同步荧光分析法测定生物蛋白质

蛋白质定量分析了解生物体内蛋白质表达的方法蛋白质是生物体内重要的组成成分，它们在维持生命活动以及调节生理功能等方面起着关键作用。

了解生物体内蛋白质的表达水平对于研究生物体的功能与疾病机制具有重要意义。

在实验室中，科学家们常常需要进行蛋白质定量分析来准确测量生物体内蛋白质的表达水平。

本文将介绍几种常见的蛋白质定量方法。

一、BCA（巴氏反应）法BCA法是一种常用的蛋白质定量方法，它基于巴氏反应原理，通过将被测蛋白质样本与BCA试剂反应生成可着色的络合物，然后利用分光光度计测定络合物的吸光度来确定蛋白质浓度。

BCA法具有操作简单、反应时间短、灵敏度高的特点，被广泛应用于生物科学研究领域。

二、Lowry法Lowry法是另一种常用的蛋白质定量方法，它利用蛋白质在碱性条件下与铜离子和碱式碳酸铜反应生成可测量的蓝色复合物，再利用比色法测定复合物的吸光度来确定蛋白质浓度。

Lowry法具有较高的敏感性和较宽的线性范围，在分析蛋白质样品时非常可靠。

三、Bradford法Bradford法是一种相对快速且便于操作的蛋白质定量方法。

该方法利用考马斯亮蓝G250（Coomassie Brilliant Blue G-250）与蛋白质之间的非共价相互作用形成蓝色复合物，再通过比色法来测定蛋白质样品的吸光度。

Bradford法具有灵敏度高、线性范围广等优点，常被用于较快速的蛋白质定量。

四、荧光定量法荧光定量法是一种常用于测定蛋白质浓度的灵敏度高的方法。

该方法利用特定的荧光染料与蛋白质发生非共价相互作用，生成荧光染料-蛋白质复合物，进而通过测量荧光信号的强度来确定蛋白质浓度。

相比于上述几种方法，荧光定量法的线性范围更广，并且对于小样本量也能获得可靠结果。

五、质谱分析法质谱分析法是一种利用质谱技术对蛋白质进行定量分析的方法。

此方法通常结合先进的液相色谱技术与质谱仪器，通过将样品中的蛋白质分离和离子化，进而测量离子化蛋白质的质量-电荷比（m/z），最终得到蛋白质的浓度。

实验题目：测定生物样品中的蛋白质（同步荧光法）1.实验原理：蛋白质是一类重要的生物大分子，它是构成生命体最重要的物质基础之一。

蛋白质的定量测定是临床检验中诊断疾病及检查治疗效果的重要指标。

因此，蛋白质定量测定在化学、生物、医药、食品等各相关学科中已经成为一个非常热门的研究课题。

血清白蛋白是动物和人体血浆中重要的载体蛋白，它能和许多种内源或外源化合物产生作用，承载着将药物运输到达靶点产生药效和储存药物延长药效等重要作用，对研究药物的药效和药理及临床用药有重要意义。

蛋白质测定较常用的经典方法有凯氏定氮法、Lowry法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法b1等，其中，凯氏定氮法因其适用样品广泛，测试结果准确，是常用分析有机化合物含氮量的经典方法之一。

近来又发展了一些新方法如荧光光度法、化学发光法和共振光散射法[等。

同步荧光光谱法自1971年被提出以来，由于其与常规荧光分析法相比具有灵敏度高、选择性好、光谱简化、谱带窄化及可减小散射光影响等优点，已成功地应用于多组分的同时测定以及生物分子的研究中。

2.仪器与试剂：FP-6500荧光分光光度计(日本分光公司)；T-6紫外一可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)；PB．10型酸度计(北京赛多利斯仪器系统公司)；BS．110S型电子天平(北京赛多利斯天平公司)；脱氧尿苷1．0×10。

3 mol／L水溶液；人血清白蛋白(HSA，华兰生物工程公司)4．0×10。

5 mol／L水溶液，在冰箱中保存(1～4 oC)；pH 7．4的％s．HCI 缓冲溶液；考马斯亮蓝溶液(溶液中含0．0l％考马斯亮蓝G-250，4．7％乙醇，8．5％磷酸)；0．5 mol／L的NaCl水溶液。

所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次去离子水。

3. 实验方法：于10 mL比色管中依次加入：pH 7．4的Tris．HCl缓冲溶液2．0 mL，0．5 mol／L的NaCI溶液2．0 IllL，一定体积的HSA标准溶液，1．0×10。

