第九章色谱技术

二、方法原理
5.亲和色谱法 主要利用生物大分子与固定相之间的特异亲和力 进行选择性分离及纯化的方法。
原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称 为间隔臂），然后再连接上配基。当含有复杂混合试样的流动 相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲和力特性的生物大 分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被淋洗出；随后 ，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形 式洗脱出来。
1.高压输液系统 一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过 滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成，其中高压输 液泵是核心部件。
（1）贮液器 用来贮存流动相，其材料对流动相是化学惰性的 。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等
（2）过滤和脱气装置 流动相在使用前应根据其性质选用不 同材料的滤膜过滤，一般选用市售的0.45 m的水性和油性滤 膜进行过滤 。样品溶液一般用市售的0.45 m针形滤器过滤。 另外，在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样 的滤柱和滤板。
一、分离类型的选择 色谱分离类型的选择原则列于图9－3中。
图9－3 PHLC分离类型的选择参考表
二、固定相和流动相的选择
（一）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为 刚性固体和硬胶两大类。固定相按孔隙深度可分为表 面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃 球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离 子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
例1 有机氯农药的测定，采用液－固色谱法。
色谱条件：50cm×2.5mm（内径）色谱柱；
三、HPLC法应用实例
流动相：正己烷； 固定相：薄壳硅胶 CorasilⅡ37~50μ m）；

色谱峰高和峰面积（定量参数）
1. 峰高h：指组分在柱后出现浓度极大时的 检测信号，即色谱峰顶至基线的距离 2. 峰面积A：指色谱曲线与基线间包围的面积
区域宽度
色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张 的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。 度量色谱峰区域宽度通常有三种方法： 1. 标准偏差σ 正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半， 即正常峰0.607倍峰高处峰宽的一半。
由于组份在色谱柱中的保留时间tR 包含了组份 随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞 留所需的时间，所以tR′实际上是组份在固定相中停 留的总时间．保留时间可用时间单位（如s）或距 离单位（如cm）表示。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组 份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱 工作者有时用保留体积等参数进行定性检定．

1944年：Consden，Gordon和Martin将纤维（滤纸）作固 定载体，以水吸附在滤纸上作溶剂，根据组分在两相中溶 解度不同，即渗透率（速率）不同而使各组分彼此分离， 称之为纸色谱法。 1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性载体表面涂 渍一层均匀的有机化合物膜作为固定相，并以气体为流动 相，用来分离脂肪酸混合物——即今日的气－液色谱。
σ的大小表示组分被带出色谱柱的分散
程度。
2. 半峰宽W1/2
即峰高一半处对应的峰宽，它与标准偏差 σ的关系是：
W1/2 = 2.355σ 3. 峰宽W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截 距，它与标准偏差的关系是： W = 4σ或 W =1.699 W1/2
从色谱图上，可以得到许多 重要信息：
1903年，Tsweet应用色谱分离现象
石油醚 色素混合液
(流动相） 色谱柱 碳酸钙 （固定相）

④ 温度的影响
• 温度升高，保留值降低； • 温度升高，柱效提高。
郑枫
中国药科大学药物色谱分析课程
郑枫
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2、双保留机理
• 双保留机理—— 溶质的保留值应包括两部分的贡献，即疏
溶剂效应和亲硅醇基效应。
• “亲硅醇基效应”—— silanophilic interaction
盐酸非洛普的代谢物M3
OCH3 OH
郑枫
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② 烷基键合固定相特性对保留值的影响
A. 烷基数量越多，溶质保留越强。
郑枫
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② 烷基键合固定相特性对保留值的影响
B. 烷基碳链越长，溶质保留越强
随着烷基碳链的增长，增加了键合相 的非极性作用的表面积，其不仅影响 溶质的保留值，还影响色谱柱的选择 性，即随烷基碳链的加长其对溶质分 离的选择性也增大。
郑枫
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当溶质进入到极 性流动相中后，溶 质分子（S）被流 动相推动并与固定 相接触时，溶质分 子的非极性部分会 与非极性固定相上 的烷基(L)发生缔合 作用，结合形成缔 合物(LS)。
•这种疏溶剂的缔合 作用是可逆的。
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4）溶质保留值的影响因素
3）“疏溶剂效应” —— solvophobic interaction
• 当溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时，相 互间产生斥力。此现象称为“疏溶剂”。而极性 部分与极性溶剂相互吸引。
• 而当溶质分子的非极性部分与键合相表面的烷基 （分子毛）接触时，则相互间产生缔合作用。这 种缔合作用是可逆的。这种缔合作用的强弱决定 了溶质分子色谱保留的强弱。

wwwimustcnbioseparationengineeringwwwimustcn原料液细胞分离离心过滤细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一a路线一b清液胞外产物粗分离盐析萃取超过滤等纯化层析电泳脱盐凝胶过滤超过滤浓缩超过滤精制结晶干燥包含体溶解加盐酸胍脲复性生化分离过程的一般流程

9.3亲和色谱的介质
亲和吸附介质是必备材料，过程的关键。商品化 介质不能满足需要时，要自制其过程是首先选择适当 的配基，然后修饰固定相制成吸附剂。 亲和吸附介质的组成：
载体（骨架） 配基
间隔臂

（1） 载体： 载体为固定配基提供了基质，理想的载体应具备以下性 质： a.具有亲水性 b.具有大量化学基团 c.机械强度好 d.稳定性好 e.颗粒大小及孔径均匀 琼脂糖是应用最 普遍的，见右图。其他 还有纤维素、多孔玻璃 及其他化学合成介质。
C.配基的分类 ： a.特异性配基
只针对单一的物质进行特异的结合，特异性随条件变化，对不同的 分离对象为获得特异性配基常常需要实验筛选，这类配基选择性高，方 便，种类少；
b. 通用性配基或群特异性配基
可与一类或几种生物分子作用，配基为小分子。优点是容量高，花 费低。通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补特异性较差的缺点。广泛采 用的有：三嗪染料、金属螯合物组氨酸、核苷酸等。

亲和作用体系: 亲和作用体系由亲和作用的分子对组成，可以是 大分子－大分子、大分子－小分子、大分子－细胞和 细胞－细胞各种体系。 常用体系：分为两类 高度特异性体系：分 子成一对一的关系 群特异性体系： 一个分子与同类基团 的各种分子相结合。

（3）间隔臂： 引出的原因：存在几何位阻； 定义：配基和载体中间加入一定长度的有机基团，称间隔臂。 见下图。 对间隔臂的要求：长度适当，具有亲水性。 常用的间隔臂：乙二胺，己二胺，6-氨基己酸，β-羟基丙氨 酸。 理想的间隔臂：长度合适，不进行非特异的吸附，无外加的 活性吸附点，有双功能反应基团。