小檗碱对癫痫大鼠脑组织P_糖蛋白表达的影响_刘新红

国 Leica DMXL 显微镜和 Leica DC300F 照相机） ，分 别随机选取各观察区 5 个不重复的视野（ × 400） 观 察。NF-κB p65 阳性细胞的胞浆、胞核为棕色或深棕 色； P-gp 阳性细胞的胞膜、胞浆为棕色或深棕色。计 数每个视野的细胞总数及阳性细胞数，计算阳性细胞 百分比，取 平 均 值。 表 达 强 度 按 阳 性 细 胞 百 分 比 分 为： Ⅰ级（ ＜ 25% ） ，Ⅱ级（ 25% ～ 50% ） ，Ⅲ级（ 51% ～ 75% ） ，Ⅳ级（ ＞ 75% ） 。 1． 2． 4 统计学方法 采用 SSPS 13． 0 软件进行统计 学分析。检测结果用均数 ± 标准差（ x珋± s） 表示，先进 行频数分 布 和 方 差 齐 性 分 析，如 为 正 态 分 布 且 方 差 齐Байду номын сангаас采用方差分析，两两比较采用 LSD 法； 如方差不 齐或为等级资料，采用秩和检验（ Kruskal-Wallis，H 检 验） 。多样本比较采用 Kruskal-Wallis 秩和检验，两两 比较采用 Wilcoxon 符号秩和检验； 假设检验采用双 侧检验，取 α = 0． 05。
基金项目： 国家自然科学基金（ 81171222） 作者单位： 210029 南京医科大学附属脑科医院神经内科 通讯作者： 狄晴
制核因子（ NF） -κB 可降低癫痫鼠脑内 P-gp 表达，提 示癫痫脑内 P-gp 过表达可能与 NF-κB 活化有关。小 檗碱（ BBR） 是一种异喹啉生物碱，存在于白毛茛、黄 柏和黄连之中。非癫痫领域研究［5-7］证实，BBR 具有 强大抑菌抗炎作用，且多与其对 NF-κB 炎症信号通 路的调节功能有关。本研究通过检测给予不同剂量 BBR 癫痫大鼠脑组织的 P-gp 表达水平，探讨其对癫 痫大鼠脑组织 P-gp 表达的影响。
采用大鼠海马注射海人酸方法制作癫痫模型，各 BBR 干预组分别于术前 48 h、术前 24 h 和术后 6 h 腹腔注射
相应剂量 BBR。观察各组大鼠癫痫发作潜伏期及发作严重程度。造模 24 h 后，采用免疫组化方法检测并比
较各组大鼠海马 CA3 区 P-gp 和核因子-κB（ NF-κB） p65 的表达水平。结果 BBR 20 mg / kg 组 ［（ 66． 11 ±
【文章编号】1004-1648（ 2013） 03-0191-04
Effect of berberine on the expression of P-glycoprotein in the epileptic rat's brain tissue LIU Xing-hong， YU Nian，DI Qing，et al． Department of Neurology，Brain Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China
临床神经病学杂志 2013 年第 26 卷第 3 期
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·论著·
小檗碱对癫痫大鼠脑组织 P-糖蛋白表达的影响
刘新红，余年，狄晴，李乐超，张燕芳
【摘要】 目的 探讨小檗碱（ BBR） 对癫痫大鼠脑组织 P-糖蛋白（ P-gp） 表达的影响。方法 将 44 只 SD
大鼠随机分为假手术组（ 9 只） 、癫痫组（ 9 只） 和 BBR 10 mg / kg（ 9 只） 、20 mg / kg（ 9 只） 、40 mg / kg 组（ 9 只） 。
Key words： epilepsy； berberine； nuclear factor-κB； P-glycoprotein； hippocampus
研究［1］发现，近 1 /3 的癫痫患者经适当抗癫痫药 物（ AEDs） 治疗后，仍不能终止其发作，发展为耐药性 癫痫。P-糖蛋白（ P-gp） 是能量依赖性药物外排性转 运蛋白，其过表达可限制 AEDs 进入致痫灶，是耐药 性癫痫主要发生机制之一［2，3］； 前期研究［4］发现，抑
mg / kg 和 40 mg / kg 组表达显著低于癫痫组（ 均P ＜ 0. 05） 。结论 BBR 能够延长癫痫发作潜伏期、降低其严重
程度，并抑制癫痫大鼠脑组织 NF-κB 和 P-gp 的表达。
【关键词】 癫痫； 小檗碱； 核因子-κB； P-糖蛋白； 海马
【中图分类号】R742． 1
【文献标识码】A
5. 90） min，（ 26． 67 ± 6． 67） min］ 和 40 mg / kg 组 ［（ 76． 33 ± 9． 11） min，（ 42． 00 ± 7． 73） min］大鼠癫痫发作潜
伏期及初次至第 6 次≥Ⅳ级痫样发作间隔时间均明显长于癫痫组 ［（ 41． 78 ± 10． 45） min，（ 9． 44 ± 4． 25）
Abstract： Objective To investigate the effect of berberine （ BBR） on the expression of P-glycoprotein （ P-gp） in the epileptic rat's brain tissue． Methods Forty-four SD rats were randomly divided into sham group （ n = 8 ） ， epilepsy group （ EP group，n = 9） ，BBR 10 mg / kg group （ n = 9） ，BBR 20 mg / kg group （ n = 9） and BBR 40 mg / kg group （ n = 9） ． The epilepsy model were established by injecting Kainic acid （ KA） into the rat hippocampus，and BBR groups received intraperitoneal injection of BBR of corresponding dose at 48 h，24 h before operation and 6 h after operation． The latency period of epileptic seizure and the seizure severity were observed in each group． After 24 h of operation，the expressions of P-gp and nuclear factor-κB （ NF-κB） p65 in hippocampus CA3 area of each group were detected by immunohistochemisty method，and the results were compared． Results The epileptic seizure latency and the time from the first to 6th≥Ⅳgrade seizure in BBR 20 mg / kg group ［（ 66． 