酶的固定化方法

固定化酶的化学制备方法固定化酶是指将酶在一定条件下固定在某种多肽或多糖材料中，使其具有较高的稳定性和重复使用性。

固定化酶制备方法有很多种，下面就简单介绍一下常用的几种方法。

第一种是物理固定化法。

这种方法是通过将酶分子与载体材料表面的静电作用、氢键作用等力量结合在一起，从而实现酶的固定化。

常用的物理固定化方法包括吸附、沉淀、共价键等把酶与载体结合在一起。

吸附法是一种较简便、经济的酶固定化方法，但稳定性较差，适用于临时使用。

沉淀法是一种先定制载体材料，再将酶溶液与载体材料混合沉淀制成的固定化方法，能增强酶的稳定性。

共价键法则通过选择适当的交联剂将酶与载体基质之间形成强化学键，形成高度稳定的固定化酶。

第二种是化学固定化法。

这种方法是以某种化学反应方式将酶与载体结合，常见的方法有选择性基团反应和交联剂交联反应两种方法。

选择性基团反应是先在载体表面引入一些特定的官能团，再通过这些官能团再将酶基质固定在载体上，这种方式可以提高酶的活性和稳定性。

交联剂交联反应则是将酶与载体结合的过程中，通过交联剂，形成交联的结构，这种方法稳定性较高、经济实用，但固定化酶的活性较低，不适用于活性较高的酶。

第三种是生物固定化法。

生物固定化法是通过生物体系的作用将酶基质固定在载体材料上，这种方式主要适用于多肽、多糖等含有复杂生物结构的材料。

这种方法优点是酶的活性和特异性较高，但固定化酶的稳定性一般较差。

以上三种方法都可以用来制备固定化酶，不同的固定化方法适用于不同的酶类型、活性、载体材料等。

在实际制备过程中，需要根据实际情况选取相应的方法，以获得稳定和活性高的固定化酶。

酶固定化技术的方法
酶固定化是将酶与载体物质结合在一起，以增强酶的稳定性和重复使用性的技术。

常见的酶固定化方法包括以下几种：
1. 吸附固定化：将酶溶液与载体物质（如活性炭、陶瓷颗粒）接触，酶分子通过吸附作用与载体物质结合。

2. 凝胶固定化：将酶溶液与凝胶物质（如明胶、琼脂）混合，酶通过物理交联或化学交联与凝胶物质牢固结合。

3. 包埋固定化：将酶溶液与聚合物物质（如聚乙烯醇、明胶）混合，然后通过共混或交联反应，使酶被包裹在聚合物内部。

4. 共价固定化：将酶溶液与活性基团多的载体物质（如硅胶、纳米颗粒、聚乙二醇）反应，形成酶与载体物质之间的共价键连接。

5. 薄膜固定化：在载体表面形成一层薄膜，然后将酶与薄膜固定在一起，常见的方法有溶液浸渍、层层自组装等。

这些方法各有优缺点，选择合适的固定化方法应根据具体的酶性质、应用需求和实际操作条件进行综合考虑。

R-O-CH2 –CONH2-NH2 +HNO2 R-O-CH2 –CON3 +H2O
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CON3 +E-SH R-O-CH2 –CO-S-E
定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术
三、固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
酶的固定化技术
（2）界面聚合法： 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原
理包埋酶。 例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶
液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和 有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
酶的固定化技术
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。
酶的固定化技术
四、固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。

固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。

下面是一种常用的固定化酶方法。

材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。

2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。

然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。

最后用洗涤液洗净固定化酶。

3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。

4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。

注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。

2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。

3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。

以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。

固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。

通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。

常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。

1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。

常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。

2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。

常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。

3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。

常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。

4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。

常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。

固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。

其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。

例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。

此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。

在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。

总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。

交联法固定化酶的原理
交联法固定化酶的原理是利用多官能团试剂与酶分子之间进行交联反应，形成共价结合的网状结构，将酶分子固定在载体上。

在交联反应中，多官能团试剂的一部分官能团与酶分子中的氨基、羟基、巯基等活性基团发生反应，形成共价键，另一部分官能团则与载体表面的官能团发生反应，形成共价键，从而将酶分子固定在载体上。

