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畜牧与饲料科学Animal Husbandry and Feed Science2012 ， 33 （ 5-6 ） :35-36钙蛋白酶系统研究进展申晓亮 ， 何永梅 ， 贺晓丽 ， 王梦娇 ， 曹果清（山西农业大学动物科技学院 ，山西 太谷030801）摘要 ： 钙蛋白酶系统在人和动物体内广泛存在 ， 是 高度 复 杂 、 高 度 调 控 的 体 系 。
钙 蛋 白 酶 系 统 由 钙 蛋 白 酶 （calpain ） Ⅰ （CAPN1 ）、 钙 蛋 白 酶 Ⅱ （CAPN2 ）、 骨 骼 肌 特异 性 蛋 白 （muscle specific calpain ，CAPN3） 和 钙 蛋 白 酶 抑 制 蛋 白 （calpastatin ， CAST ） 组成 。
钙蛋白酶系统在动物屠宰后肉的成熟嫩化及人和动物正常生理过程的维持中起重要作用 。
对钙蛋白酶系 统的作用 、 各成分分子结构 、 基因结构 、 作用机制 、 调控机制等做了综述 ，并讨论了其应用前景及今后的研究方向 。
关键词 ： 钙蛋白酶系统 ； 作用 ； 结构 ； 调节机制 中图分类号 ：Q55 文献标识码 ：A 文章顺序编号 ：1672-5190 （2012 ）05-0035-02钙蛋白酶系统在人和动物的体内广泛存在 ， 是一个高 度复杂、 高度调控的体系。
钙蛋白酶系统由钙蛋白酶 （calpain ）Ⅰ （CAPN1 ）、 钙蛋白酶 Ⅱ （CAPN2 ）、 骨 骼 肌特 异 性 蛋 白 （muscle specific calpain ，CAPN3） 和 钙 蛋 白 酶 抑 制 蛋 白 （calpastatin ，CAST ）组成 。
据研究 ，钙蛋白酶的表达会引起肌 细胞肌原纤维的降解 ， 钙蛋白酶抑制蛋白的表达会抑制肌 肉蛋白质水解 。
目前 ，钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白基因［1］1.3与健康和疾病的关系钙蛋白酶系统不但参与神经发育 、 葡 萄 糖 转 运 、 细 胞 信号 转 导 、 细 胞 周 期 调 控 与 凋 亡 等 正 常生理过程 ， 还与肌肉萎缩 、2 型糖尿病 、 风 湿性 关 节 炎 、 缺 血再灌注损伤以及阿尔茨海默病等疾病的发生有关 ［2］。
· 134 ·收稿日期：2014-08-28 *通讯作者基金项目：国家自然基金项目(31360393)；国家自然基金项目(31160330)。
作者简介：郭月英(1977—)，女，呼和浩特人，博士，讲师，研究方向为畜产品加工与贮藏。
郭月英1，刘树军2，王 乐1，程海星1，张 静1，任 霆1，靳 烨1*(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018；2.乌拉特中旗农区畜牧业专项推进办公室，巴彦淖尔 015300)摘要：钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因是影响肉质性状的重要的候选基因。
研究选取40只巴美肉羊为试验对象。
采用相对定量PCR 技术对不同月龄巴美肉羊背最长肌、臂三头肌、股二头肌中CAST 基因的表达规律及其与肉质的相关性进行研究。
分析基因表达量与肉质指标的相关性。
实验结果表明：3个测试部位中，CAST 基因的表达规律为臂三头肌(Q)＞股二头肌(H)＞背最长肌(B)。
在背最长肌中，CAST 基因表达量与剪切力(r=0.619)、红度值(r=0.719)、黄度值(r=0.222)、亮度值(r=0.438)、眼肌面积(r=0.382)呈正相关，与pH 1(r=-0.643)、pH 2(r=-0.330)呈负相关。
在臂三头肌中，CAST 基因表达量与剪切力(r=-0.140)、红度值(r=-0.023)、pH 1(r=-0.684)呈负相关，与黄度值(r=0.263)、亮度值(r=0.614)、pH 2(r=0.121)呈正相关。
在股二头肌中，CAST 基因表达量与剪切力呈显著正相关，相关系数0.989(p=0.011)；与红度值(r=0.928)、黄度值(r=0.213)、pH 2(r=0.734)呈正相关；与亮度值(r=-0.264)、pH 1(r=-0.812)呈负相关。
关键词：巴美肉羊；钙蛋白酶抑制蛋白基因；相对定量PCR ；表达规律；肉质中图分类号：TS 251.5+3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)01-0134-06Analysis of expression of calpastatin gene and its correlation with meattraits in bamei sheepGUO Yue-ying 1, LIU Shu-jun 2, WANG Le 1, CHENG Hai-xing 1, ZHANG Jing 1, REN Ting 1, JIN Ye 1*(1.College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018; 2.Special Advancing Office of Graziery, Urat Middle County, Bayannur 015300)Abstract: Calpastatin (CAST) gene was important candidate gene for meat quality. Correlation of the expression with meat quality had been investigated. Relative quantitation PCR was used to investigate the expression of CAST in 40 Bamei sheep of different month ages. The shear force, pH, color were investigated after slaughter. The correlation between the expression and meat quality traits were analyzed. Results showed that the expression pattern of CAST gene was triceps> biceps femoris>longissimus dorsi. The expression of CAST gene in longissimus dorsi had positive correlation with shear force (r=0.619), red/green color (r=0.719), yellowness(r=0.222), lightness(r=0.438), loin area (r=0.382) and had negative巴美肉羊钙蛋白酶抑制蛋白基因表达规律及其与肉质的相关性研究DOI:10.13684/ki.spkj.2015.01.028· 135 ·2015年 第40卷 第01期内蒙古天然草场辽阔，总面积位居全国五大草原之首，是我国重要的畜牧业生产基地。
大河乌猪血浆胆固醇脂转移蛋白基因多态性与生产性能的相关性分析李福泉;杨文;郭斌;霍金龙;史宪伟【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(40)4【摘要】试验应用PCR-RFLP技术对云南培育品种大河乌猪4代(F4)、5代(F5)和6代(F6))共334头个体的血浆胆固醇脂转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)基因内含子1436 bp进行扩增,用限制性内切酶AvaⅡ对其酶切可得到3种基因型:BB、Bb和bb,F4、F5、F6都以b等位基因为优势等位基因,其等位基因频率分别为0.5821、0.6042和0.6885.取不同基因型纯合子样品进行测序,共发现7个单核苷酸多态位点(SNPs),其有3个为转换,4个突变为颠换,多态位点分别位于19、69、132、175、203、224、234 bp处.应用最小二乘分析不同基因型和不同性别的基因型对生长性状(初生重、45日龄重、4月龄体重、6月龄体重、体高、体长、管围、背膘厚)的影响.结果显示,F4代Bb和bb基因型个体体长显著高于BB基因型(P＜0.05);bb基因型6月龄管围显著高于BB基因型(P＜0.05),与Bb基因型个体间差异不显著(P＞0.)5)；F5代Bb和bb基因型个体初生重显著高于BB基因型(P＜0.05),两者之间差异不显著(P＞0.05);F6代bb基因型个体初生重、45日龄重显著高于BB基因型(P＜0.05),与Bb基因型个体间差异不显著(P＞0.05)；其余性状不同基因型间无显著差异(P＞0.05).另外,bb基因型雄性和雌性个体在初生重都存在显著差异(P＜0.05).研究结果提示,CETP基因对猪生长性状(特别是初生重)存在一定影响；选择带有b等位基因的个体有望提高猪体质量相关的生长性状,该SNP可能是改良猪生长速度性状的重要分子标记位点.