真核细胞诱导表达系统研究进展
主要内容
一．选题背景
二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望
一、选题背景
•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点
1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；
2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；
3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用
E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统
1、四环素诱导表达系统
2、蜕皮激素诱导表达系统
3、生物素诱导表达系统
4、哺乳动物细胞表达系统
1、四环素诱导表达系统
此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
•Parrado等成功的应用tet2OFF系统证实PLZF(早幼粒细胞白血病锌指)基因在淋巴细胞中表达具有抗凋亡作用。
•Rhoades等应用四环素可诱导系统成功建立了转基因小鼠模型,为研究AML12ETO在白血病发生中的作用奠定了坚实的基础。
缺点：只有筛选大量的克隆或动物才能得到有较低表达背景而目的基因能显著激活的理想克隆或转基因品系。
2、蜕皮激素诱导表达系统
•作用机制：该系统使用蜕皮激素受体与果蝇超螺旋蛋白(ultrasp iracle p rotein，USP)的异源二聚体，加入蜕皮激素〔或合成的类似物幕黎甾酮A(muristerone A)〕后，蜕皮激素与其受体结合,蜕皮激素受体就与USP发生相互作用,进而与DNA上的反应元件结合，最终启动下游目的基因的转录。
•Xiao等就用骨骼肌的α-肌动蛋白启动子代替了CMV启动子，他们用改造的可诱导系统建立稳定细胞株，研究发现在分化成熟的肌细胞中可诱导报导基因的表达，而在未分化的肌细胞中则没有表达。
•Stolarov等通过蜕皮激素可诱导系统证实PTEN可抑制PBK通路，从而阐明了PTEN 抑制肿瘤的机制。
•缺点：哺乳动物细胞对蜕皮激素(或幕黎甾酮A)没有反应性，也不含蜕皮激素受体，所以本底转录水平非常低。
3、生物素诱导表达系统
•背景：传统的哺乳动物细胞外源基因转录调控系统采用的是具有药物活性的诱导剂分子，如抗生素、免疫抑制药物或激素及其衍生物等。
尽管这些条件表达系统在培养中和转基因动物中表现出了良好的调控效果，但对于这些诱导剂的临床副作用的担忧和抗生素抗性病原体的出现使其在基因治疗和生物药物生产中的应用始终未获批准。
•2007 年，Weber 等建立了一种以生物素为诱导剂的外源基因转录调控系统，在CHO-K1 细胞和小鼠中均实现了报告基因SEAP 的OFF-ON-OFF 形式的表达，其诱导率（诱导后目的基因表达与本底表达的比率）达到了10 倍左右。
此后，同一个研究小组又报道了这种生物素诱导表达系统的一种变异形式，随着生物素浓度的增加，报告基因SEAP 的表达谱为ON-OFF-ON的形式，诱导率仍为10 倍左右。
•方法：通过基因组PCR或重叠延伸PCR获得该系统的三个基本构件：大肠杆菌生物素连接酶（BirA）、链亲和素-四环素依赖的抑制因子融合蛋白（SA-TetR）和生物素化信号-VP16转录激活结构域融合蛋白（Avitag-VP16）。
将上述基因连入三顺反子表达载体，与响应载体一起共转染293f 细胞，以E G F P为报告基因，检测EGFP荧光强度随培养体系中生物素
生物素诱导表达系统原理示意图：(a)低生物素浓度；(b)中等生物素浓度；(c)高生物素浓度；(d)四环素或强力霉素存在时
•该生物素诱导表达系统与传统的调控表达系统相比，具有如下的优势：
•1）诱导剂生物素是细胞培养基的组分之一，目前未发现有任何的副作用，应用不需额外的批准程序；
•2）可通过逐步增加生物素浓度，实现目的基因由OFF-ON-OFF的变化，而无需繁琐的更换培养基的操作。
•以上的独特性质使得该系统在基因治疗、具有细胞毒性的药物生产等方面具有无法比拟的优势。
4、哺乳动物细胞表达系统
•优势：指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。
研究现状
1、部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段；
2、已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。
如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。
3、虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/108细胞/24小时。
有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。
应用实例
•BHK/v16细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒（HSV）VP16蛋白的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV早期启动子在该工程细胞中有很到的活性。
•已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因子等在内的多种蛋白质的高效表达。
•基于腺病毒EIA蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建立了稳定表达EIA的CHO细胞株，在该细胞中重组前原酶的产量与CHO细胞相比增加了12倍，该细胞在多种抗体的表达中也取得满意的结果。
四、总结与展望
•理想的可诱导表达系统的条件：
1、特异性：该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化；
2、非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰；
3、可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达；
4、诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透入各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障；
5、可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态；
6、剂量依赖性:该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。
展望
•诱导表达系统可以在时空上控制目的基因的表达，这对认识基因在生长发育、生理活动及其病理过程中的作用具有重要意义。
•利用附加体(即染色体外基因)与整合在染色体上的基因，这两类外源基因在同一细胞中可以有共存性这一性质来大幅度提高外源基因的表达水平，这是新近国外发展的一种表达系统，值得进一步研究。