交联法固定化酶的优点是固定化酶的稳定性好，酶分子不易脱落，可以多次重复使用。

缺点是固定化过程中可能会对酶分子的结构和活性产生一定的影响，导致酶的活性降低。

因此，在进行交联法固定化酶时，需要选择合适的载体和多官能团试剂，并控制好固定化的条件，以保证酶的活性和稳定性。

2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。

纯化倍数 Purification
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化

实验原理：


载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）

将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法

是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）

只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）

将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。

首先被采用的网格包埋法是：


固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化

酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。

3、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。

1) 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。

常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。

2) 共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：(1 )天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；(2)有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等(3 )无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。

用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu 侧链的一COOH、C-末端的一COOH ; Tyr 的苯酚基；Cys 的一SH; Lys 的&NH2、N-末端一NH2；Thr、Ser 的一OH ; His 的咪唑基。

在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。

载体活化方法：(1 )重氮化法(2)叠氮法(3 )溴基化法(4)烷基化法等。

4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。

常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。

其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个一NH2,戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。

交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。

可视为一种无载体的固定化方法。

如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2〜7.2, 0C下交联24h，可制成固定化酶。

共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。

通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。

由表面浓度 CSi 求解和由有效因子η E 求解。 （1）表面浓度 CSi 求解。由式
12
生物反应工程习题精解
第三章 固定化酶催化反应过程动力学
k L a(CS 0 − CSi ) = 引入CS＝
rmax CSi r CSi ⇒ CS 0 − CSi = max K m + CSi k L a K m + CSi
(2)、η =
3.2L－乳酸－2－单加氧酶固定在球形琼脂颗粒上，进行下述酶反应： C3H6O3+O2—C2H4O2+CO2+H2O （乳酸） （乙酸） 球形颗粒直径 4mm，浸入一完全混合溶液中，该溶液溶氧为 0.5mmol/l , 在高乳 酸 浓度下 氧 是速率 控制 的底物。 氧 在 琼脂 中有效扩散 系数 De=2.1 × 10-9m2/s , Km=0.015mmol/l , rmax=0.12mol/(kg 酶·s)。颗粒内含有 0.012kg 酶/m3 凝胶，外扩 散限制效应可忽略不计。若氧的消耗按零级动力学处理，试求： （1） 画出在球形颗粒内氧的浓度分布。 （2） 催化剂活性体积所占的分率是多少？ （3） 确定最大反应速率时所允许的最大颗粒直径是多少？ 解：由该反应为零级反应，因此可采用式 3-68 来计算最大颗粒半径。
rmax CSi ；底物由液相扩散到催化剂表面速率可表示为 K m + C Si
rmax CSi 。 K m + C Si
RSd = k L a (CS 0 − CSi ) 。在稳态时，应存在 RSi = RSd ，即 k L a(CS 0 − CSi ) =
5、固定化酶催化反应外扩散效应影响下反应速率的求解。主要包括两个方面：
衡算时，生成项为零。因此可得： N r i4π r 2 − N r+∆r i4π (r + ∆r ) 2 = 4π r 2 i∆r irS

2．蛋白总量 (1)双辛可宁酸法(BCA法) (2)考马斯亮蓝法 3．偶联率及相对活力 偶联率＝(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)／加入 蛋白活力X100％ 活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总活力 ×100％ 相对活力＝固定化酶总活力／(加入酶的总活 力一上清液中未偶联酶活力)X100％


物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅 藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。

操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉 价易得，而且可反复使用

于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢
固而容易脱落，


2.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方
法称为包埋法。

包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法（半透膜法） 将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为凝胶包 埋法；

将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微胶囊法。包
埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，因 此可以应用于许多酶、微生物的固定化。

1）凝胶包埋法 凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法 主要用包埋载体： 琼脂凝胶， 海藻酸钙凝胶， 角叉菜胶， 明胶， 聚丙烯酰胺凝胶

