溶菌酶的种类及其作用机理比较
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溶菌酶溶菌酶溶菌酶( Lysozyme,E.C.3.2.17),全称为1,4-p -N -溶菌酶,又称为细胞壁溶解酶,是自然界普遍存在的一种酶,因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。
(一)溶菌酶的结构及物理化学性质溶菌酶易溶于水,遇碱易破坏,不溶于丙酮、乙醚,是一种白色、无臭的结晶粉末。
相对分子质量为14.7ku,由129个氨基酸残基组成,碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高,含有4个二硫键,如图2 -24所示,其等电点为10~11。
在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h,当温度较低时保持时间更长,利于溶菌酶在体内发挥作用。
禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源,蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。
溶菌酶由两个区域组成,由一个长的α螺旋所联接,其二级结构大多是α螺旋。
N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成,大多数是反平行的β折叠。
第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。
分子中的这两个区域被一个螺旋体(f87天冬氨酸- 114精氨酸)所分离,分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构,对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。
表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性特性数值相对分子质量14 400亚基数 1氨基酸129等电点10.7二硫键数 4碳水化合物所占比例0E1%280nm 26.493℃时的D热值(每分钟破坏90%的活性)110酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解(二)溶菌酶的来源溶菌酶在自然界中普遍存在,在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中,均发现有溶菌酶存在,其物化性质基本相似,溶菌酶的来源如表17 -2所示。
溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中,尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。
禽蛋中异常丰富,占整个蛋清中的 3.5%,鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。
表17 -2溶菌酶的来源溶菌酶的来源溶菌酶的含量鸡蛋清 2 500 ~ 3 500μg/mL鸭蛋清 1 000 ~ 1 300μg/mL鹅蛋清500 ~ 700μg/mL眼泪 3 000 ~5 000μg/mL人乳55~ 75 μg/mL牛奶10~ 15μg/mL脾脏50 ~ 160μg/kg胸腺60~ 80μg/kg胰腺20~ 35μg/kg花椰菜汁25~ 28μg/mL木瓜汁8~ 9μg/mL卷心菜汁7~8μg/mL(三)溶菌酶的溶菌机制溶菌酶是一种糖苷水解酶,专门作用于微生物细胞壁,可以破坏组成微生物细胞壁的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键,其作用机理见图17 -1。
溶菌酶作用机理范文溶菌酶是一类具有溶解细菌细胞壁的酶,广泛存在于许多生物体中,包括人类、动物和细菌等。
它们是一种非特异性酶,能够降解各种不同类型的细菌细胞壁,对于防御和清除细菌感染至关重要。
溶菌酶通过破坏细菌细胞壁来诱导溶菌,从而导致细菌死亡。
溶菌酶可以作用于细菌细胞壁的主要成分,即胞外多糖网,其中包括纤维素、胆固醇、脂蛋白等。
溶菌酶通过特定的机制作用于细菌细胞壁,实现细菌死亡的目的。
溶菌酶大致可以分为两类,即内切型和外切型溶菌酶。
内切型溶菌酶通过将细菌细胞壁的多糖链切断,使得细菌细胞壁的强度降低,细胞壁变薄,从而导致细菌死亡。
外切型溶菌酶与细菌细胞壁结合后,结合蛋白将细菌细胞壁破坏,导致细胞壁的裂解,最终引起细菌死亡。