荧光分析方法在生化分析中的应用研究生化分析是一种研究生物体内基本物质构成和代谢变化的科学分析技术。

随着现代技术的发展和精细化研究的需要，生化分析方法也得到了大力发展。

其中荧光分析方法因其高灵敏度、高选择性、快速分析等优点，在生化分析中得到了广泛的应用。

本文将从荧光分析方法的基本原理、荧光探针的特点以及在生化分析中的应用等方面进行探讨。

一、荧光分析方法基本原理荧光分析法是利用荧光物质和生物样品(如蛋白质、核酸等)之间的配位作用所发生的荧光现象来进行分析的，通俗的说，其基本原理是通过荧光物质与生物样品之间的特异性作用来测定样品中的化合物或生物分子。

荧光分析法基本步骤是：首先选择合适的荧光物质，并将其加入待检测样品中，荧光物质与样品分子发生特异性作用之后，再运用光源进行激发，样品便会发出荧光信号，通过特定光电探测系统测量荧光信号的强度，可间接测定样品中化合物或生物分子含量。

二、荧光探针的特点荧光探针是指具有特定的荧光物质，以及配合体、酶或抗体等的化合物。

在荧光分析中，荧光探针是非常重要的作用体，其特点如下。

1、高选择性：荧光探针对于不同的样品具有高度的选择性，能够针对不同生物分子进行特异性的测定。

2、高灵敏度：用荧光探针进行检测，在低浓度下依然能够发出较强的荧光信号。

相对于传统方法，荧光分析法的灵敏度更高。

3、简便易行：荧光探针的制备方法简单，可通过化学合成、生物发酵等方式得到。

三、荧光分析法在生化分析中的应用1、蛋白质分析荧光分析法可以通过荧光标记的抗体来进行蛋白质的测定，这一方法也被称为荧光免疫测定法。

利用荧光标记抗体与待检测蛋白质发生反应，再进行荧光分析，可用于检测血清中的肿瘤标志物、IgE等疾病相关蛋白质，具有高度的特异性和灵敏度。

2、核酸分析荧光探针可以通过与DNA或RNA结合来测定其含量或特定序列。

由于荧光探针对不同序列的结合能力不同，在核酸分析中具有高度的特异性。

例如，通过利用靶向特定基因序列的探针，可用于测定基因的存在、突变情况等。

荧光光谱法在蛋白质研究中的应用尹燕霞;向本琼;佟丽【摘要】荧光光谱法对研究蛋白质结构及其构象变化是很重要的.描述了荧光光谱的概念、发光机理及特点,介绍了荧光光谱仪的仪器原理和结构,记述了荧光光谱技术在检测蛋白质的构象变化、蛋白质的含量和酶活性方面的具有应用.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2010(027)002【总页数】5页(P33-36,40)【关键词】荧光光谱法;蛋白质;构象【作者】尹燕霞;向本琼;佟丽【作者单位】北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875【正文语种】中文【中图分类】O657.3;TQ937某些物质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光称为荧光。

荧光光谱在各方面的应用及有关的方法称为荧光光谱技术。

1.1 荧光发光机制每一个分子具有一系列分离的电子能级,每一电子能级中又有一系列的振动能级和转动能级。

当物质被光照射后,大约在10-15s内光被物质吸收,物质分子获得能量,分子内的电子跃迁到较高能级而变成激发态。

处于激发态的分子很不稳定,它首先通过内转换将部分能量转移给周围分子,回到最低电子激发态振动能级(称为第一级电子激发态振动能级),处于这一能级的分子平均寿命大约是10-8s,如果这时分子通过发射相应的光量子来释放剩余能量而回到基态的各个不同的振动能级,就产生了荧光。

因此,最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的基础。

由于分子发射荧光前已有一部分能量被消耗,所以荧光能量要比物质吸收的光能量小,因而荧光的发射波长总比激发波长长。

1.2 常用荧光参数荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。

因而被广泛地应用于各个研究领域。

它能提供包括激发谱、发射谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命等许多物理参数,这些参数从各个角度反映分子的构象情况,通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推断生物大分子在各种环境下的构象变化,从而阐明蛋白质结构与功能的关系。

