真核细胞常见表达载体

真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。

•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。

大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。

二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。

三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。

四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。

作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。

原核表达和真核表达原核表达的步骤和主要试剂1、获得目的基因；2、构建重组表达载体；3、获得含重组表达质粒的表达菌种；4、诱导表达；5、包涵体的分离。

获得目的基因 PCR法钓基因引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）/Pfu酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)RT-PCR法获取基因Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其他进分），Rnase抑制剂（MBI），M-MLV/AMV（Fermentas）或M-MLV/AMV一步法RT-PCR试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）构建重组表达载体 内切酶（Fermentas），载体（捷瑞，Fermentas），琼脂糖（西班牙），T4连接酶（Fermentas，promega），测序获得含重组表达质粒的表达菌种 菌株（捷瑞），质粒小抽试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen），感受态细胞制备试剂盒（捷瑞），抗生素（捷瑞，Amresco，sigma），测序（伟沃）诱导表达 IPTG（捷瑞，Amresco，sigma），胰蛋白胨（Oxiod），酵母粉（Oxiod），琼脂（进分，国产）包涵体的分离 Triton X -100（捷瑞，进分），PMSF(sigma)，DTT （Amresco，进分），尿素（Amresco，进分，sigma）,还原型谷胱甘肽（Amresco，进分，sigma）真核表达蛋白质在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录加工系统获得具有一定构象和生物活性的蛋白质。

真核表达现在主要有毕赤酵母表达体系、杆状病毒昆虫细胞表达体系、哺乳动物细胞表达体系。

各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。

一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

真核细胞表达系统自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。

并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。

随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。

该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制；...文档交流仅供参考...②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。

因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。

目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考...1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。

《分子生物学》复习指南《分子生物学》复习指南答案一、名解1、基因：是含有生物信息的DNA片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA和多肽链。

(课件)2、分子伴侣(Molecular Chaperone)：又称为伴侣蛋白，是一类在序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，在细胞内协助其它多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解，在功能完成后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。

3、RFLP：即限制性片段长度多态性。

高度重复序列中的无间隔反向重复序列很容易形成限制性内切酶识别位点，也很容易由于突变产生或失去一个酶切位点，因而可以造成限制性片段长度多态性。

即用同一种限制性内切酶消化不同个体的同一段DNA时，由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点，从而会产生长度不同的DNA片段，这种方法称为限制性片段长度多态性，简称RFLP技术。

4、DNA的复制（replication）：以构成基因组的全套核酸分子为模板，精确合成一套新的核酸分子的过程。

遗传信息通过亲代DNA 分子的复制传递给子代，在保持生物物种遗传的稳定性方面起着重要的作用。

5、反转录：又称逆转录（reverse transcription），是以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成双链DNA的反应。

6、克隆载体：可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。

该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。

7、功能基因组：细胞内所有具有生物学功能的基因。

表达一定功能的全部基因所组成的DNA序列，包括编码基因和调控基因。

8、核不均一RNA：即hnRNA,即前体mRNA，在真核生物中，最初转录生成的RNA,存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA之总称。

由外显子和内显子组成，需经过剪接加工及各种修饰后，形成成熟的mRNA。

9、分子杂交：由来源不同的两个脱氧核糖核酸单链或核糖核酸单链结合成双链分子的过程。

蛋白表达形式
蛋白表达形式主要有以下几种：
1. 原核表达系统：原核表达系统是最早被开发的蛋白表达途径之一，主要利用大肠杆菌（E.coli）作为宿主细胞。

该系统具有操作简单、表达量高等优点，适用于小分子量蛋白的表达。

在原核表达系统中，常用的表达载体包括质粒和噬菌体。

质粒表达途径通过将目标蛋白编码基因插入质粒中，然后将质粒导入宿主细胞，利用宿主细胞的代谢机制表达目标蛋白。

噬菌体表达途径则利用噬菌体感染宿主细胞，将目标蛋白编码基因插入噬菌体基因组中，然后利用宿主细胞的机制表达目标蛋白。

原核表达系统的主要限制是无法表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。

2. 真核表达系统：真核表达系统利用真核细胞作为宿主细胞，可以表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。

