溶菌酶酶活力测定

1. 掌握溶菌酶活力测定的原理和方法；2. 熟悉分光光度计的使用；3. 了解溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。

二、实验原理溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能够催化某些细菌（革兰氏阳性菌）细胞壁多糖水解的酶，从而溶解细菌细胞壁，起到杀菌作用。

测定溶菌酶活力时，可用细菌细胞壁作为底物，细胞壁溶解后，菌悬液浊度降低，通过分光光度法测定菌悬液浊度变化，计算溶菌酶活性。

三、实验材料与试剂1. 试剂：1. 1mol/L氢氧化钠溶液；2. 1mol/L盐酸溶液；3. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）：NaHPO·2H2O 0.392g，溶于蒸馏水并稀释至1000mL，调节pH至6.2；4. 牛肉膏培养基；5. 溶菌酶结晶标准品（酶活力单位为70000U/mg）。

2. 仪器：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 移液器；4. 电子天平；5. 烧杯；6. 漏斗；7. 移液管。

1. 准备实验试剂和仪器；2. 配制0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）；3. 将枯草杆菌制成菌悬液；4. 将溶菌酶标准品稀释成不同浓度；5. 分别取不同浓度的溶菌酶标准品和菌悬液，加入反应体系中；6. 在分光光度计上测定菌悬液在450nm波长下的吸光度值；7. 根据吸光度值和溶菌酶标准品浓度，绘制酶活力曲线；8. 测定待测溶菌酶样品的酶活力。

五、实验结果与分析1. 酶活力曲线：根据实验数据，绘制酶活力曲线，结果表明酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系。

2. 待测溶菌酶样品的酶活力：根据酶活力曲线，计算待测溶菌酶样品的酶活力。

六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了溶菌酶活力测定的原理和方法，熟悉了分光光度计的使用，并了解了溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。

实验结果表明，溶菌酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系，为后续相关研究提供了实验依据。

七、实验注意事项1. 实验过程中，注意控制反应体系的pH值，以保证溶菌酶活性；2. 使用分光光度计测定吸光度值时，注意选择合适的波长；3. 实验过程中，操作要规范，避免污染。

溶菌酶的测定方法溶菌酶（lysozyme）是一种广泛存在于生物界的酶类分子，能够切断细菌细胞壁的三葡聚糖链（N-醋酸氨基葡庚糖-N-乳酸氨基葡庚糖-β1,4-N-乳酸氨基葡庚糖）。

溶菌酶的测定方法可以从不同的角度进行，包括溶菌酶活性的测定、溶菌酶的产量测定以及溶菌酶在生物体内的测定。

一、溶菌酶活性的测定方法：1. 醋酸甲酯法：该方法通过测量溶菌酶对醋酸甲酯的水解产生的醋酸乙酯的量来间接测定其活性。

首先使用醋酸甲酯制备醋酸乙酯标准曲线，然后将酶样液和醋酸甲酯复合反应一段时间，加入硫酸中断反应，测定产生的醋酸乙酯的吸光度，并通过标准曲线计算出酶的活性。

2. 改良的漆酶法：该方法以溶菌酶对大肠杆菌产生的透明圈直径为基础，通过测量透明圈的直径或面积来间接测定其活性。

方法简单易行，主要用于溶菌酶活性快速筛选。

3. 电导法：该方法基于溶菌酶在水溶液中产生的游离离子影响电导率的原理。

通过将一定浓度的酶溶液加入含有特定离子的缓冲溶液中，测定加入酶溶液前后的电导差异，从而计算出酶的活性。

二、溶菌酶的产量测定方法：1. 透明圈法：该方法将溶菌酶产生菌株接种于含有含有菌斑形成的凝胶平板上，经过一定时间后，用碘溶液显色，可在平板上观察到菌株周围出现的透明圈，通过透明圈的直径或面积来判断酶的产量。

2. 血凝法：该方法使用牛血液和凝血酶来测定溶菌酶产量。

将溶菌酶产生菌株培养得到的培养基与牛血液相混合，通过观察血凝情况来判断溶菌酶产量的大小。

三、溶菌酶在生物体内的测定方法：1. 酶活测定：通过采集动物的血液、组织或细胞，制备相应的提取液，然后通过测定其对某种特定底物的酶活性来间接测定生物体内溶菌酶的水平。