固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降；

只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适
宜。

必须注意维持酶的催化活性及专一性 应该有利于生产自动化、连续化
应有最小的空间位阻
酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利 于反复使用

固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或 反应液发生化学反应

第四章 固定化酶
一、固定化酶的概念 二、固定化技术的兴起与发展 三、酶和菌体的固定化方法 四、固定化酶的特性 复习题
距您钩匪这狈唆玲斗删换禹攒家霸釉勿佰疡穴溃处汞眩咋边架些镶壁愚疗食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。示意图 酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相结合，使酶被集中和限制，从而在使用时不再扩散。固定化酶具有稳定性增加、可反复使用并易于和产物分开等优点，克服了游离酶的不足之处。 固定化所用的酶可以是经提取分离后得到的一定纯度的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。相应地，前者称为固定化酶，后者称为固定化菌体或固定化死细胞。可见，固定化菌体是固定化酶的一种形式，它不像固定化活细胞（或称固定化增殖细胞）那样，固定化菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。
碉标磋冗效螺蔡鸣草菏污胳犹躁拎帽脊面奠验惟掣祸七咯颤殊谎榷愚杨弓食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
三、酶和菌体的固定化方法
（一）吸附法 （二）包埋法 （三）结合法 （四）交联法 （五）热处理法 各固定方法的特点与比较 酶固定化方法示意图
苹届租懈邢蔬披凝愿懒纫馁蛀歹圆狰寅恕畦塑弘侗败综迢唾栗磨湘眩撒桔食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶
（一）固定化酶的形状
固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数。 颗粒和线条主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应； 薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学； 酶管机械强度怯株躺昌休工授格蹈弄君嗓洲赠滤拘齐粥哩琅骚婴葵烯羹业食品酶学课件本第四章固定化酶食品酶学课件本第四章固定化酶

酶的固定化的方案一、材料和方法1.实验材料及试剂酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。

2. 主要实验仪器紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计3.酶的固定化方法1）载体的活化a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。

采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。

具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。

所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。

b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。

树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。

抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。

举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。

2）固定化方法a 共价结合法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。

然后于冰浴中缓慢振荡24h。

之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。

b 酶聚集体包被法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。

然后于冰浴中缓慢振荡24h。

之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。

最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。

c.酶活性的测定d. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度固定化时溶液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定：考马斯亮蓝试剂的配制：将考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。

酶生物传感器中酶的固定化技术
酶生物传感器中的酶固定化技术是一种利用酶作为生物传感器的关键技术，可以将酶固定在传感器上，使得检测信号可以被有效地检测。

这一技术可以大大减少传感器中应用酶的成本，提升检测精度和灵敏度。

酶固定化技术是用来把酶固定在传感器上的一种技术，它使酶能够更加稳定的存在，也能够更好的发挥它的功能。

主要的酶固定化技术有以下几种：
1、固定化技术：通常使用交联剂、硅胶涂层等技术将酶固定在传感器表面上，这样可以有效地保护酶的活性，从而提高检测灵敏度。

2、基因工程技术：利用基因工程技术，可以将所需的酶基因组合到一起，形成一个新的基因，然后将这个新基因植入到传感器中，从而使得酶能够被固定在传感器中。

3 、纳米技术：纳米技术可以将酶固定在纳米粒子表面上，这样可以使得酶在纳米粒子表面上能够更好地展开功能，也能够显著提高检测灵敏度。

4、膜定向技术：膜定向技术的原理是将酶固定在膜的一侧，从而可以使得酶只能够通过膜的一侧进入传感器内部，这样可以大大提高检测效率。

酶生物传感器中的酶固定化技术可以让酶保持稳定的活性，从而提高检测灵敏度，减少成本。

不同的酶固定化技术都有其各自的优势，诸如交联剂可以显著提高检测精度，基因工程技术可以更好地控制酶的活性，纳米技术可以让酶发挥更强的活性，而膜定向技术可以提高检测的效率。