具体来说,溶菌酶作用于细菌细胞壁的机制包括以下几个方面:1.酶和细菌细胞壁的结合:溶菌酶通过结合到细菌细胞壁上的底物上,实现对细菌的精确作用。
这一步骤通常是通过溶菌酶的结构域与细菌细胞壁上的特定底物进行识别和结合。
2.切断多糖链:当溶菌酶与细菌细胞壁结合后,酶会将细菌细胞壁中的多聚糖链切断。
这些多聚糖链是细菌细胞壁的重要组成部分,主要由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰穌氨酸组成。
溶菌酶通过切断细菌细胞壁中这些多聚糖链,导致细菌细胞壁的完整性破坏。
3.细菌细胞壁的溶解:溶菌酶的作用会导致细菌细胞壁的裂解和溶解。
这是由于细菌细胞壁的完整性依赖于多聚糖链的交联和分子间作用力。
一旦这些多聚糖链被切断,细菌细胞壁就会无法维持自身的完整性和稳定性,从而导致细菌细胞壁的破坏和裂解。
总的来说,溶菌酶通过与细菌细胞壁结合,并切断多聚糖链,导致细菌细胞壁的破坏和裂解,从而引起细菌死亡。
这一机制是一种高效的细菌防御机制,可用于治疗细菌感染和研究细菌细胞壁的结构和功能。
需要注意的是,溶菌酶作为一种非特异性酶,对细菌细胞壁有广泛的作用,但它在不同细菌中的作用机制可能略有差异。
此外,溶菌酶的活性和作用机制也受到多种因素的调节,包括温度、pH值以及溶菌酶与细菌细胞壁之间的特异性相互作用等。
溶菌酶作用机理
1.溶菌酶:是催化某些细菌细胞壁水解、从而溶解其细胞壁的酶,主要存在于鸡蛋清及动物的眼泪中。
2.细胞壁多糖:是N-乙酰氨基葡萄糖(NGA)-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)的共聚物,其中的NGA及NAM通过?-1,4糖苷键而交替排列:
3.溶菌酶的结构:由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质,含有四对二硫键,一级结构如图所示
4.溶菌酶的催化作用:为葡糖苷酶,能水解NAM的C1与NAG的C4之间的糖苷键,但不能水解NAG的C1 与NAM的C4之间的糖苷键,水解作用如下:
5.溶菌酶的三维结构:溶菌酶分子内部几乎是非极性的,在分子的表面有一个较深的裂缝,恰好能容纳多糖底物的六个单糖(ABCDEF环),是溶菌酶的活性部位,其中白色所示的是活性部位的Glu35和Asp52。
6.溶菌酶与底物的复合物的三维结构:
7.溶菌酶-底物结合部位示意图:NAG多聚体水解速率表明从5到6聚体增加到最大,活性部位的裂缝正好被六个糖残基所装满,水解部位是D和E之间的糖苷键
8.溶菌酶与底物的复合物的三维结构示意图:第四个糖残基D环由于空间的原因必须由正常的椅式变形为能量较高的半椅式,因此降低了糖苷键的稳定性容易断裂。
9.溶菌酶催化作用机制要点总结:
(1)Glu35的-COOH提供一个H+到D环与E环间的糖苷键O原子上。
H+的转移使D环的C1键与糖苷键O原子间的键断开,并形成正碳离子过渡中间产物。
(2)含有E及F残基的NAG二聚体离开酶分子。
(3)正碳离子中间产物进一步与来自溶剂的OH-发生反应, Glu35质子化,酶游离出来。
溶菌酶----新型免疫抗菌抗病毒药物、饲料添加剂溶菌酶研发背景:抗生素是人类应用最广泛的抗菌药物,不仅用于临床,也广泛用于畜禽饲养和农业方面。
在过去的50多年中,由于饲用抗生素在养殖中的长期使用导致大量耐药菌株的产生,且病原菌抗药性逐年增强,致使疗效下降,剂量提高,造成动物疾病越防越难防,越治越难治,给养殖业造成很大的损失和危害。
同时也给全人类的健康造成严重的影响。
因此,世界卫生组织于1994年就细菌耐药性的监测结果给全世界提出了警示:细菌对抗生素产生的耐药性正在以惊人的速度增加,而现在的抗生素药物正在失去原来的疗效。
因此寻求广谱、高效的新一代饲用抗菌药物已成为迫在眉睫的摆在人类面前的课题。
澳大利亚昆士兰大学医学系博士生导师、高级研究员王雯禾博士(1993年毕业于英国剑桥大学达尔文学院获微生物营养学博士学位),一直致力于生命科学的研究和发展,历经十多年的研究发现:酶广泛存在于生物体内,参与新陈代谢等多种生理功能,其中对微生物细胞壁具有水解功能的抗菌酶,如溶菌酶lysozyme能够溶解微生物细胞壁而使微生物死亡,而且溶菌酶lysozyme在人和动物的唾液、眼泪、乳汁以及肌体组织中大量存在,是人和动物自身重要的免疫因子,与人和动物的健康息息相关。
溶菌酶lysozyme的溶菌(杀菌)作用与传统的抗生素药物相比,具有对某一病原菌所有血清型都有效的优点,克服了一种抗生素只能预防一种或其中一种血清型病原菌的不足,更不存在药物残留和耐药性的问题。
王雯禾博士认为,溶菌酶lysozyme作为畜禽、水产饲料添加剂在替代抗生素,控制耐药菌,生产绿色肉蛋奶食品方面是最佳的选择。
