第四章 酶的固定化

3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
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外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
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内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
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固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
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助因子的反应；
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三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
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1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应

多媒体教学参考资料/备课资料
酶的固定化方法
酶的固定化方法不下百种，归纳起来大致可以分为三类，即载体结合法、交联法和包埋法。

载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。

根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。

物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。

离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。

共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。

交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。

交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。

包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。

前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。

清华同方教育技术研究院。

⾼级⽣化题库——第四章酶第四章酶⼀、名词解释1、固定化酶⼆、是⾮题1、酶的最适pH与酶的等电点是两个不同的概念，但两者之间有相关性，两个数值通常⽐较接近或相同。

（－）2、对于⼀个酶⽽⾔，其过渡态的底物类似物与底物的物相⽐较，是更有效的竞争性抑制剂。

（＋）3、在结构上与底物⽆关的各种代谢物有可能改变酶的Km值o4、如果加⼊⾜够的底物，即使存在⾮竞争性抑制剂，酶催化反应也能达到正常的Vmax。

5.、酶反应最适pH不仅取决于酶分⼦的解离情况,同时也取决于底物分⼦的解离情况( )6、反竞争性抑制剂(I)⾸先与酶结合形成EI，EI再与底物(S)结合形成EIS，EIS不能分解成产物，I因此⽽起抑制作⽤。

7、Km的物理意义是指当酶反应速率达到最⼤反应速率⼀半时的底物浓度。

为使某⼀反应的反应速度从10%Vmax提⾼到90%Vmax，其底物浓度应提⾼9倍。

8、推导Michaelis-Menten⽅程时，假设之⼀是随底物转变为产物，酶-底物复合物的浓度不断下降。

9、⼀种酶有⼏种底物时，就有⼏种Km值。

10、别构酶对温度的反应很特殊，有的在0℃时不稳定，在室温时反⽽稳定。

三、填空题1、酶容易失活，如何保存酶制品是⼀个很重要的问题。

通常酶制品的保存⽅法有＿＿＿和＿＿＿等。

2、有⼀类不可逆抑制剂具有被酶激活的性质,被称为_________型不可逆抑制剂,⼜可被称作酶的_____________3、抗体酶既具有专⼀结合抗原的性质，⼜具有酶的催化功能。

4、胰蛋⽩酶原__________端切去6肽后变成有活性的胰蛋⽩酶。

5、于1953年⾸先完成了胰岛素的全部化学结构的测定⼯作。

⽽⽜胰核糖核酸酶是测出⼀级结构的第⼀个酶分⼦，由⼀条含124个残基的多肽链组成，分⼦内含有__________个⼆硫键。

6、胰凝乳蛋⽩酶原受到胰蛋⽩酶作⽤后，在______________与_______________之间的肽键断开，成为有活性的π-胰凝乳蛋⽩酶，再失去两个⼆肽_________________和________________⽽形成酶的稳定形式α-胰凝乳蛋⽩酶。

可能是偶联过 程中酶得到化 学修饰．或固 定化过程提高 了酶的稳定性。
(二)固定化对酶稳定性的影响
稳定性实际
30 25 20 15 10 5 0 提高 不变 降低 12 8 固定化酶数 30
应用

大多数情况下酶经过 固定化后其稳定性都 有所增加。
Merlose选择50种固定化 酶测试稳定性

稳定性提高方面:



热稳定性提高 保存稳定性好 对蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解 对变性剂的耐受性提高,可耐受尿素、有机 溶剂和盐酸胍等蛋白质性剂的作用。 对不同pH稳定性提高
A 热稳定性
B有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高

提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性， 使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成 为可能。固定化酶在有机合成中应用会进 一步发展。
1、固定化后最 适pH升高了 2、pH稳定性增强
最适pH偏移的原因

载体带电荷影响酶所在微环境
结果
•带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化 酶，其最适pH较游离酶偏高。 •使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。

产物对最适pH的影响 主要是由于固定化载体成为了扩散障碍， 使反应产物向外扩散受到一定限制。
催化反应产物为酸性（H+）， 则最适pH比游离酶高（需 OH-中和）反之则偏低，中性 则不变。
+ + +
+
（五）底物特异性

由于存在空间位阻，可能不再作用于分子 量较大的底物，只对小分子量底物有效。 例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白质， 又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在 羧甲基纤维素上后，对二肽或多肽作用保 持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的 3%左右。