2. 分子生物学方法：通过采用PCR扩增技术、核酸杂交等方法，检测生物体内溶菌酶基因的表达水平和突变情况，从而间接测定生物体内溶菌酶的含量。

总结起来，溶菌酶的测定方法可以根据需求选择。

溶菌酶活性的测定方法主要包括醋酸甲酯法、漆酶法和电导法；溶菌酶的产量测定方法主要有透明圈法和血凝法；溶菌酶在生物体内的测定方法包括酶活测定和分子生物学方法。

溶菌酶活性的测定方法一1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h，2000r/min离心10min，取上层血清备用；2.用0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)配制成一定浓度的菌悬液（O.D.570=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）；3.取3.0 mL该悬液于离心管中，再加入50μl血清混匀，570nm下测初始光密度值（A0）；4.然后将试液移于37℃水浴30 min；5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）；6.计算。

公式：U=(A0-A)/AU：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值方法二1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h，2000r/min离心10min，取上层血清备用；2.用0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)配制成0.2mg/ml的菌悬液；3. 3.0 mL该悬液于离心管中，再加入40μl血清混匀，540nm下测初始光密度值（A0）；4.然后将试液移于28℃水浴30 min；5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）；6.计算。

公式：U=(A0-A)/AU：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值方法三准确称取溶菌酶标准品，用pH 6.4，1/15 mol/L PBS配成1ug/mL，，临用时用PBS稀释成500，100，50，25，10 ug/mL标准液，用以制成标准曲线。

以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）冻干粉为底物，用1/15 mol/L，pH 6.4磷酸缓冲液配成一定浓度的悬浊液（用722型分光光度计于640 nm测定并调整其浓度为透光率达30％-40％）。

溶菌酶活力测定（艳红微球菌法）操作规程1.目的为保证溶菌酶活力测定（艳红微球菌法）的准确性，特制定本规程2.范围适用于溶菌酶活力测定（艳红微球菌法）测定3.责任相关检验人员对本规程负责4.规程1.溶壁微球菌的培养将溶壁微球菌菌种于LB平板上划线，28℃培养48h后挑取单菌落于100mL的LB液体培养基中，28℃,200rpm摇床培养48小时后，将菌液离心，4000rpm，10min，收集菌体，用无菌水反复洗涤，离心数次，将菌体干燥后置-20℃保存待用。

2.0.1mol/L，pH6.2磷酸盐缓冲液的配制2.1先称取磷酸氢二钾17.42g，蒸馏水溶解并定容至100mL，配制成0.1M的磷酸氢二钾溶液，称取磷酸二氢钾13.61g，蒸馏水溶解并定容至100mL，配制成0.1M的磷酸二氢钾溶液。

2.2分别取1M磷酸氢二钾19.2mL和1M磷酸二氢钾80.8mL，混匀，加蒸馏水定容至1L即制得0.1mol/L ，pH6.2磷酸盐缓冲液。

3.溶壁微球菌悬液的制备称取-20℃保存的干燥溶壁微球菌菌体1g左右，用约100mL 0.1mol/L ，pH6.2磷酸盐缓冲液悬浮菌体，充分混匀，使其A450在0.6~0.8之间（临用前配制）。

4.溶菌酶标准酶活的测定4.1酶活性定义：在25 ℃，pH值为6.2条件下，在波长450nm处，每分钟使吸收度下降0.001所需的酶量为1个活力单位。

4.2酶活力测定方法：精密量取室温下的底物（溶壁微球菌）悬液2mL，置1cm比色皿中，然后迅速量取供试品溶液0.1mL，加入上述比色皿中，盖下紫外分光光度装置盖子，开始计时，记下反应15s和75s时的光吸收度A450，计算二者差值即每分钟吸光度下降数△A450。

以空白培养基作为空白对照，同法操作，记下反应15s和75s时的光吸收度A450＇，二者差值记为△A450＇。

4.3酶活力计算公式：酶活（U/mL）=[（△A450－△A450＇）]×D×104D为稀释倍数。

溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定-22．加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。