并多次鼓励和支持国内年轻的科学家、学者,致力于这一伟大的、划时代的、对全人类的健康有杰出贡献的产品的开发和研究。
并于2003年10月推出最早用于防治动物疾病的产品--溶菌酶系列,由于它不但能溶解(杀死)细菌,增强动物的免疫能力,而且还能和病毒结合使病毒失活,所以它作为预防动物疾病的新型饲料添加剂,正在动物疾病防治的许多领域被广泛应用。
关于溶菌酶(一)
溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶,又称胞壁质酶。
它是正常机体免疫防御机制的组成部分。
在人体内,它存在于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞内;也存在于黏膜分泌液中,成为体表防御因素之一。
主要通过破坏细胞壁中相关的化学键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、某些蛋白形成复盐,使病毒失活。
因此,该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
溶菌酶的分布与结构:
溶菌酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶,其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸,有4对二硫键维持酶构型,是一种碱性蛋白质,其N端为赖氨酸,C端为亮氨酸。
溶菌酶的作用机理:
溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖,肽聚糖是细菌细胞壁的骨架,其中任何化学键在溶菌酶作用下断裂,皆能导致细菌细胞壁的损伤。
对于革兰氏阳性菌,如:枯草杆菌或溶壁微球菌等,与革兰氏阴性菌,如:大肠杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等均有抑菌作用。
溶菌酶溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。
因此,该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
1简介中文名称:溶菌酶中文同义词:脆壁质酶;鸡蛋白;胞壁质酶(N-乙酰胞壁质聚糖水解酶);溶菌酶(鸡蛋清)英文名称:Lysozyme,简称LZM英文同义词:REDUCED LYSOZYME,WATERSOLUBLE;MUCOPEPTIDE-GLYCOHYDROLASE;MUCOPEPTIDE GLYCOLHYDROLASE;MUCOPEPTIDEN-ACETYLMURAMOYLHYDROLASE;MUCOPEPTIDEN-ACETYLMURAMOYLHYDROLASE GRADE III;MUCOPEPTIDEN-ACETYLMURAMOYLHYDROLASE GRADE VI:CHLORIDE;MURAMIDASE;MURAMIDASE GRADE III[1]CAS号:12650-88-3EINECS号:235-747-3[2]分子式:无分子量:14000左右EINECS号:235-747-3相关类别:发酵剂;Enzymes;酶;生化试剂;生物化学品。
分子结构图:2性质储存条件:2-8°Cform:powdercolor:white危险品标志B安全说明23-24/25-22WGK Germany3RTECS号OL5989850F3-10白色或微白色冻干粉,溶于水,不溶于乙醚和丙酮,pI为11.0-11.35,最适pH 值6.5。
溶菌酶作用机理溶菌酶是一类能够溶解细菌细胞壁的酶,具有很强的杀菌作用。
它主要通过与细菌细胞壁的主要组成成分—大分子糖肽复合物的水解作用来发挥其作用。
溶菌酶作用机理主要包括结构选择性和酶活选择性两个方面。
首先,溶菌酶的作用是有结构选择性的。
细菌细胞壁是由大分子糖肽复合物组成的,其中主要包括聚肌醇糖、N-乙醯葡萄糖胺及葡萄糖醛酸等多种成分。
溶菌酶通过对细菌细胞壁的特定部位进行水解作用,导致细菌细胞壁的结构破坏而达到溶解的效果。
溶菌酶结合在细菌细胞壁的特定结构上,如肽聚糖链、肽交联环和醛酸共轭链等,形成溶菌酶-底物复合体。
然后,溶菌酶在底物分子的固定位点进一步降解底物链,从而破坏细菌细胞壁的完整性。
其次,溶菌酶的作用是有酶活选择性的。
溶菌酶在与细菌细胞壁特定结构结合形成复合体后,通过特定的底物结合位点和催化位点对底物进行水解。
溶菌酶能够选择性地加水分解β-1,4-糖肽键,使细菌细胞壁的肽聚糖链断裂。
另外,溶菌酶还可以选择性地水解膜少肽、β-1,6-糖肽键、肽交联环等,进一步破坏细菌细胞壁的完整性。