%The associationsbetween SNPs in the cholesteryl ester transfer protein (CETP) gene and production performance of pigs were reported in this study, the polymorphism of CETP gene was detected by a Ava Ⅱ RFLP in 334 Dahe Black pigs across F4 to F6 generations. These results showed that b alleles was excellent gene with frequencies of 0. 5821, 0. 6042 and 0.6885 in F4, F5 and F6 generations, respectively. Seven SNPs (19, 69, 132, 175, 203, 224 and 234 bp, respectively) were found by the homozygous samples sequencing. Associations between the founded Ava II RFLP and birth weight, body weight at 45 days, body weight at 4 months, body weight at 6 months, body height at 6 months, body length at 6 months and cannon circumference at 6 months and back-fat thickness at 6 months were tested by least square analysis. The results showed that in F4 generation, body length at 6 months with Bb and bb genotype was higher than that with BB genotype (P<0. 05);cannon circumference at 6 months with bb genotype was higher than that with BB genotype (P<0. 05), that with Bb genotype was not significant (P>0. 05). In F5 generation, the birth weight with Bb and bb genotype was higher than that with BB genotype (P<00. 05), no significant difference between them (P>0. 05). In F6 generation, the birth weightand body weight at 45 day-swith bb genotype was higher than that with BB genotype (P<0. 05), that with Bb genotype was not significant (P>0. 05). In addition,the birth weight showed the higher significant difference between bb genetype and female/male (P<0. 05). These results suggested that the CETP gene had some effects on the growth traits of porcine,and the selection of b allect was favored with regard to the growthtraits of porcine, this SNP might be considered as a potential genetic marker for improving growth.【总页数】7页(P167-173)【作者】李福泉;杨文;郭斌;霍金龙;史宪伟【作者单位】云南农业大学动物科技学院,云南省生物多样性与生物技术人才培养基地,云南昆明650201;内江职业技术学院生物技术系,四川内江641100;内江职业技术学院生物技术系,四川内江641100;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062;云南农业大学版纳微型猪近交系重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学动物科技学院,云南省生物多样性与生物技术人才培养基地,云南昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S813.3【相关文献】1.胆固醇酯转移蛋白基因多态性与血脂的研究 [J], 朱燕林;严晓伟;鄢盛恺;朱文玲2.胆固醇酯转移蛋白基因 TaqIB 多态性与新疆维吾尔族心房颤动患者的相关性研究 [J], 郁秀琴;木胡牙提;杨玉春;刘志强3.大河乌猪钙蛋白酶抑制蛋白基因、脂肪细胞定向和分化因子1基因多态性及其与肉质性状的关联分析 [J], 邓正德;连林生4.大河乌猪磷酸酯转移蛋白基因内含子4的SNPs检测及其与生产性能的关联分析[J], 李福泉;杨文;郭斌;霍金龙;史宪伟5.胆囊结石患者胆固醇酯转移蛋白基因多态性研究 [J], 张明仪;肖路加;林琦远;魏家宾;舒晔;刘嘉林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
辛建增，唐婷，刘盛．ＰＧＣ－ｌα调控畜禽肌肉脂肪生长代谢及其与肉品质研究进展［Ｊ］．畜牧与兽医，２０２４，５６（５）：１３８－１４５．ＸＩＮＪＺ，ＴＡＮＧＴ，ＬＩＵＳ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ－ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－１αｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄｐｏｕｌｔｒｙ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０２４，５６（５）：１３８－１４５．ＰＧＣ－ｌα调控畜禽肌肉脂肪生长代谢及其与肉品质研究进展辛建增１，唐婷１，刘盛２∗（１．烟台大学生命科学学院，山东烟台㊀２６４０００；２．烟台大学药学院，山东烟台㊀２６４０００）摘要：过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α（ＰＧＣ－ｌα）是一种具有广泛功能的转录调节因子，其在动物体内参与线粒体生物合成㊁肌纤维类型转化㊁脂肪分化㊁肌内脂肪沉积㊁糖脂代谢㊁能量代谢等多项生理过程，其中，肌纤维类型和肌内脂肪含量与肉品质密切相关㊂因此，在分子水平深入探究ＰＧＣ－１α调控肌肉和脂肪的生长代谢过程将为改善肉品质提供新的研究思路㊂本文系统概述了ＰＧＣ－ｌα的结构特点及ＰＧＣ－１α调控肌肉线粒体增生㊁脂肪分化㊁能量代谢等过程的机制，重点介绍了ＰＧＣ－ｌα调控肌纤维类型转化㊁肌内脂肪沉积㊁糖类代谢及其与肉品质形成之间的可能关系，以期为今后通过ＰＧＣ－１α调控畜禽肌肉脂肪生长代谢，进而改善肉品质提供参考㊂关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α；肌纤维类型；肌内脂肪沉积；能量代谢；肉品质中图分类号：Ｓ８２６㊀㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：０５２９－５１３０（２０２４）０５－０１３８－０８Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ－ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－１αｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄｐｏｕｌｔｒｙＸＩＮＪｉａｎｚｅｎｇ１，ＴＡＮＧＴｉｎｇ１，ＬＩＵＳｈｅｎｇ２∗（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ２６４０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ２６４０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ（ＰＰＡＲ－γ）ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１α（ＰＧＣ－ｌα）ｉｓａｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒ．Ｔｈｉｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍａｎｙｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓｓｕｃｈａｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｄｉｐｏｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ⁃ａｔｉｏｎ，ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｄｉｐｏｓｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎａｎｉｍａｌｓ．Ｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅａｎｄｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆａｔｃｏｎｔｅｎｔａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰＧＣ－１αｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｎｅｗｒｅｓｅａｒｃｈｉｄｅａｓｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＰＧＣ－ｌαａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＰＧＣ－１αｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍｕｓｃｌｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，ａｄｉｐｏｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｒｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｒｅｇｕ⁃ｌａｔｉｏｎｏｆＰＧＣ－ｌαｏｎｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆａｔｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙａｒｅｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ；ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏ⁃ｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔｂｙＰＧＣ－１αｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄｐｏｕｌｔｒｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰＧＣ－１α；ｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅ；ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆａｔｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；ｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙ㊀㊀畜禽肉品质包括肉色㊁嫩度㊁系水力㊁风味㊁多汁性等多个方面㊂因此，肉品质性状是一个复杂的综合性状㊂肉品质受宰前和宰后多种因素的影响，例如遗传（品种㊁性别㊁年龄㊁基因）㊁营养水平㊁饲养管理㊁宰前运输㊁屠宰方式㊁宰后成熟方式等，其中㊀收稿日期：２０２３－０５－２５；修回日期：２０２４－０３－２０基金项目：烟台大学博士启动基金项目（ＳＭ２０Ｂ１１３）第一作者：辛建增，男，博士，讲师∗通信作者：刘盛，讲师，研究方向为食品化学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｓｈ⁃ｅｎｇ８７＠１２６ ｃｏｍ㊂遗传因素起决定性作用㊂然而，在饲养过程中，畜禽肌肉和脂肪的生长发育及代谢对肉品质的形成也起着至关重要作用㊂畜禽肌肉的生长发育及代谢是一个及其复杂的过程，由多种基因和信号通路在不同水平上参与调控，各调控因子与信号通路分工协作组成精细复杂的调控网络，有序调控肌肉的生长发育㊁肌纤维类型的转化㊁肌纤维的能量代谢等生物学过程㊂而脂肪组织是畜禽维持生命活动必不可少的组织，通常储存在皮下㊁内脏㊁肌肉等部位㊂与肉品质最相关的脂肪为肌内脂肪和肌间脂肪㊂其中肌内脂肪的含量与肉品质最为密切，是肉品领域的研究热点，肌内脂肪的含量会影响肉的系水力㊁风味㊁多汁性等品质㊂过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α（ＰＧＣ－１α）是肌肉和脂肪生长代谢过程中必需的转录共调节因子，它参与调控肌细胞线粒体生物合成㊁肌纤维类型的转化㊁肌细胞能量代谢等生物学过程㊂ＰＧＣ－１α在脂肪的分化㊁沉积㊁合成㊁代谢等方面也发挥重要的调节作用㊂此外，ＰＧＣ－１α还参与机体的适应性产热㊁肝脏的糖异生㊁血管生成㊁调控细胞中活性氧簇水平㊁调控机体的生物钟基因等生理过程㊂ＰＧＣ－１α功能广泛，参与众多生理调节过程㊂本文将对ＰＧＣ－１α分子结构特征，ＰＧＣ－１α调控肌纤维能量代谢㊁肌纤维糖代谢㊁肌纤维类型转化㊁脂肪分化㊁肌内脂肪沉积㊁脂肪代谢及其与宰后肉品质的可能关系进行了系统阐述，并对相关可能的研究热点进行了展望㊂以期为更深入地探究ＰＧＣ－１α信号通路及其靶基因调控畜禽肌肉脂肪生长代谢和提高肉品质提供参考㊂１㊀ＰＧＣ－１α概述ＰＧＣ－１α是由Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ团队１９９８年最先在小鼠棕色脂肪组织中发现的一种转录共调节因子［１］㊂ＰＧＣ－１α属于ＰＧＣ－１家族，该家族共有３个成员，另外两个分别为过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ＰＰＡＲ－γ）辅激活因子－１β（ＰＧＣ－１β）和ＰＧＣ－１相关辅活化因子（ＰＲＣ），其家族成员蛋白长度存在着一定的差异，但存在着相应的保守序列㊂ＰＧＣ－１家族的Ｎ端结构域均含有转录激活域，Ｃ端结构域均包含富含丝氨酸／精氨酸的ＲＳ域和ＲＮＡ结合区域（ＲＭＭ）［２］㊂ＰＧＣ－１α与ＰＧＣ－ｌβ同源性较高，而与ＰＲＣ的同源性则相对较低㊂人的ＰＧＣ－１α基因位于染色体４ｐ１５ １区域，全长为６８１ｋｂ，由１３个外显子和１２个内含子组成，其ｍＲＮＡ含有６９０８ｂｐ，编码一个包含７９８个氨基酸，分子量９１ｋＤａ的蛋白质［３］，其他常见畜禽的ＰＧＣ－１α基因与蛋白质基本信息见表１（引自ＮＣＢＩ）㊂ＰＧＣ－１α的蛋白结构域，其Ｎ端有一个富含酸性氨基酸的转录激活区（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，ＡＤ），该区内有一个ＬＸＸＬＬ结构域（Ｘ：任意氨基酸；Ｌ：亮氨酸），此结构域是ＰＧＣ－１α与配体依赖型核受体结合的基础㊂负调控元件和转录因子结合位点位于ＰＧＣ－１α的中间区域，当转录因子与ＰＧＣ－１α结合时，负调控元件就会暴露出来［４］㊂Ｃ末端是一个ＲＮＡ结合基本序列ＲＲＭ和富含丝氨酸／精氨酸的ＲＳ区域，这个区域可以与ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的Ｃ末端相互作用，处理新转录的ＲＮＡ㊂ＰＧＣ－１α上还有与细胞呼吸因子（ＮＲＦ）㊁肌细胞特异性增强子２Ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２Ｃ，ＭＥＦ２Ｃ）及ＰＰＡＲγ结合的位点［３］㊂因此，ＰＧＣ－１α是作为转录因子的激活因子来调控其他基因的表达㊂表１㊀人与常见畜禽ＰＧＣ－１α基因和蛋白质基本信息物种所处染色体基因长度／ｋｂｍＲＮＡ长度／ｂｐ内含子数外显子数蛋白肽链长度（氨基酸残基数量）蛋白质分子量／ｋＤａ人４６８１６９０８１２１３８０３９２猪８６９６６７３８１２１３７９６９０狗３６４１５８４１１３１４８０３９１牛６７１５６３２４１２１３７９６９０羊６７１８６６８０１２１３７８７８９鸡４３４８６６１５１２１３８０８９２鸭４３６１９７１６１２１３８０８９２鸽子４３６４４９１３１２１３６７０７７㊀㊀ＰＧＣ－１α分子本身的促转录激活活性较低，只有被相应的受体募集后，其活性才显著增强㊂ＰＧＣ－１α与核受体结合后，会导致ＰＧＣ－１α构象发生改变，并与下游因子作用，发挥转录激活作用㊂ＰＧＣ－１α不仅对ＰＰＡＲγ具有组织特异性的辅激活作用，而且也是类维生素ＡＸ受体（ＲＸＲ）㊁肌细胞增强因子２ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２Ｃ，ＭＥＦ２Ｃ）㊁甲状腺激素受体（ｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＲ）㊁糖皮质激素受体（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＲ）㊁雌醇受体α（ｅｓ⁃ｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＲα）和ＰＰＡＲｓ等核受体（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮＲ）的辅激活因子［２，５－７］㊂ＰＧＣ－１α的表达具有组织特异性，通常在线粒体含量丰富和氧化代谢活跃的器官或组织中高表达，如骨骼肌㊁心脏㊁棕色脂肪组织