3. 在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。

过大，会使填料压缩紧密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的活性变化。

对于CM Sepharose FF填料，最适流速在100cm/h以下。

因此，在我们的实验中，控制流速为2mL/min。

4．冲平过程一定不能省。

因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。

五、演示由于本实验装柱操作与实验一凝胶过滤层析的操作方法相同，所以演示略。

洗脱时，梯度混合器中高盐溶液与低盐溶液的放置。

依据洗脱目的进行。

如果是离子交换，采用低盐上样高盐洗脱的方式，就需要将低盐放置在靠近洗脱液出口的容器中。

如果是疏水层析，采取的是高盐上样低盐洗脱的方式，则将高盐溶液放置在靠近洗脱液出口的那个容器中。

注意老师的演示。

六、实验报告1．如实完整地记录实验流程、现象及结果；分析记录仪上所绘制的峰型与所分离的蛋白质纯度的关系。

2. 实验报告中必须包含原始数据以及洗脱曲线图（同组可以复印同一张图）本实验的数据处理：根据酶的动力学特性可知，在特定的时间段，酶促反应的速度是相等的，即产物浓度随时间成线性变化。

根据此特性，将所得数据在坐标纸上作图，以时间为横轴，OD595值为纵轴，将数据定位后，根据拟合直线的斜率，即为单位时间内OD值的下降值，然后再除以0.001，即可得到所取测量酶液的活力单位。

除以酶液体积，即可得到酶浓度（u/mL）。

溶菌酶活力单位(U)=△OD/0.001其中△OD为一分钟内OD值的下降值。

八、背景资料（一）离子交换树脂离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。

网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。

在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。

可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。

主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。

溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。

酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。

溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。

从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。

它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。

可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。

2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。

离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。

由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。

该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。

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溶菌酶的检测方法
溶菌酶的检测方法有以下几种：
1. 杀菌圈法：将溶菌酶溶液滴在琼脂平板上，使其扩散，形成杀菌圈。

观察杀菌圈的直径大小，可以用来评估溶菌酶的活力。

2. 比色法：利用碘化钾-淀粉复合体作为底物，将其与溶菌酶反应，溶菌酶降解淀粉，溶液变为无色。

通过比较反应前后的颜色差异，可以评估溶菌酶的活力。

3. 酶活测定法：利用溶菌酶对菌体产生的溶菌作用，测定菌体溶解所消耗的单位时间内的酶液量，以此来评估溶菌酶的活力。

4. 免疫检测法：利用免疫学原理，制备溶菌酶特异性抗体，通过抗体与溶菌酶的特异性结合，进行免疫检测。

常用的方法有ELISA、西方印迹等。

5. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：利用酶标抗体的特异性结合，对溶菌酶进行检测。

通过检测酶标抗体与溶菌酶结合产生的颜色反应强度来进行定量分析。

总的来说，溶菌酶的检测方法主要包括杀菌圈法、比色法、酶活测定法和免疫检测法。

不同的方法可以根据实际需求进行选择和应用。

一、实验目的1. 熟悉溶菌酶的提取、分离纯化方法；2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法；3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。

二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的胞壁质酶，能够特异性地水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质，从而破坏细菌细胞壁，导致细菌死亡。

本实验旨在通过提取、分离纯化溶菌酶，并对其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量进行测定。

三、实验材料1. 材料：鸡蛋、牛肉膏蛋白胨培养基、细菌培养液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝G-250染液等；2. 仪器：高速离心机、紫外分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统等；3. 试剂：氯化钠、氢氧化钠、醋酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠（SDS）等。

四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取（1）取新鲜鸡蛋，去壳，将蛋白与蛋黄分离；（2）将蛋白放入烧杯中，加入适量的氯化钠溶液，搅拌溶解；（3）将溶液过滤，得到滤液；（4）将滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，室温下放置1小时；（5）将溶液用醋酸溶液调节pH值至5.0，静置沉淀；（6）将沉淀用离心机离心（3000 r/min，10分钟），取上清液作为粗提液。

2. 溶菌酶的分离纯化（1）将粗提液用EDTA溶液处理，去除蛋白中的金属离子；（2）将处理后的溶液用磷酸缓冲液（pH 7.0）调节pH值，静置沉淀；（3）将沉淀用离心机离心（3000 r/min，10分钟），取上清液；（4）将上清液用SDS-PAGE凝胶电泳分离，观察溶菌酶的条带位置；（5）根据电泳结果，收集目标条带，并进行浓缩。

3. 酶活力和蛋白浓度测定（1）酶活力测定：将收集到的浓缩液加入细菌培养液中，在37℃下反应一定时间，测定细菌存活率，根据公式计算酶活力；（2）蛋白浓度测定：采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。

4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）纯度鉴定：将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，观察电泳图谱，判断纯度；（2）分子量测定：将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据分子量标准曲线计算溶菌酶的分子量。