溶菌酶的这种酶活选择性是由其在底物特定结构上形成的氢键、静电作用、范德华力等多种相互作用力所决定的。
此外,溶菌酶除了直接对细菌细胞壁产生溶解作用外,还能够间接地增强机体的免疫能力。
溶菌酶在其水解过程中会产生一些抗菌肽,如β-defensin、LL-37等,这些抗菌肽具有直接抑制细菌生长的作用。
此外,溶菌酶还具有一定的免疫调节作用,能够增强机体的免疫应答能力,促进巨噬细胞吞噬和清除被破坏的细菌等。
总结起来,溶菌酶通过结构选择性和酶活选择性的作用机制,能够选择性地破坏细菌细胞壁的结构,达到溶解细菌的效果。
溶菌酶的这种抗菌作用在医药、食品等领域具有重要的应用价值。
溶菌酶结构特点及分离纯化的研究摘要:本文对溶菌酶的结构特点和作用机制做了简单介绍,并对近年来溶菌酶分离纯化的方法,如结晶法、离子交换法、亲和层析法、膜处理技术、反胶团萃取法等进行了综述。
关键词:溶菌酶、结构特点、作用机制、分离纯化1 前言溶菌酶(1ysozyme;EC3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
人们对溶菌酶的研究始于本世纪初,英国细菌学家弗莱明(Flem ing)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
在自然界中,溶菌酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁体液、木瓜、大麦、无花果和卷心菜等植物中以及微生物中也含此酶[1],其中以蛋清含量最为丰富,约0.3%[2]。
2 溶菌酶的结构特点和作用机制2.1 溶菌酶的类型溶菌酶按其所作用的微生物不同分为两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
细菌细胞壁溶菌酶有两种,一种是作用于β-1.4糖苷键的细胞壁溶解酶,另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。
真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶[3]。
2.2 溶菌酶的结构鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶,它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,在分子中的4对含硫氨基酸Cys间形成4个S-S键。
Phillips 等人1956年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构,溶菌酶分子近椭圆形,大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm,其构象复杂,α螺旋仅占25%,在分子的一些区域有伸展着的β片层结构,研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用,其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,这是溶菌酶的活性部位。
溶菌酶杀菌原理
溶菌酶通过破坏细菌细胞壁,打破其完整性,干扰细菌的正常生理功能,最终导致细菌死亡。
溶菌酶作用于细菌细胞壁的主要机理有3种:
1.破坏糖胺聚糖链:细菌细胞壁的主要成分是由多种糖胺聚糖链交织形成的。
溶菌酶能够切断这些糖胺聚糖链,导致细菌细胞壁的损伤和破裂。
2.扰乱细菌细胞壁结构:溶菌酶可以使细菌细胞壁的结构发生变化,破坏细菌细胞壁的完整性。
这会导致细菌细胞内部的物质外泄,导致细菌死亡。
3.促进水分进入细菌细胞:溶菌酶能够通过破坏细菌细胞壁,使细菌细胞内部暴露在外界环境中,从而增加了细菌细胞吸收水分的能力。
细菌在水分过剩的环境中会破裂,导致细菌死亡。
溶菌酶作用机理
溶菌酶是一种能够分解细菌细胞壁的酶类物质,它在生物体内具有重要的生理功能。
溶菌酶主要作用于革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌的细胞壁,可以使细胞壁发生裂解,从而导致细菌死亡。
溶菌酶的作用机理主要包括以下几个方面:
1.针对革兰氏阳性菌
对于革兰氏阳性菌来说,其细胞壁主要由多糖和肽聚糖组成。
溶菌酶能够针对肽聚糖进行水解反应,从而破坏了肽聚糖之间的交联结构,使得细胞壁发生裂解。
2.针对革兰氏阴性菌
对于革兰氏阴性菌来说,其外层膜主要由脂多糖组成。
溶菌酶能够通过与脂多糖结合,并且通过改变其空间构象来使得外层膜发生裂解。
3.与其他抗微生物物质协同作用