常用的真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

酵母表达系统主要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为宿主细胞。

除此之外，还有分泌型表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体等多种表达形式，并且每种表达形式都有其独特的特点和应用场景。

基因载体名词解释基因载体是指用于携带、传递和复制基因的分子或生物体。

在基因工程和生物技术领域，基因载体通常是指能够容纳外源DNA序列的DNA分子或细胞，常被用于基因克隆、基因表达、基因转移等实验和应用中。

常见的基因载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样粒子、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等。

这些载体被广泛用于基因工程实验和技术，在研究和应用中起到了至关重要的作用。

质粒是最常用的基因载体之一，是一种小型环状DNA分子，可以自主复制和传递，对于分子克隆和基因表达都非常有用。

质粒通常具有选择性标记基因（如抗生素抗性基因），可以通过选择性培养来筛选出带有目标基因的质粒。

此外，质粒还可以携带其他附加基因元件，如启动子、终止子、启动子和信号序列等，在基因表达中发挥重要作用。

另一种常见的基因载体是噬菌体，是一种感染细菌的病毒。

噬菌体可以携带外源DNA序列，并在细菌中进行复制和表达。

噬菌体可以用于高效地产生大量目标蛋白，因此在基因表达和蛋白生产中具有广泛应用。

此外，还有噬菌体样粒子，它是由噬菌体的基因组包裹在蛋白质壳中构成的粒子，可以携带大片的外源DNA序列，并在细胞中进行复制和表达，常用于基因克隆和基因转移实验。

在真核生物中，常用的基因载体包括酵母和昆虫细胞。

酵母是一种单细胞真核生物，具有较高的基因组稳定性和蛋白表达能力，在基因工程和蛋白生产中被广泛运用。

昆虫细胞也具有较高的蛋白表达能力，被广泛用于重组蛋白的产生和应用。

总的来说，基因载体是在基因工程和生物技术领域中不可或缺的工具，能够携带外源DNA序列，并在细胞中进行复制、传递和表达。

基因载体的选择和设计对于实现特定的实验目标和应用需求至关重要。

山羊SPRN基因真核表达载体的构建摘要：以山羊小脑cDNA为模板，利用RT-PCR法扩增获得了SPRN基因完整编码区片段，将其连接到pMD19-T载体上，转化感受态JM109后，筛选并鉴定阳性克隆，通过序列测量，将序列正确的片段双酶切后连接到真核表达载体pEGFP-N1上。

结果表明，成功构建了山羊SPRN基因完整编码区的真核表达载体。

关键词：山羊；SPRN基因；RT-PCR；真核表达载体SPRN基因编码Shadoo（简称Sho）蛋白，在结构上与PrPc类似。

Sho蛋白约包括130～150个氨基酸，N端保守，含有最多6个富含Arg的四肽XXRG（X 是G、A或S）重复的碱性区域和约20个AA与PrPc有非常高同源性的疏水区。

与N端相比，C端不够保守，与PrP差异较大，包含一个糖基化位点，末端是GPI锚的信号肽。

Sho蛋白氨基酸在不同物种中差异不大[1]。

Sho蛋白具有与PrPc相似的神经保护作用，因此认为SPRN基因是一个与TSEs有关的一个候选基因[2]。

2007年8月发现了称为‘Shadoo’的朊病毒蛋白，证明了这种理论上的病毒蛋白真正存在，同时也观测到p 1 材料与方法1.1 材料限制性内切酶、引物合成与测序、DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Trizol试剂、M-MLV反转录酶、T4 DNA连接酶、pMD19-T、Taq DNA聚合酶、GC Buffer Ⅱ、dNTPs购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法1.2.1 山羊小脑组织总RNA的提取RNA的提取按照Trizol试剂说明书进行。

1.2.2 特异性引物的设计与合成根据GenBank中山羊SPRN基因的序列，利用Prime Premier 5.0 软件设计引物，并在正向引物引入限制性Bgl Ⅱ酶切位点5′-GAAGATCTGAGGTCTCCTCCGTCCT-3′，在反向引物引入EcoRⅠ酶切位点5′-CGGAATTCCACAGGCCTACCGCA-3′。