所以，酶生物传感器中的酶固定化技术是目前提升检测精度和灵敏度的重要技术，也是生物传感器的重要组成部分。

酶固定化方法酶是一种生物催化剂，能够在生物体内促进化学反应的发生，并具有选择性、高效率等特点，被广泛应用于药物合成、化妆品生产、食品加工、农业等领域。

然而，酶在生产过程中易受到环境条件、物质浓度、PH值等因素的影响，其失活速度也较快，因此需要采用酶固定化方法来提高酶的稳定性和重复使用性。

酶固定化是指将酶分子固定在一定的载体上，形成酶固定化催化剂，以提高酶的稳定性、活性和寿命，并使其能够重复使用。

酶固定化的优点在于可以有效地降低生产成本，提高产品的纯度和产量，减少废物的生成，并且有利于环境保护。

常见的酶固定化方法有物理吸附法、化学共价键结合法、交联共价键结合法、磁性分子筛固定法等。

1.物理吸附法物理吸附法是一种简单易行的酶固定化方法，主要是利用载体表面的物理吸附力将酶固定在载体上。

常用的载体有纤维素、硅胶、氧化铝、纳米颗粒等。

物理吸附法具有操作简单、成本低、不影响酶的活性、经济实用等优点，但固定效果不够稳定，易受到温度、PH值、离子浓度等因素的影响，且固定效率较低。

2.化学共价键结合法化学共价键结合法是将酶固定于载体表面通过共价键（如酯键、硫醇键、胺键等）连接，酶与载体结合更牢固。

此方法的固定效果稳定，易于操作，但可能影响酶的活性，且固定剂的使用可能会增加成本。

交联共价键结合法是一种主要针对大分子酶的固定化方法，其原理是将酶分子与载体交联，形成较牢固的内部网络结构，通过物理和化学交联结合将酶固定在载体上。

该方法具有较好的固定效果和稳定性，并且可以在不影响酶的活性的情况下实现酶的固定化。

4.磁性分子筛固定法磁性分子筛固定法是一种新型的酶固定化方法，利用磁性颗粒作为载体，采用超声波或磁力场等手段使酶分子与磁性颗粒产生交互作用，从而固定酶分子。

此方法具有简单易行、操作方便、固定效果好等优点，适用于固定化小分子酶和大分子酶。

第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。

将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。

固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。

一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。

1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。

包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。

凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。

最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。

微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。

常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。

2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。

吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。

吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。

但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。

3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。

这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。

缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。

共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。

4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。

常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。

其中应用最广泛的是戊二醛。

用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。

烷基化法

含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化， 然后与酶分子上的氨基、巯基、羟基发生烷基化反应， 制备固定化酶
共价结合法

特点：
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连
续使用。
缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而
影响酶的催化活性。
4、交联法

定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间进行交 联反应，制备固定化酶的方法。 常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等双功能试剂。 特点：
喷雾干燥 淀粉 淀粉酶 液化液 糖化酶 糖化液 结晶 异构酶 结晶葡萄糖 果糖42% 葡萄糖55% 低聚糖 高果糖浆 果糖浆 果糖80-90% 果糖55% 葡萄糖39% 低聚糖 氢化还原 粉状葡萄糖 山梨醇
果葡糖浆 混合
分离
天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 延胡索酸酶 β-半乳糖苷酶 天门冬氨酸-β-脱羧酶 脂肪酶
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
结合法 共价键结合法 离子键结合法 制备难易 难 易 包埋 法 吸附法 交联 法
较难
易
较难
结合程度
活力回收 再生 费用 底物专一性
强
低 不能 高 可变
中等
高 可能 低 不变
强
高 不能 低 不变
弱
高， 酶易流失 可能 低 不变
强
中等 不能 中等 可变
三、固定化酶的性质 1、酶的稳定性。
第十三章 酶固定化
第一节 酶的固定化
酶的固定化方法
固定化酶的性质 固定化酶的应用
为什么要将酶固定化？
游离酶在应用中的不足
稳定性较差； 难于回收重复利用；
给后续分离纯化增加困难。