除了直接对细菌细胞壁进行分解外,溶菌酶还可以与其他抗微生物物
质协同作用,如抗生素、免疫球蛋白等。
这些物质能够增强溶菌酶的
杀菌效果,并且减少细菌对这些物质的耐药性。
4.参与免疫反应
溶菌酶也是人体免疫系统中的重要成分之一。
在机体受到感染时,溶
菌酶能够通过激活补体系统来参与免疫反应,并且能够引起炎症反应,从而促进机体对抗感染。
总之,溶菌酶是一种重要的抗微生物物质,在人体内具有多种生理功能。
其作用机理主要包括针对革兰氏阳性菌和阴性菌的不同分解方式、与其他抗微生物物质协同作用以及参与免疫反应等方面。
因此,在医
学和生命科学领域中,溶菌酶被广泛地应用于治疗感染性疾病和开发
新型药物等方面。
溶菌酶家族在生物学中的作用和研究进展溶菌酶家族是一组酶,它们的主要功能是在生物体内分解细菌细胞壁,起到防御和保护作用。
它们在生物学中的作用和研究进展也越来越受到关注。
一、溶菌酶家族的作用溶菌酶家族是一类分泌性酶,主要作用于革兰氏阳性细菌和某些链球菌细胞壁中的N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰穿梭肽。
溶菌酶家族酶分解上述结构后,破坏了革兰氏阳性菌细胞壁的完整性,导致细菌细胞死亡。
除了细菌,溶菌酶家族还有一些其他的生物学功能。
在鱼类鳃和两栖动物皮肤中,它们被发现能够消灭寄生虫。
另外,在植物中也有类似的酶,起到类似的作用。
其它生物向环境释放溶菌酶家族酶的作用还在不断发现中。
二、溶菌酶家族的研究进展溶菌酶家族的研究主要集中在酶的酶学性质、基因调控、具体作用机制等方面。
以下是几个有代表性的研究进展。
1. 酶学性质在2006年,研究人员发现了一种新的溶菌酶家族酶——LysK。
LysK的特点是能够溶解大约98%的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S. aureus),并且与已知的溶菌酶家族酶的序列异构性非常大。
2. 基因调控研究表明在许多情况下溶菌酶家族酶是由细菌产生的,其产生数量的多少很大程度上取决于细菌环境的变化。
其中,细菌的自我毁灭策略是一个重要的因素之一。
例如,在噬菌体感染细菌的过程中,溶菌酶家族酶被激活并释放,从而破坏细菌细胞壁,使噬菌体释放。
3. 具体作用机制越来越多的研究表明,溶菌酶家族酶的作用机制比过去曾经认为的更加复杂。
其中,一些研究表明,细菌表面的受体可以增强溶菌酶家族酶的活性,并将其锁定在细胞的特定部位。
三、溶菌酶家族在医疗和生物技术中的应用溶菌酶家族在医疗和生物技术领域中具有很大的潜力。
以下是几个例子。
1. 抗菌在抗菌领域,溶菌酶家族酶的作用在新药研究中被广泛探讨。
以一些细菌的靶标性质为基础,研究人员已经发现了很多有效的、溶菌酶家族酶类的替代物,这些替代物可以通过定向结构好,活性强但是易于在细胞中储存的新颖的工程构建策略予以制备,从而具有更好的生物利用度。
溶菌酶的作用机理
1922年,英国细菌学家A. Fleming发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶解作用,就命名为溶菌酶。
溶菌酶(lysozyme)是一种能特异性地水解细菌细胞壁肽聚糖的糖苷水解酶。
是一种碱性、安全绿色的小分子蛋白质,已知在人的眼泪、鼻黏液、唾液、乳汁等分泌液中及肝、肾、淋巴组织含有此酶。
细菌细胞壁主要成分是肽聚糖(Peptidoglycan),又称粘肽(Mucopetide)。
细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在,溶菌酶主要作用于细胞壁的骨架物质肽聚糖部分,肽聚糖是由NAG和NAM以β-1,4糖苷键连接起来的多聚体,并通过连接NAM上的短肽链之间的肽键使聚糖部分交联成网状,以维持细胞结构的稳定性。
溶菌酶发生作用后,由于骨架物质的裂解,细胞壁结构发生坍塌、脱落,细菌细胞即形成原生质体结构,该结构受到内外渗透压变化影响较大,很容易造成胞内物质泄漏,最终导致菌体细胞破裂、溶解,直至死亡。
卵清溶菌酶是一种无毒性的蛋白质,能选择性地使对象微生物细胞壁溶解,而对其它物质无反应。
溶菌酶综述耿红健基础药学基地班09104103溶菌酶分离提纯、纯度鉴定以及活力测定综述耿红健基础药学基地班 0910103溶菌酶简介溶菌酶名称起源于1922 年,Alexander Fleming 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,就命名为溶菌酶。
此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶马等动物乳汁中,也可以从番木瓜、无花果、大麦、卷心菜等植物中可分离菌酶的存在。
溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的外分泌液中,可以从牛、羊、出溶菌酶,其中蛋清溶菌酶含量最丰富,约为0.3%~0.4% 。
溶菌酶是一种碱性球蛋白,其分子由129个氨基酸组成,2200个原子,分子量14388-18000(14388、14500、18000),等电点为10.7-11.0,分子内有4个二硫键交联,化学性质非常稳定,对热也极为稳定,Sbaharu等报告牛奶中的溶菌酶分子量为18000,一级结构尚未清楚。
人乳中的溶菌酶和a-La的一级结构有74%是相同的。
Ⅱ一La是人乳中含量较多的蛋白质。
它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的.是乳糖合成酶的辅酶。
溶菌酶和d-La在生物学上是同源的,但它们的三级结构有很大的区别。
它可溶解许多细菌的细胞膜.使细胞膜的糖蛋白类多糖发生加水分解作用。
分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸较高,如色氨酸的比例较高。
酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸,溶菌酶通过其肤键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成徽生物细胞壁的N_一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁质酸间的B一(1,4)糖苷键,使菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌(尤其是球菌)的目的。
此外,溶菌酶的最适温度为50度,最适Ph为6,溶菌酶具有热稳定性,100摄氏度保持十分钟仍具有活性。
溶菌酶是动物自身的重要免疫因子,是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶。
具有杀菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进有益菌繁殖等作用,并具有对人禽无毒、无药害残留、无副作用等优点。
溶菌酶的种类及其作用机理比较 摘要:溶菌酶是一类对细菌细胞壁有水解作用的无毒、无害的蛋白质。本文简单介绍了溶菌酶的结构、性质、来源及发展,并对各种不同种类的溶菌酶及其作用机理进行了比较综述。 关键词:溶菌酶、作用机理、动物源溶菌酶、植物源溶菌酶、微生物源溶菌酶 1 溶菌酶的结构及性质[1] 溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)又称胞壁质酶或N一乙酸胞壁质聚糖水解酶。是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存, 其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末,无嗅,味甜,易溶于水。不溶于丙酮、 乙醚[1] 。 Phillips等人1965年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构 ,溶菌酶分子近椭圆形,大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm,其构象复杂ɑ-螺旋仅占25%,在分子的一些区域有伸展着的片层结构,研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用,其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,这是溶菌酶的活性部位。 2 溶菌酶的来源及发展[2] 溶菌酶广泛分布于自然界各种生物体中 。它的研究最早起源于Nicolle(1907)发表的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)溶解因子。1909年Laschtschenko指出,鸡蛋清的强抑菌作用是由于酶的作用。1922年,Fleming发现,人的鼻涕、唾液、眼泪等也有强的溶菌活性并将其溶菌作用因子命名为溶菌酶lysozyme)。从此,便开始了对溶菌酶的研究,并不断有新的进展。 1959-1963年,Salton等人通过大量研究弄清了溶菌酶是一种能够切断N-乙酰壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间β-1,4糖甘键的酶。1967年,英国菲利 普集团发表了对鸡蛋清溶菌酶-作用底物复合体X-射线衍射的研究,介绍了其触媒的结构,成为近代酶化学研究中重大的成果之一。