm下16小时继续摇动烧瓶以除去少突胶质细胞前体细胞（OPC）。

7、胰酶消化后的细胞移至培养皿中传代，培养2d后可用免疫荧光的方法进行细胞鉴定。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。