㊁肝脏㊁肾脏和大脑组织等，而在肺㊁小肠㊁结肠和胸腺中只有很少量的表达，在胎盘㊁脾和外周白细胞中未见表达［８］㊂前已述及，ＰＧＣ－１α在肌肉脂肪的生长发育及代谢中发挥着重要调控作用，下面将针对其活性调控㊁肌肉脂肪生长代谢及其与肉品质和一些生理功能的相关作用进行论述㊂２㊀ＰＧＣ－１α活性调控相关信号因子ＰＧＣ－１α含有磷酸化㊁乙酰化㊁糖基化㊁甲基化㊁泛素化等翻译后修饰的位点，这些翻译后修饰对于其发挥作用时的精细化调控具有重要意义［９］㊂其中当前研究较多的为乙酰化和磷酸化修饰㊂沉默信息调节因２相关酶１（ｓｉｒｔｕｉｎ１，ＳＩＲＴ１）和ＡＭＰ依赖的蛋白激酶（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰＫ）是调控ＰＧＣ－１α去乙酰化和磷酸化的关键酶，此两种酶对于机体肌肉脂肪生长发育和能量代谢的精准调控和稳态维持具有重要的意义㊂ＳＩＲＴ１可以将乙酰化后的ＰＧＣ－１α去乙酰化，从而提高ＰＧＣ－１α的活性［１０－１１］㊂此外ＳＩＲＴ１是体内代谢的感受器，当机体处于能禁食或者饥饿等状态下，ＳＩＲＴ１会加速ＰＧＣ－１α的去乙酰化，导致其活性上升，可增加线粒体的合成㊂而一些乙酰转移酶例如组蛋白乙酰化酶氨合成通用控制蛋白５（ｈｉｓｔｏｎｅａｃｅｔｙｌ⁃ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＧＣＮ５，ＧＣＮ５）和核受体共激活因子－３（ｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ３，ＳＲＣ－３）可以使ＰＧＣ－１α发生乙酰化，从而抑制其活性［１２－１５］㊂此外，ＳＩＲＴ１的去乙酰化作用还是ＰＧＣ－１α调控生物钟基因表达的重要事件㊂ＳＩＲＴ１与乙酰化酶协调作用，精细化调节ＰＧＣ－１α发挥作用㊂ＡＭＰＫ是体内能量感受器，当机体能量处于缺乏状态时，ＡＭＰＫ可使ＰＧＣ－１α磷酸化位点磷酸化，从而提高ＰＧＣ－１α活性，激活与能量代谢相的通路，引起线粒体增生㊁脂肪酸氧化等生物学过程增加［１４］㊂３㊀ＰＧＣ－１α与肌肉生长代谢及肉品质３ １㊀ＰＧＣ－１α与肌肉线粒体合成及肉品质线粒体是为骨骼肌生长发育提供能量的细胞器，它对骨骼肌发挥正常生理功能具有重要的意义，ＰＧＣ－１α是调控线粒体生物合成和氧化磷酸化过程中的关键调节因子［１５－１６］㊂研究发现，ＰＧＣ－１α可参与调控肌纤维中线粒体的生成，并且还能够调节线粒体的融合及分裂，在某些组织，如白色脂肪㊁肌肉㊁神经㊁心脏中超表达ＰＧＣ－１α，都会促进线粒体的生成［１５－１７］㊂ＰＧＣ－１α促进线粒体生成主要通过与转录因子结合发挥作用，常见的为核呼吸因子－１（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ－１，ＮＲＦ－１）和核呼吸因－２（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ－２，ＮＲＦ－２）㊂研究发现，ＰＧＣ－１α与核呼吸因子结合后会刺激线粒体转录因子Ａ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＡ，ｍｔＴＦＡ）的合成㊂这些因子直接影响线粒体生成，在线粒体内引起线粒体ＤＮＡ的双向转录，实现了线粒体的增殖［１８－１９］㊂畜禽宰杀放血后，肌肉中的线粒体发生肿胀，最终结构破坏而破裂，但肉品质形成过程中，线粒体的生理代谢状态与肉嫩度㊁肉色㊁持水力等品质有着密切关系㊂研究表明，宰后初期肌肉线粒体耗氧率与肉品嫩度密切相关，高嫩度牛肉拥有更高的线粒体耗氧率［２０］㊂宰后肌肉中线粒体影响肉色稳定性主要通过两种途径，一是线粒体与氧合肌红蛋白竞争氧气，使其转变为脱氧肌红蛋白状态，此情况过度发生可导致肉色变暗；另一方面，线粒体具有高铁肌红蛋白还原酶活性，可以将氧化的高铁肌红蛋白转化为还原态脱氧肌红蛋白，为鲜红色氧合肌红蛋白的生成提供还原态肌红蛋白［２１－２２］㊂肌肉持水力是肉品一个重要的品质，最近研究表明，牛肉宰后成熟过程中，线粒体脂肪成分的变化与肌肉持水力的变化密切相关［２３］㊂ＰＧＣ－１α已被证明其与畜禽生长和肉品质密切相关，且已被列为能够候选基因［２４］，然而未见ＰＧＣ－１α调控肌肉中线粒体与宰后肉品质的相关研究，ＰＧＣ－１α对肌肉中线粒体的调控及宰后肉品质的变化形成需要开展深入研究㊂３ ２㊀ＰＧＣ－１α与肌肉糖类代谢葡萄糖是肌肉组织主要的能源物质，糖类氧化供能为肌肉的各类生理活动提供能量㊂ＰＧＣ－１α在体内糖代谢的过程中发挥重要调节作用，主要表现在以下几个方面：首先ＰＧＣ－１α是糖异生过程的关键调节因子㊂在禁食情况下，ＰＧＣ－１α会在肝细胞中大量表达，与其他相关调节因子配合在转录水平上激活糖异生关键酶组，如葡萄糖－６－磷酸酶㊁磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等，最终导致肝糖输出增加［２５－２６］㊂其次，葡萄糖进入肌肉细胞需要葡萄糖转运载体４（ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ４，ＧｌｕＴ４）的转运，ＰＧＣ－１α可与肌细胞增强子因子２（ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２，ＭＥＦ２）共同作用，刺激ＧｌｕＴ４的表达，从而增加肌细胞内葡萄糖的水平㊂此外，ＰＧＣ－１α在某些情况还可抑制肌细胞葡萄糖的氧化，其与雌激素相关受体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒα，ＥＲＲα）结合后，刺激丙酮酸脱氢酶４表达，从而抑制葡萄糖氧化和增加葡萄糖吸收来补充肌糖原贮备，为下一次的肌肉运动做准备㊂肌肉中的糖原是宰后生成乳酸的原料，动物胴体在宰后冷藏排酸过程中，糖原转化为乳酸导致肌肉ｐＨ值下降，这是宰后肌肉排酸的原理㊂而宰后ｐＨ的下降幅度和速度影响肉品质形成，宰后肌肉ｐＨ值过高或过低都会形成异质肉㊂而ＰＧＣ－１α对于肌肉糖代谢具有调控作用，宰前肌肉中ＰＧＣ－１α的表达水平和活性对于宰后肌肉糖原水平㊁ｐＨ值变化及肉品质形成是否具有影响，未见相关报道，需要开展相应研究㊂３ ３㊀ＰＧＣ－１α与骨骼肌肌纤维类型转换及肉品质不同肌纤维类型对于肌肉发挥生理功能具有重要的作用，比较常见的例子是，动物不同部位的肌肉的肌纤维组成存在着明显差异，且肉品质也存着差别㊂肌肉纤维类型受遗传㊁运动㊁营养㊁和环境等多种因素的影响㊂ＰＧＣ－１α是调控肌纤维类型转变的主要因子，ＰＧＣ－１α基因高表达，可以提高与氧化型肌纤维有关的基因表达，提高细胞色素Ｃ和肌红蛋白的含量提高有氧呼吸能力与线粒体的数量，增强抗疲劳的能力等，主要为使酵解型肌纤维向氧化型肌纤维转化［２７－２８］㊂超表达ＰＧＣ－１α的转基因小鼠，其骨骼肌中Ⅱ型肌纤维表现出Ⅰ型肌纤维的蛋白特性，其中ＴＮＮ１蛋白㊁肌红蛋白和肌钙蛋白Ⅰ明显增加，Ⅱ型肌纤维逐步转化为Ⅰ型肌纤维［２９］㊂人和动物的骨骼肌类型变化研究表明，ＰＧＣ－１α的表达量与快肌纤维的含量成负相关，与慢肌纤维的含量成正相关［３０－３１］㊂相关研究已证实，寒冷可以刺激诱使鸡的胸肌部分从ⅡＢ型转化为ⅡＡ型，而ＰＧＣ－１α的上调表达在其中发挥了关键的作用［３２］㊂ＰＧＣ－１α通过调节肌纤维类型影响畜禽肉品质已经被证实，但是其发挥作用的详细分子机制还不清晰，需要开展相应的深入研究㊂３ ４㊀ＰＧＣ－１α与肌肉中活性氧含量及肉品质ＰＧＣ－１α可促进肌肉等组织中线粒体的合成，还能刺激线粒体呼吸链电子转运活性，从理论上讲，ＰＧＣ－１α将导致细胞内活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）水平提高，但是实际上并非如此，在肌肉和棕色脂肪中，运动与寒冷环境的暴露均和ＲＯＳ负面影响没有关联，这主要是ＰＧＣ－１α可以增强很多抗氧化酶的表达［３３－３４］㊂即ＰＧＣ－１α有两种能力，刺激线粒体电子转运的同时抑制ＲＯＳ水平㊂这样，肌肉组织，棕色脂肪通过提升线粒体代谢应对外部环境变化的过程中，不会对自身造成氧化损伤㊂而ＲＯＳ与宰后肉品的形成密切相关，动物在宰杀后，ＲＯＳ主要来源于线粒体和脂肪的氧化，产生的ＲＯＳ往往会对某些肉品质，肉色㊁嫩度㊁系水力等产生负面影响［２３，３５］㊂ＲＯＳ与宰后肉品质形成一直是肉品科学领域研究的热点，ＰＧＣ－１α已被证实是影响肉品质的候选基因之一，但是其调控宰后肌肉中ＲＯＳ的作用机制及如何影响肉品质未见相关报道㊂４㊀ＰＧＣ－１α与脂肪生长代谢及肉品质４ １㊀ＰＧＣ－１α与脂肪细胞分化动物脂肪组织中大约１／３是脂肪细胞，其余的２／３是成纤维细胞㊁微血管㊁神经组织和处于不同分化阶段的前脂肪细胞㊂由前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程是一个涉及多个信号通路的复杂调控过程，该过程大致可为４个阶段，分别为生长抑制阶段㊁克隆扩增㊁早期分化和终末分化［３６］㊂ＰＰＡＲｓ在动物脂肪发育分化的早期分化阶段开始发挥调控作用，它们与相应的因子协调作用，共同调节脂肪的增殖分化㊂ＰＰＡＲγ是ＰＰＡＲｓ家族成员，它是脂肪细胞分化的及其的重要因子，其通常可作为前体脂肪分化处于早期分化的标志基因，是脂肪细胞增殖分化过程中起决定性作用的基因㊂研究证实，ＰＰＡＲγ缺失的胚胎干细胞能够分化为多种细胞，但唯独不能分化为脂肪细胞㊂此外，ＰＰＡＲγ基因敲除的小鼠，在胚胎期１０ｄ左右就会死亡，且未在胚胎内检测到脂肪细胞，而正常小鼠在胚胎期１０ｄ即可检测到脂肪细胞的存在［３６］㊂这说明ＰＰＡＲγ在脂肪分化形成过程中起关键作用，ＰＰＡＲγ发挥脂肪分化调控作用时，需要先与ＲＸＲα形成异源二聚体，然后与所调节基因启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件（ＰＰＲＥ）结合才发挥转录调控作用，而ＰＧＣ－１α作为ＰＰＡＲγ配体，能促进ＰＰＡＲγ与相应调控因子的结合［３７］㊂很多哺乳动物体内存在着白色脂肪组织㊁米色脂肪组织和棕色脂肪组织三种，白色脂肪主要作用为贮存能量，米色脂肪具有贮存能量和非战栗产热的功能，棕色脂肪主要进行非战栗产热㊂在细胞结构和功能上，白色脂肪细胞拥有一个大脂滴用于存贮能量，而棕色脂肪细胞拥有多脂滴㊁多线粒体的结构㊂ＰＧＣ－１α能够促进白色脂肪向棕色脂肪转化，它能够刺激白色脂肪中线粒体的大量生成，还能增加解偶联蛋白１（ＵＣＰ１）等分子的生成，这些改变可使白色脂肪逐渐转化为棕色脂肪组织［３８］㊂４ ２㊀ＰＧＣ－１α与脂肪氧化供能脂肪是畜禽体内重要的储能物质，在冷暴露㊁禁食㊁运动等情况下，可为机体提供能量，其中脂肪酸β氧化产能是其最为主要的供能方式㊂脂肪是也骨骼肌获取能量的重要物质㊂研究表明，过表达ＰＧＣ－１α可增加骨骼肌线粒体的生物合成，也可使脂肪酸氧化相关酶含量上升或者活性增强，从而增加脂肪酸氧化供能［３９－４０］㊂在小鼠骨骼肌和猪前脂肪细胞过表达ＰＧＣ－１α，可促进脂肪酸氧化过程中相关基因肉碱棕榈酰转移酶１β（ＣＰＴ１β）㊁肝型脂肪酸结合蛋白（ＦＡＢＰ１）㊁过氧化物酶酰基辅酶Ａ氧化酶１（ＡＣＯＸ１）㊁中链酰基辅酶Ａ脱氢酶（ＭＣＡＤ）㊁脂肪酸转位酶（ＣＤ３６）等的表达，其中ＣＰＴ１β是脂肪酸氧化过程中的限速酶［３８－４１］㊂ＣＤ３６㊁ＦＡＢＰ１是脂肪酸转运的重要蛋白，可将脂肪酸逐步转运至肌肉等组织，便于氧化供能㊂而ＡＣＯＸ１㊁ＭＣＡＤ是参与脂肪酸氧化过程中的关键酶㊂过表达ＰＧＣ－１α还可促进氧化磷酸化相关基因ＡＴＰＳｙｎｔｈａｓｅ㊁ＣｙｔＣ㊁ＣＯＸⅢ等的表达［２７］㊂而在ＰＧＣ－１ａ敲除后的小鼠表现为心脏功能不全，肌肉耐力下降，轻度心动过缓，心肌脂肪酸氧化能力下降，能量产生减少［４２－４４］㊂以上研究说明ＰＧＣ－１α在肌肉的脂肪酸氧化供能方面起重要的调节作用㊂４ ３㊀ＰＧＣ－１α与肌内脂肪沉积及肉品质肌内脂肪的沉积是一个涉及多种信号通路和代谢因子的复杂过程，ＰＰＡＲｓ家族成员㊁肌内脂肪转运相关因子等发挥了重要的作用㊂ＰＧＣ－１α是ＰＰＡＲｓ家族某些因子的配体，其在肌肉脂肪代谢过程中发挥了重要作用㊂ＰＧＣ－１α不仅能够增加肌肉脂肪的分解代谢（前已述及），而且还可增加肌细胞中脂肪的合成代谢㊂通过肌细胞培养实验和转基因小鼠试验证实，ＰＧＣ－１α不仅能增加脂肪的分解代谢，还可以增加肌细胞内脂肪酸和磷脂等脂肪的合成代谢［４５－４６］，且ＰＧＣ－１α转基因小鼠的脂肪酸转运蛋白等脂质代谢相关蛋白也增加了［４６］㊂ＰＧＣ－１α对于肌内脂肪的双向调控作用，对于动物维持生命活动具有重要的意义，不仅能够保障机体对于能量的需求，还对机体后续的生命活动具有重要的意义㊂其发挥脂肪调控作用，还要取决于动物机体所处的状态㊂畜禽上的相关研究已经证实，ＰＧＣ－１α与脂肪沉积及肉品质存在一定关联㊂在猪上的研究表明，ＰＧＣ－１α参与猪脂肪沉积的基因，ＰＧＣ－１α基因多态性与失水率㊁剪切力等肉品指标显著相关［４７－４９］㊂因此，ＰＧＣ－１α已被列为猪脂肪沉积及肉品质的候选基因，且在藏猪上的研究表明ＰＧＣ－１α与肌内脂肪沉积密切相关［３６］㊂在鸡上的研究也证实，ＰＧＣ－１α多态性与鸡腹部脂肪的沉积显著相关［５０－５１］㊂然而，在牛上的研究表明，肌内脂肪含量及嫩度等品质与ＰＧＣ－１α存在一定的相关性，但是未达到显著水平［５２］㊂以上研究表明由于遗传背景的差异，不同畜禽ＰＧＣ－１α在调控肌肉脂质代谢方面可能存在着差异㊂但是当前研究大多停留在分析推测层面，并未对其作用的机理及信号通路作用方式进行深入研究，因此需要对ＰＧＣ－１α调控肌肉代谢，尤其是调控脂肪代谢开展深入的研究，为优质肉品的生产提供研究基础㊂４ ４㊀ＰＧＣ－１α与机体的适应性产热适应性产热是机体应对外界刺激以产热的形式消耗能量的生理过程，对于动物在特定环境下，维持正常体温和生命活动是必须的，主要发生在骨骼肌和棕色脂肪组织㊂其中小型动物，如小鼠，大鼠等主要依靠棕色脂肪组织进行适应性产热，而畜禽则以肌肉适应性产热为主㊂棕色脂肪的分化形成需要ＰＰＡＲγ发挥作用，但其发挥作用需要ＰＧＣ－１α的辅助，ＰＧＣ－１α结合并激活ＰＰＡＲγ后才能刺激棕色脂肪细胞分化过程中基因的转录［１５，５３－５４］㊂ＰＧＣ－１α还可通过另外两个方面来加快适应性产热，首先是促进适应性产热原料的摄取，促进棕色脂肪和肌肉对产热原料，如葡萄糖和脂肪的摄取；促进适应性产热过程中关键因子的合成及表达，主要是为了适应性产热过程的顺利进行，如促进线粒体的生物合成，促进呼吸链相关基因的表达，促进氧化磷酸化相关基因的表达等［５５－５６］㊂当前未见ＰＧＣ－１α调控畜禽适应性产热与肉品质的相关研究，但宰后迅速科学降低屠体的温度，防止肉品质因为过热而出现变质是当前肉品科学领域的一个重要的研究方向㊂５㊀ＰＧＣ－１α与生物钟相互反馈调控畜禽骨骼肌代谢㊀㊀生物钟是生物机体生命活动的内在节律性㊂体温㊁血压㊁睡眠㊁内分泌㊁肝脏代谢㊁行为等重要生命活动均受到生物钟相关基因的调控［５７－５９］，研究表明生物钟还可参与调控细胞周期［６０］㊂其中昼夜节律及光照是调节生物钟基因表达的最常见的外部环境因素，这些因素的变化会影响畜禽的生长发育和动物性产品的质量㊂生物钟相关调控规律已在畜禽生产领域得到了应用，其可用于改善动物的生长，提高动物性产品的质量㊂Ｔａｏ等［６１］的研究表明，生物钟基因在蛋鸭卵巢的表达水平与产蛋量密切相关㊂光刺激可通过影响生物钟基因的表达，提高肉仔鸡生长期体重和胸肌产量，改善饲料转化率［６２］㊂生物钟基因与奶山羊乳腺代谢密切相关，饲喂不同饲料可改变调生物钟基因表达，调控奶山羊的泌乳［６３］㊂畜禽骨骼肌中存在着生物钟基因，骨骼肌的生命活动受到生物钟基因的调控，ＰＧＣ－１α是连接生物钟和能量代谢的关键调控因子［６４］㊂研究表明，ＰＧＣ－１α在骨骼肌中的表达呈现明显的昼夜节律性，且ＰＧＣ－１α敲除小鼠在能量代谢方面出现异常的生理节律㊂ＰＧＣ－１α与生物钟基因形成反馈调节回路，首先ＰＧＣ－１α是生物时钟基因的上游调节因子，ＰＧＣ－１α能够诱导生物时钟关键基因的表达，如脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白１基因（Ｂｍａｌ１）㊁时钟基因（Ｃｌｏｃｋ）和反向成红细胞增多症基因（Ｒｅｖ－ｅｒｂａ）等㊂此外，ＰＧＣ－１α还可以和视黄酸受体相关的孤儿受体（ＲＯＲα／γ）协同作用，使染色质的局部结构活化，从而激活Ｂｍａｌ１的转录［６５］㊂此外，ＳＩＲＴ１对ＰＧＣ－１α的去乙酰化是导致Ｂｍａｌ１激活的关键事件［６６］㊂其次，Ｃｌｏｃｋ１ａ：Ｂｍａｌ１ｂ复合体又能参与调控ＰＧＣ－１α的表达㊂在畜禽骨骼肌中生物钟基因与ＰＧＣ－１α共同调节骨骼肌的糖脂和能量代谢等生命活动，对于畜禽骨骼肌的生长发育具有重要的意义㊂当前缺乏ＰＧＣ－１α与生物钟基因联合作用调控畜禽肉品质的相关入研究，这可能会成为肉品领域新的研究方向㊂６ 小结与展望综上所述，ＰＧＣ－１α作为一种多效转录调控因子，除参与调控肌肉脂肪生长发育及能量代谢外，还参与骨骼肌脂肪的沉积㊁肌纤维类型转化等生理活动，不仅能够在转录水平上调控骨骼肌能量代谢，而且还与生物钟基因相互作用反馈调节肌肉脂肪的生长发育㊂近年来随着我国人民水平的提高和饮食结构的改善，对于肉品质提出了更高的要求，例如肉品嫩度㊁多汁性和大理石花纹等，这些品质与肌纤维类型和肌内脂肪含量密切相关㊂如何生产肌纤维类型比例合适㊁肌内脂肪适中的肉品，是当前动物营养领域和肉品科学领域的研究热点㊂这与骨骼肌和脂肪生长代谢显著相关，且ＰＧＣ－１α在其中发挥了重要作用㊂尽管针对ＰＧＣ－１α调节骨骼肌生长发育㊁肌纤维类型转换㊁脂肪沉积㊁能量代谢的分子机制，已进行了大量的系统研究，也取得了一些重大进展，但还存在许多问题，诸如ＰＧＣ－１α如何精细调节肌内脂肪沉积，ＰＧＣ－１α调控肌纤维转换和能量代谢的详细信号通路，以及ＰＧＣ－１α与脂肪因子瘦素㊁脂联素㊁抵抗素等的相互激活转录机制，特别是如何通过有效地干预ＰＧＣ－１α调控肌肉脂肪沉积及靶向控制ＰＧＣ－１α介导肌纤维类型转换等㊂今后需对这些问题进行深入探索，以期通过ＰＧＣ－１α调控畜禽肌肉的生长发育㊁脂肪代谢㊁能量代谢等生理过程来提高肉品质㊂参考文献：［１］㊀ＭＩＴＲＡＲ，ＮＯＧＥＥＤＰ，ＺＥＣＨＮＥＲＪＦ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ，ＰＧＣ－１αａｎｄβ，ｃｏｏｐｅｒａｔｅｔｏｍａｉｎｔａｉｎｃａｒｄｉａｃｍｉｔｏ⁃ｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｓｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＪＭｏｌＣｅｌｌＣａｒｄｉｏｌ，２０１２，５２（３）：７０１－７１０．［２］㊀ＪＡＮＮＩＧＰＲ，ＤＵＭＥＳＩＣＰＡ，ＳＰＩＥＧＥＬＭＡＮＢＭ，ｅｔａｌ．Ｒｅｇｕｌａ⁃ｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｙｏｆＰＧＣ－１α［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０２２，１８５（８）：１４４４．