1960年以后,有关微生物的溶菌酶的研究进展很快,溶菌酶已成为研究细胞壁结构的一种非常有力的工具酶,不仅有助于人们对细胞壁细微结构的认识,而且大大促进了对新的溶菌酶的开发研究。随着研究的不断深入,发现溶菌酶不仅有溶解细菌细胞壁的种类,还有作用于真菌细胞壁的种类,同时对其作用机制也有了更进一步的了解。 3 溶菌酶的种类及其各自的作用机理 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶,此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在,根据来源不同,其作用机制也不同,将溶菌酶分为以下三类[1]。 3.1 动物源溶菌酶 动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶(HEWL)是目前研究和应用最鸡蛋清溶菌酶是动物源溶菌酶的典型代表,也是目前研究得最深最透的一类溶菌酶。 在鸡蛋清中溶菌酶含量大约2%~4% ,等电点在pH10.8左右,分子量为14000,能溶解溶壁小球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰氏阳性细菌,对革兰氏阴性细菌无分解作用。溶菌机理相当复杂,其最适作用温度为50℃,化学性质很稳定,pH在1.2~11.3之间变化不会影响酶结构太大的改变,遇热该酶也很稳定。pH4~7的范围内,酶在100℃处理1min仍有近100%的活力,但在碱性环境条件下,酶稳定性较差。鸡蛋清溶菌酶由129个氨基酸组成,维持其稳定性的结构主要由4个二硫键、氢键及疏水键等[1]。 以多种常见标准菌株、临床致病菌等作为检测指示菌,研究表明[3]:鸡蛋清溶菌酶能分解藤黄微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌 ,但对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠埃希菌等革兰氏阴性菌等无分解作用,只有与其它物质(如: 甘氨酸等)混合作用才表现一定的杀菌效果。 因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞质壁和磷酸质组成的,其中的主要成分胞质壁又是由杂多糖与多肽组成的糖蛋白,而这种杂多糖正是由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基脱氧葡萄糖以β-糖苷键连结的;而溶菌酶能水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-糖苷键,使细胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽 ,导致细胞壁破裂,内容物逸出而使细菌溶解。另外革兰氏阳性菌由脂多糖、磷脂、糖脂组成的外膜覆盖,所以溶菌酶对它们作用较强。 对金黄色葡萄球菌不起作用主要原因是金黄色葡萄球菌细胞壁的胞壁酸的第 6 位已被 O-乙酰化 ,并生成 6- O-二乙酰胞壁酸 ,并且其细胞壁的四缩氨酸几乎全部通过戊氨基乙酸进行交联 ,从而形成高密度的网孔结构。 另外Morrison[4] 等认为革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的脂多糖对蛋清溶菌酶有很强的亲和性 ,从而阻止溶菌酶的渗透 ,使蛋清溶菌酶不能分解革兰氏阴性菌。 3.2 植物源溶菌酶 目前发现含溶菌酶的植物有近170种,目前,已经从木瓜、芜菁、无花果等植物体内分离得到溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大,约为24000-29000个单位。 其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3。但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍左右。比较其理化性质,植物溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶有所不同, 如: 木瓜、无花果和橡胶溶菌酶的相对分子质量分别为28、29、36; pI值分别为10.5、9.0、9.0; 最适pH 分别为4.5、4.6、5.0。而HEWL的相对分子质量、pI值和最适pH值分别为13.7、11.0和6.2[5]。植物溶菌酶活性与HEWL也不相同:,以溶壁微球菌 为底物时, HEWL的活性高而植物溶菌酶活性低; 以N-乙酰葡萄糖胺多聚体和甲壳质为底物时, 植物溶菌酶活性高而HEWL低。 