收稿日期:2000-02-18作者简介:石　燕(1964-),女,副教授. 文章编号:1006-0464(2000)03-0282-04牛血清白蛋白的同步荧光分析法石　燕1　鄢　远2　黄坚锋2(南昌大学1.食品科学系;2.化学系,江西南昌　330047)摘　要:建立了用染料麦塔喇红固定波长同步荧光分析法测定牛血清白蛋白的新方法,实验结果表明,以麦塔喇红为荧光探针,用同步荧光分析法测定蛋白质方法简便,反应速度快,灵敏度高,线性范围为0～4μg /mL ,检测限为66.0ng /mL 。

相对标准差(n =8)为0.67。

关键词:麦塔喇红;蛋白质;同步荧光分析法中图分类号:O657.3 文献标识码:A蛋白质中研究得较多的是白蛋白,白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,在人体内起着重要的储存和输运作用〔1〕。

因此对蛋白质的定量分析具有十分重要的意义。

自1971年同步荧光光谱法被提出以来,由于其具有灵敏度高,选择性好,谱带简化及可减小散射光影响等优点,已成功地应用于多组分的同时测定〔2〕以及生物分子的研究中〔3〕。

目前,临床上测定蛋白质多采用染料结合法,而用同步荧光分析法鲜有报道。

麦塔喇红(以下简称MR )是一种发荧光的碱性染料,蛋白质能与其发生作用,使其荧光发生猝灭,其荧光猝灭程度在一定的范围内呈现良好的线形关系。

但是,如果用于蛋白质的测定,由于其stokes 位移(λex /λem =540nm /556nm )很小,散射光会对其产生影响。

因此,我们采用同步荧光分析法可减小由上述因素带来的误差。

实验结果表明,以麦塔喇红为荧光探针,用同步荧光分析法测定牛血清白蛋白(以下简称BSA )方法简便快速,灵敏度也较高。

1　实验方法Hitachi F -3010荧光分光光度计(日本日立),pH s -2c 型酸度计(上海雷磁仪器厂),BSA 购自华美公司,以50mmol /L NaCl 水溶液配制。

M R (分析纯)用水配制。

测定蛋白质含量的方法和原理蛋白质是生物体内最为重要的有机分子之一，对于了解生物体的结构和功能至关重要。

因此，准确、精确地测定蛋白质含量是生物化学研究中的关键一步。

本文将介绍常用的测定蛋白质含量的方法和其原理。

一、低里德伯法（Lowry法）低里德伯法是测定蛋白质含量的常用方法之一。

其原理基于酚在碱性条件下与蛋白质发生反应，在存在重铬酸钾的条件下生成一种带有吸收峰的蓝色化合物。

这种蓝色化合物在750 nm波长处有最大的吸光度，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。

二、比色法比色法是测定蛋白质含量的常用方法之一。

常用的比色剂有布拉德福法和加伦氏法。

布拉德福法主要原理是根据蛋白质中含有的酪氨酸、酪氨酸衍生物等组分在碱性条件下与染料结合，形成有色产物，利用比色计测定产物的吸光度从而测定蛋白质的含量。

三、BCA法BCA法是一种基于铜离子的氧化还原反应的方法。

其原理是在碱性条件下，蛋白质中的蛋白质-联没有的二瓣基色团（BCA）与四氢呋喃（THF）结合，生成紫色的螯合物。

这种紫色螯合物的吸光度与蛋白质的含量成正比，可以通过比色计测定吸光度值来确定蛋白质含量。

四、荧光法荧光法是一种基于蛋白质与荧光染料之间的相互作用的测定方法。

常用的荧光染料有吖啶橙、铜铁磺胺二异硫氰酸盐（Ferrozine）等。

这些荧光染料在特定的pH值和溶液中与蛋白质发生作用，产生荧光信号。

利用荧光光谱仪测定荧光强度，通过标准曲线得出蛋白质的含量。

五、生物传感器法生物传感器法是利用生物传感器对蛋白质的特异性识别和反应进行测定的方法。

常用的生物传感器包括酶传感器、抗体传感器等。

这些传感器可以通过与蛋白质结合形成复合物或发生反应，产生信号。

利用信号的强度可以测定蛋白质的含量。

六、尿素与氨基酸分析法尿素与氨基酸分析法是通过测定蛋白质降解产生的尿素和游离氨基酸来推测蛋白质的含量。

该方法基于蛋白质降解后，其氨基酸经氧化反应生成尿素，通过检测尿素或游离氨基酸的浓度来间接测定蛋白质含量。