11 ± 5． 90） min，（ 26． 67 ± 6． 67） min］ and BBR 40 mg / kg group ［（ 76． 33 ± 9． 11） min，（ 42． 00 ± 7． 73） min］ were significantly longer than that in EP group ［（ 41． 78 ± 10． 45） min，（ 9． 44 ± 4． 25） min］（ all P ＜ 0. 05） ． There were significantly differences of total difference s among the groups （ H = 16． 024，H = 21． 830； all P ＜ 0. 01） ． The expressions of NF-κB p65 and P-gp in hippocampus CA3 area of EP group were significantly higher than sham group （ all P ＜ 0. 05 ） ； and the expression of P-gp and NF-κB p65 in BBR 20 mg / kg group and BBR 40 mg / kg group were significantly lower than that in EP group （ all P ＜ 0. 05） ． Conclusions BBR can prolong the epileptic seizure latency and reduce the seizure severity，and it also can inhibit the expression of NF-κB and P-gp in the epileptic rat's brain tissue．
min］（ 均P ＜ 0. 05） 。各组大鼠海马 CA3 区 NF-κB p65 和 P-gp 表达的差异均有统计学意义（ H = 16． 024，H =
21. 830； 均P ＜ 0. 01） 。癫痫组海马 CA3 区 NF-κB p65 和 P-gp 表达显著高于假手术组（ 均P ＜ 0. 05） ； BBR 20
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J Clin Neurol，June 2013，Vol． 26，No． 3
1 材料与方法
1． 1 材料 清洁级健康雄性 SD 大鼠 44 只，质量 （ 260 ± 10） g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公 司［许可证号： （ 沪） 2007-0005］； 随机分为假手术组 （ n = 8） 、癫痫组（ n = 9） 、BBR 10 mg / kg 组（ 10 mg 组， n = 9） 、BBR 20 mg / kg 组（ 20 mg 组，n = 9） 、BBR 40 mg / kg 组（ 40 mg 组，n = 9） 。大鼠饲养于南京医科大 学实验 动 物 中 心，普 通 环 境，室 温 18 ～ 24℃ ，湿 度 60% ，光照射时间为 12 h / d，自由摄取水和食物。实 验前，动物至少在新环境中饲养 1 周。 1． 2 方法 1． 2． 1 癫痫模型制作 采用海马微量注射海人酸 （ KA） 方法制作癫痫模型。将大鼠麻醉后，俯卧位固 定于立体定向仪上，选择左侧海马 CA3 区为靶点，前 囟后 5． 0 mm、正中线左侧 5． 0 mm 处钻孔。癫痫组 及各 BBR 干预组将预先装有 3 μl （ 0． 5 μg / μl） KA （ 美国 Sigma 公司） 的微量注射器沿钻孔进针（ 深度 5． 0 mm） 注射，假手 术 组 同 样 方 法 注 射 生 理 盐 水 3 μl。BBR 干预组大鼠于术前 48 h、24 h 及术后 6 h， 腹腔 注 射 相 应 剂 量 BBR （ 美 国 Sigma 公 司，批 号 070M1439V） ，假手术组和癫痫组给予等体积的生理 盐水。根据 Racine［8］的标准对大鼠的癫痫发作程度 进行评定，注药后 6 h 内达到Ⅳ级发作为造模成功； 6 h 内未达点燃标准的大鼠重复上述操作。对于发作 持续超过 90 min 者给予水合氯醛腹腔注射，以减少 死亡率。 1． 2． 2 癫痫发作易感性及严重程度评价 （ 1） 癫痫 发作易感性： 以大鼠注射 KA 后至初次Ⅳ级痫样发作 的时间作 为 癫 痫 发 作 的 潜 伏 期，评 价 癫 痫 发 作 易 感 性； （ 2） 癫痫发作严重程度： 以大鼠初次至第 6 次≥ Ⅳ级痫样发作的时间为评价标准，时间越短表示发作 程度越严重。 1． 2． 3 NF-κB p65 和 P-gp 表达检测 各组大鼠造 模成功 24 h 后，经 心 脏 灌 注 处 死，迅 速 取 脑，放 入 10% 中性甲醛缓冲液中继续固定 24 h，取视交叉后 2 mm 处脑组织冠状层面切片取材。常规石蜡包埋，连 续切 片，片 厚 4 μm。对 相 邻 两 张 切 片，分 别 进 行 NF-κB p65 和 P-gp 免疫组织化学染色。操作按非生 物素广谱二抗试剂盒（ 上海长岛生物技术有限公司， 编号 D-3004） 推荐的 EnVision 方法进行，其中人抗鼠 NF-κB p65 单克隆抗体（ Santa Cruz，编号 A0411） 稀释 浓度 为 1 ∶ 100，鼠 P-gp 单 克 隆 抗 体 C219 （ 英 国 Abcam 公司，编号 ab3364） 稀释浓度为 1∶ 50。根据王 平宇等［9］《大 鼠 读 片 提 要 及 图 谱 》，选 择 左 侧 海 马 CA3 区为观察区，用莱卡医学图像采集分析系统 （ 德