以采用植物源溶菌酶-萝卜溶菌酶[6]为例,对一些革兰氏阳性菌(白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌)、革兰氏阴性菌(普通变形菌、大肠杆菌 、鼠伤寒沙门氏菌 、多杀巴斯德氏杆菌、雏白痢沙门氏菌 、产气杆菌)和真菌(酿酒酵母 、总状毛霉 、黑根霉、黑曲霉 、青霉)以及植物病原菌的抑菌效果进行了研究。结果表明:萝卜溶菌酶对3种革兰氏阳性菌、6种革兰氏阴性菌、5种真菌以及6种植物菌都有一定得杀菌效果。 与鸡蛋清溶菌酶作用相比,分析其原因[7],萝卜溶菌酶对金黄色葡萄球菌有抑制作用,推测其具有N,O-二乙酰胞壁质酶活性,能水解金黄色葡萄球菌细胞壁中的缩氨酸聚糖,因而能对金黄色葡萄球菌细胞壁有作用,此外,萝卜溶菌酶可能与革兰氏阴性菌外层成分的脂多糖无亲和性,因而能很好的水解革兰氏阴性菌细胞壁,抑制其生长。但是其具体的作用机理还有待进一步的研究与论证。 3.3微生物源溶菌酶 人们在20世纪60年代发现某些微生物也能产生溶菌酶。目前微生物产生的溶菌酶大体上分以下5种[8]: (1)内N-乙酰己糖胺酶,类似于鸡蛋清溶菌酶,主要破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖甘键。 (2)酰胺酶,主要作用于细菌细胞壁肽聚糖中N- 乙酰胞壁酸(NAM)与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键。 (3)内肽酶,使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。 (4)β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶主要用于分解酵母细胞的细胞壁。 (5)壳多糖酶,这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶。 以采用微生物源溶菌酶- MML[7]为例,以多种常见标准菌株、临床致病菌和养殖常见致病菌作为检测指示菌 ,采用倍比稀释法测定 MML 对这些菌株的抑菌及杀菌作用。结果表明:MML 有较宽的抑菌谱 ,对革兰阴性菌(大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌等) 、革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等)、真菌(白色念珠菌)都有不同程度的抑制作用,对临床分离的多种致病菌(肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等)和常见致病菌(鸡大肠埃希菌、鳗弧菌、副溶血弧菌等)都有较强的杀灭作用。 分析其作用机理主要有以下两种:一种是 MML 水解细胞壁中的糖苷键 ,破坏了细胞壁结构使细胞壁出现部分缺失 ,形成了L 型细菌 ,失去了对细胞的保护作用 ,细胞质解体出现空腔;另外一种作用是 MML 通过渗透进入细胞内吸附细胞内带有阴离子的细胞质 ,并发生絮凝作用 ,扰乱细胞正常的生理活动 ,从而杀灭细菌[9]。 MML 对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌株的作用结果有所不同 ,主要是因为这两种细菌的细胞壁结构不同 ,MML 的两种作用对其影响程度也不同。对 于大肠埃希菌 ,前面一种作用占主要地位 ,虽然细胞质出现凝集 ,但是由于细胞壁较薄 ,部分水解就使其失去了对细胞的保护作用,细胞质解体出现空腔造成细菌死亡;而对于金黄色葡萄球菌后者占主要地位 ,金黄色葡萄球菌细胞壁较厚 ,细胞壁的部分缺失并没有对其细胞壁的保护作用造成很大的影响 ,未出现空腔现象 , MML 对金黄色葡萄球菌的抑菌机理主要是通过渗透作用进入细胞内发生絮凝作用 ,吸附细胞质 , 导致出现了明显的深色成团物质,干扰细胞正常的生理活动造成细菌死亡[10]。 此外 ,MML对革兰阴性菌其作用,分析其原因,可能是外层成分的脂多糖无亲和性 ,因而能很好的水解革兰阴性菌细胞壁 ,抑制其生长。白色念珠菌属于真菌 ,其细胞壁主要成分为甲壳多糖 ,MML 之所以对其有明显的抑制作用 ,推测可能有两种原因:一是 MML 具有壳多糖酶或葡甘露糖酶活性 ,能够水解真菌细胞壁;二是与对金黄色葡萄球菌 MML 的作用机理类似 ,也是通过吸附细胞质成分干扰细胞代谢。和植物源酶作用机制一样,微生物源酶的具体作用机理也处于推测阶段,有待于进一步深入研究与论证。
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