［３］㊀ＥＳＴＥＲＢＡＵＥＲＨ，ＯＢＥＲＫＯＦＬＥＲＨ，ＫＲＥＭＰＬＥＲＦ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１（ＰＰＡＲＧＣ１）ｇｅｎｅ：ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｇｅｎｏｍｉｃｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｃｈｒｏ⁃ｍｏｓｏｍａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９９，６２（１）：９８－１０２．［４］㊀ＰＵＩＧＳＥＲＶＥＲＰ，ＲＨＥＥＪ，ＬＩＮＪ，ｅｔａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｅｒｇｙｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｔｈｒｏｕｇｈｐ３８ＭＡＰｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰＰＡＲγｃｏ⁃ａｃｔｉｖａｔｏｒ－１［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌ２００１，８：９７１－９８２．［５］㊀ＴＣＨＥＲＥＰＡＮＯＶＡＩ，ＰＵＩＧＳＥＲＶＥＲＰ，ＮＯＲＲＩＳＪＤ，ｅｔａｌ．Ｍｏｄｕ⁃ｌａｔｉｏｎｏｆｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－αｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｔｈｅｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒＰＧＣ－１［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０００，２７５（２１）：１６３０２－１６３０８．㊀［６］㊀ＢＨＡＬＬＡＳ，ＯＺＡＬＰＣ，ＦＡＮＧＳ，ｅｔａｌ．Ｌｉｇａｎｄ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｅｇｎａｎｅＸｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓｗｉｔｈｈｎｆ－４ｓｉｇｎａｌｉｎｇｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇａｃｏｍｍｏｎｃｏ⁃ａｃｔｉｖａｔｏｒＰＧＣ－１α：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｅｐａｔｉｃｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（４３）：４５１３９－４５１４７．㊀［７］㊀ＲＨＥＥＪ，ＩＮＯＵＥＹ，ＹＯＯＮＪＣ，ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｆａｓｔｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｂｙＰＰＡＲγｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－１α（ＰＧＣ－１α）：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ４αｉｎｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，１００（７）：４０１２－４０１７．［８］㊀马燕．藏羚羊和藏系绵羊ＰＧＣ－１α基因编码区的克隆与分析［Ｄ］．西宁：青海大学，２０１２．［９］㊀张林．超表达猪源ＰＧＣ－１α促进小鼠和猪肌纤维类型转变的研究［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２０１４．［１０］ＲＯＤＧＥＲＳＪＴ，ＬＥＲＩＮＣ，ＨＡＡＳＷ，ｅｔａｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｌｕ⁃ｃｏｓｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈａｃｏｍｐｌｅｘｏｆＰＧＣ－１αａｎｄＳＩＲＴ１［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３４（７０２９）：１１３－１１８．［１１］ＷＡＮＧＷ，ＷＵＤ，ＤＩＮＧＪ，ｅｔａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｅｄｒｏｕｇａｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎａｔｔｅｎ⁃ｕａｔｅｓｈｅｐａｔｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓ⁃ｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄＳＩＲＴ１／ＰＧＣ－１αｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＰｏｕｌｔＳｃｉ，２０２３，１０２（１０）：１－１９．［１２］ＬＥＲＩＮＣ，ＲＯＤＧＥＲＳＪＴ，ＫＡＬＵＭＥＤＥ，ｅｔａｌ．ＧＣＮ５ａｃｅｔｙｌｒａｎｓ⁃ｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｃｏｎｔｒｏｌｓｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｈｒｏｕｇｈｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＧＣ－１α［Ｊ］．ＣｅｌｌＭｅｔａｂ，２００６，３（６）：４２９－４３８．［１３］ＹＥＦ，ＷＵＬ，ＬＩＨ，ｅｔａｌ．ＳＩＲＴ１／ＰＧＣ－１αｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｒｓｅｎｉｃ－ｉｎｄｕｃｅｄｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｄａｍａｇｅｔｈｒｏｕｇｈｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｉｓｂｌｏｃｋｅｄｂｙｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｚｉｎｃ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＰｏｌｌｕｔ，２０２３，３２０：１２１０８４－１２１０８６．［１４］ＮＥＴＯＩＶＳ，ＰＩＮＴＯＡＰ，ＭＵＮＯＺＶＲ，ｅｔａｌ．Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃａｎｄｍｕｌｔｉ－ｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｔｉｏｎｓｏｆｐｈｙｓｉｃａｌｅｘｅｒｃｉｓｅｏｎＰＧＣ－１αｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇｔｈｅａｇｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．ＡｇｅｉｎｇＲｅｓＲｅｖ，２０２３，８７：１０１９３５－１０１９５４．㊀［１５］ＰＵＩＧＳＥＲＶＥＲＰ，ＷＵＺ，ＰＡＲＫＣＷ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｌｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｏ⁃ａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏａｄａｐｔｉｖｅｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９８，９２（６）：８２９－３９．［１６］ＬＩＬ，ＬＵＺ，ＷＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎａｌｌｅｖｉａｔｅｓｃｈｒｏｎｉｃｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｉｓｏｒｄｅｒａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｎｅｒｇｅｔｉｃｄｙｓ⁃ｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＧＰＲ３０－ＡＭＰＫ－ＰＧＣ－１αｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈ⁃ｗａｙｓｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒｓｏｆｂｒｏｉｌｅｒｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．ＰｏｕｌｔＳｃｉ，２０２３，１０３（１）：１－１２．［１７］ＧＡＲＮＩＥＲＡ，ＦＯＲＴＩＮＤ，ＺＯＬＬＪ，ｅｔａｌ．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄｃｈａｎｇｅｓｉｎ。
34猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2016年33卷第11期我国地方猪种肉质特性及其遗传改良姜延志1，陈燕1，朱 砺2，李学伟2*（1.四川农业大学生命科学学院，四川 雅安 625014；2.四川农业大学动物科技学院，四川 成都 610000）我国是猪肉生产和消费大国，随着人民生活水平的提高，肉品消费市场对猪肉也由以前单纯对量的追求转变为对优质猪肉的追求，猪肉品质的下降已经严重影响了产肉量提高所带来的经济效益。
如何在提高产肉性能的同时确保肉质性状的遗传改良是当今全世界猪遗传育种学科的一个研究热点和难点。
肉质指标主要包括肉色、pH、系水力、大理石花纹、嫩度、风味等，遗传因素（品种和基因）是影响猪肉品质的重要因素。
我国地方猪种遗传资源丰富，具有优良的肉质特性，在生猪养殖中利用我国地方猪种开展杂交生产或新品种（配套系）培育实现猪肉品质遗传改良，是提高猪肉品质的重要途径。
猪基因组学的迅猛发展，基于肉质性状主效基因标记辅助选择和全基因组关联分析及选择成为提高猪肉品质新的遗传改良途径。
本文总结了我国代表性地方猪种的肉质特性，并对其肉质性状的遗传改良途径进行了探讨。
1 我国地方猪种肉质特性我国地方猪种素有肉质优良的盛名。
我们收集分析了最具代表性的地方猪种（包括华北型民猪、华中型金华猪、华南型陆川猪、高原型藏猪、西南型雅南猪、大河猪和荣昌猪）的肉质性状，发现我国地方猪种的肌肉品质具有肉色鲜红、保水力强和肌内脂肪含量高等优点（表摘 要：猪肉品质是影响养猪产业效益的重要因素，如何在提高产肉性能的同时，确保肉质性状遗传改良是当今全世界猪遗传育种研究领域的热点和难点。
我国地方猪种遗传资源丰富，具有优良的肉质特性，在生猪养殖中利用我国地方猪种开展杂交生产或新品种（配套系）培育实现猪肉品质遗传改良，是提高猪肉品质的重要途径。
该文总结了我国代表性地方猪种的肉质特性，并对其肉质性状的遗传改良途径进行了探讨。
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１０):１５２~１５７ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１０.０２１收稿日期:２０２３－０１－１０基金项目:山东省农业良种工程项目(２０２０ＬＺＧＣ０１２ꎬ２０２２ＬＺＧＣＱＹ００７)ꎻ枣庄市自主创新及成果转化项目(２０２２ＧＨ－２７)ꎻ山东省生猪产业技术体系(ＳＤＡＩＴ－０８－０３)作者简介:巩静(１９９９ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事猪遗传育种与繁殖研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:１５７８４３３１７５＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:王继英(１９７７ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向为猪遗传育种与繁殖ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｊｎｗａｎｇｊｉｙｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍ耿立英(１９７４ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为动物遗传育种与繁殖ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｒｏｓｅｇｅｎｇｌｙ＠１２６.ｃｏｍＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究巩静１ꎬ２ꎬ杨晴１ꎬ２ꎬ王艺盼３ꎬ王彦平２ꎬ朱晓东３ꎬ张传生１ꎬ耿立英１ꎬ王继英２(１.河北科技师范学院动物科技学院ꎬ河北秦皇岛㊀０６６６００ꎻ２.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.枣庄黑盖猪养殖有限公司ꎬ山东枣庄㊀２７７１００)㊀㊀摘要:黑色素皮质素受体１(ＭＣ１Ｒ)基因是调控哺乳动物毛色的一个关键基因ꎮ为了解杜洛克和枣庄黑盖猪杂交组合(简称杜黑猪)中ＭＣ１Ｒ基因多态性与毛色表型的关系ꎬ本研究以３９０头杜黑猪Ｆ２代个体和１８头枣庄纯种黑盖猪为研究对象ꎬ对Ｆ２代群体进行毛色表型类型分组ꎬ利用液相芯片捕获测序技术鉴定ＭＣ１Ｒ基因中影响毛色的１０个ＳＮＰ位点的基因型ꎮ结果表明ꎬ杜黑猪Ｆ２代群体出现了毛色分离ꎬ其中ꎬ７５.１３％的个体为全黑色ꎬ１３.０８％的个体为棕红色ꎬ其余１１.７９％的个体呈现混杂色ꎬ包括黑红条纹㊁棕色偏黄㊁棕色偏白等ꎮ测定的５个多态ＳＮＰ位点中ꎬＥＤ１等位基因３个ＳＮＰ位点(ｒｓ４５４３５０３１㊁ｒｓ４５４３４６３０㊁ｒｓ４５４３４６２９)的突变纯合型(ＧＧ㊁ＧＧ㊁ＴＴ)个体表现为黑红条纹ꎬ野生纯合型(ＡＡ㊁ＡＡ㊁ＣＣ)个体表现为棕红色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＧＡ㊁ＴＣ)个体大部分(８０.８３％)表现为黑色ꎬ少部分(１９.１７％)为黑色红纹㊁棕色偏黄和棕色偏白ꎮｅ等位基因２个ＳＮＰ位点(ｒｓ４５４３５０３２㊁ｒｓ３２１４３２３３３)的突变纯合基因型(ＡＡ㊁ＴＴ)个体全部为棕红色ꎬ野生纯合基因型(ＧＧ㊁ＣＣ)个体全部为黑色毛色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＴＣꎬＡＡ㊁ＴＣꎬＧＡ㊁ＴＴ)大部分(８０.９９％)为黑色毛色ꎬ少部分个体(１９.０１％)毛色为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白ꎮＨａｐｌｏＶｉｅｗ单倍型分析表明５个ＳＮＰ高度连锁ꎬ位于１个单倍型块内ꎮ本研究结果表明ꎬ杜黑猪毛色黑色对棕红色为不完全显性ꎬ利用ＭＣ１Ｒ基因的５个ＳＮＰ标记进行毛色分子标记辅助选择可快速剔除隐性棕红色等位基因ꎬ使杜黑猪新品种的毛色迅速固定为全黑色ꎬ以加速新品种培育进程ꎮ关键词:杜黑猪ꎻ毛色ꎻＭＣ１Ｒ基因ꎻＳＮＰꎻ基因型中图分类号:Ｓ８２８.１３㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１０－０１５２－０６ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＭＣ１ＲＧｅｎｅａｎｄＣｏａｔＣｏｌｏｒｏｆＤｕｈｅｉＰｉｇｓＧｏｎｇＪｉｎｇ１ꎬ２ꎬＹａｎｇＱｉｎｇ１ꎬ２ꎬＷａｎｇＹｉｐａｎ３ꎬＷａｎｇＹａｎｐｉｎｇ２ꎬＺｈｕＸｉａｏｄｏｎｇ３ꎬＺｈａｎｇＣｈｕａｎｓｈｅｎｇ１ꎬＧｅｎｇＬｉｙｉｎｇ１ꎬＷａｎｇＪｉｙｉｎｇ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｅｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＱｉｎｈｕａｎｇｄａｏ０６６６００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄＰｏｕｌｔｒｙＭｕｌｔｉ￣ｏｍｉｃｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＺａｏｚｈｕａｎｇＨｅｉｇａｉＰｉｇＢｒｅｅｄｉｎｇＣｏ.ꎬＬｔｄ.ꎬＺａｏｚｈｕａｎｇ２７７１００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｅｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ￣１ｒｅｃｅｐｔｏｒ(ＭＣ１Ｒ)ｇｅｎｅｉｓａｋｅｙｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍａｍｍａｌｉａｎｃｏａｔｃｏｌｏｒ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＭＣ１ＲｇｅｎｅａｎｄｃｏａｔｃｏｌｏｒｏｆｔｈｅｃｒｏｓｓｂｒｅｄｐｉｇｓｆｒｏｍＤｕｒｏｃａｎｄＺａｏｚｈｕａｎｇＨｅｉｇａｉｐｉｇｓ(Ｄｕｈｅｉｐｉｇｓｆｏｒｓｈｏｒｔ)ꎬｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｃｏａｔｃｏｌｏｒｏｆ３９０Ｆ２Ｄｕ￣ｈｅｉｐｉｇｓｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄꎬａｎｄ１０ＳＮＰｌｏｃｉｏｆＭＣ１Ｒｏｆ３９０Ｆ２Ｄｕｈｅｉｐｉｇｓａｎｄ１８ＺａｏｚｈｕａｎｇＨｅｉｇａｉｐｉｇｓｗｅｒｅｇｅｎｏｔｙｐｅｄｂｙｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈｌｉｑｕｉｄｃｈｉｐ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏａｔｃｏｌｏｒｏｆＦ２ｐｉｇｓｗａｓｓｅｐａｒａ￣ｔｅｄ.Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙꎬ７５.１３％ｏｆｔｈｅＦ２ｐｉｇｓｗｅｒｅｂｌａｃｋꎬ１３.０８％ｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｂｒｏｗｎꎬａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒ１１.７９％ｓｈｏｗｅｄｍｉｘｅｄｃｏｌｏｒｓｕｃｈａｓｂｌａｃｋｗｉｔｈｒｅｄｓｔｒｉｐｅｓꎬｙｅｌｌｏｗｉｓｈｂｒｏｗｎａｎｄｗｈｉｔｉｓｈｂｒｏｗｎ.Ａｍｏｎｇｔｈｅｆｉｖｅｍｅａｓ￣ｕｒｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＳＮＰｓꎬｐｉｇｓｗｉｔｈｍｕｔａｎｔｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓ(ＧＧꎬＧＧꎬＴＴ)ａｔ３ＳＮＰｌｏｃｉ(ｒｓ４５４３５０３１ꎬｒｓ４５４３４６３０ꎬｒｓ４５４３４６２９)ｏｆＥＤ１ａｌｌｅｌｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬｗｈｉｌｅｔｈｏｓｅｗｉｔｈｗｉｌｄｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏ￣ｔｙｐｅｓ(ＡＡꎬＡＡꎬＣＣ)ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｒｏｗｎｃｏａｔｃｏｌｏｒ.Ｔｈｅｍａｊｏｒｉｔｙ(８０.８３％)ｏｆｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｐｉｇｓ(ＧＡꎬＧＡꎬＴＣ)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒ(１９.１７％)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｗｉｔｈｒｅｄｓｔｒｉｐｅｓꎬｙｅｌｌｏｗｉｓｈｂｒｏｗｎａｎｄｗｈｉｔｉｓｈｂｒｏｗｎ.Ｐｉｇｓｗｉｔｈｍｕｔａｎｔｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓ(ＡＡꎬＴＴ)ａｔ２ＳＮＰｌｏｃｉ(ｒｓ４５４３５０３２㊁ｒｓ３２１４３２３３３)ｏｆｅａｌｌｅｌｅｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｒｏｗｎｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬｗｈｉｌｅｔｈｏｓｅｗｉｔｈｗｉｌｄｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓ(ＧＧꎬＣＣ)ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒ.Ｔｈｅｍａｊｏｒｉｔｙ(８０.９９％)ｏｆｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｐｉｇｓ(ＧＡꎬＴＣ)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒꎬａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒ(１９.０１％)ｓｈｏｗｅｄｂｌａｃｋｗｉｔｈｒｅｄｓｔｒｉｐｅｓꎬｙｅｌｌｏｗｉｓｈｂｒｏｗｎａｎｄｗｈｉｔｉｓｈｂｒｏｗｎ.Ｈａｐ￣ｌｏＶｉｅｗｈａｐｌｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｉｖｅＳＮＰｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｌｉｎｋｅｄꎬａｎｄｌｏｃａｔｅｄｉｎｏｎｅｈａｐｌｏｔｙｐｅｂｌｏｃｋ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｓｎｏｔｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｄｏｍｉｎａｎｔｏｖｅｒｂｒｏｗｎｉｓｈｒｅｄｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｎＤｕｈｅｉｐｉｇｓꎬｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｆｉｖｅＳＮＰｓｏｆＭＣ１ＲｃｏｕｌｄｑｕｉｃｋｌｙｅｌｉｍｉｎａｔｅｒｅｃｅｓｓｉｖｅｂｒｏｗｎｃｏａｔｃｏｌｏｒａｌｌｅｌｅｓａｎｄｆｉｘｔｈｅｂｌａｃｋｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆＤｕｈｅｉｐｉｇｓꎬａｎｄｆｉｎａｌｌｙａｃｃｅｌｅｒａｔｅｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｗｖａｒｉｅｔｉｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＤｕｈｅｉｐｉｇꎻＣｏａｔｃｏｌｏｒꎻＭＣ１ＲｇｅｎｅꎻＳＮＰꎻＧｅｎｏｔｙｐｅ㊀㊀毛色是猪的重要品种特征之一[１]ꎬ一直以来备受人们关注ꎮ在养猪生产中ꎬ毛色被广泛应用于评判品种的纯度㊁遗传稳定性㊁亲缘关系ꎬ以及在配套系培育中确定亲本的杂交组合类型等方面ꎮ揭示猪毛色的遗传机制及影响毛色的相关基因的遗传规律ꎬ对猪的育种具有重要意义[２－３]ꎮ毛色不同的品种或品系杂交时ꎬＦ１代呈现显性毛色ꎬＦ２代群体则会出现毛色分离[４]ꎬ选择毛色一致性强的种猪ꎬ淘汰毛色分离严重的个体ꎬ提高群体的整齐度ꎬ是新品种或配套系培育过程中的重要步骤[５]ꎮ哺乳动物毛色的形成是由一系列与黑色素细胞种类与形成有关的生理㊁生化反应的最终结果ꎬ遗传机制较复杂ꎮ猪的毛色大致分为野生型毛色㊁纯黑色㊁纯白色㊁棕红色㊁两头乌㊁花猪等ꎮ虽然属于质量性状ꎬ由少数几对基因决定ꎬ但由于基因之间有上位效应等遗传互作效应ꎬ调控毛色的基因及其作用机制尚未完全搞清楚ꎮ黑色素皮质素受体１(ＭＣ１Ｒ)基因是调控哺乳动物毛色的一个关键基因[６－８]ꎮＭＣ１Ｒ是Ｇ蛋白偶联受体家族的一员ꎬ由Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ基因座编码ꎬ通过与其配体促进剂α－黑素细胞刺激激素(α－ＭＳＨ)或颉颃剂刺鼠蛋白(Ａｇｏｕｔｉ)的竞争性结合分别形成真黑素或褐黑素ꎬ从而影响猪毛色表型[９]ꎮＫｉｊａｓ等[１０－１１]在欧洲野猪㊁欧洲大黑猪㊁中国梅山猪㊁汉普夏猪㊁大白猪㊁皮特兰猪及杜洛克猪的ＭＣ１Ｒ基因部分序列中发现８个突变构成５种等位基因ꎬ其中Ｅ＋对应于野猪的灰毛色ꎬＥＤ１对应于欧洲大黑猪和中国梅山猪的黑毛色ꎬＥＤ２对应于汉普夏猪的黑毛色ꎬＥｐ对应于皮特兰猪的黑色斑点及大白猪的白毛色ꎬｅ对应于杜洛克猪的棕红毛色ꎮＦａｎｇ等[１２]在３１头欧洲家猪和１９个亚洲品种家猪及１５头亚欧野猪的ＭＣ１Ｒ基因编码区内共发现１４个突变ꎬ其中包括Ｋｉｊａｓ等发现的８个突变ꎮ枣庄黑盖猪是山东省著名地方品种ꎬ毛色为３５１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀巩静ꎬ等:ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究纯黑色ꎬ具有肉质鲜嫩㊁产仔数多㊁抗病能力强㊁适应性强等优良特征ꎬ但其生长缓慢ꎬ产肉性能和胴体瘦肉率低[１３－１４]ꎮ利用杜洛克对枣庄黑盖猪进行杂交改良ꎬ瘦肉率㊁肉质性能及胴体性能均明显提高ꎬ为枣庄黑盖猪杂交改良的优良杂交组合之一ꎮ我国多数黑猪毛色黑色对棕红色呈显性遗传ꎬ杜洛克猪与枣庄黑盖猪(以下简称杜黑猪)Ｆ１杂交后代的毛色全部为全黑色ꎬＦ２代群体出现了毛色分离ꎮ常规育种对猪毛色的选育是横交固定后ꎬ通过持续的世代选育逐渐剔除后代中毛色出现分离的个体ꎬ周期长㊁效率低ꎬ严重影响和制约了专门化品系选育和新品种(配套系)育种进程ꎮ本研究以杜黑猪Ｆ２杂交群体和枣庄纯种黑盖猪为研究对象ꎬ对Ｆ２群体进行毛色表型类型分组ꎬ利用液相芯片捕获测序技术[１５]鉴定ＭＣ１Ｒ基因中影响毛色的１０个ＳＮＰ的基因型ꎬ研究不同基因型与毛色表型的关系ꎬ筛选可用于毛色分子标记辅助育种的ＳＮＰ位点ꎬ为快速建立毛色稳定的杜黑猪新品种培育体系奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验动物及毛色表型收集试验动物包括３９０头杜黑猪Ｆ２杂交后代和１８头枣庄纯种黑盖猪ꎬ均来自枣庄黑盖猪养殖有限公司ꎮ将毛色分为全黑色(枣庄黑盖猪毛色)㊁棕红色(杜洛克毛色)㊁黑红条纹㊁棕色偏黄色㊁棕色偏白色等类型ꎬ对Ｆ２代群体打耳号时记录每头试验猪的毛色ꎬ按毛色表型类型进行分组ꎬ统计每组毛色的个体数ꎮ１.２㊀基因组提取及ＳＮＰ基因型检测采集试验猪耳组织放入装有７５％乙醇的离心管中ꎬ－２０ħ冰箱存储ꎮ利用血液/组织/细胞提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取耳组织基因组ＤＮＡꎮ经Ｎａｎｏｄｒｏｐ(２６０/２８０在１.７~２.１范围之间ꎬ浓度>５０ｎｇ/mＬ)和０.８％琼脂糖凝胶电泳(条带清晰)检测合格后ꎬ委托博瑞迪生物技术有限公司利用定制的液相芯片进行基因组ＳＮＰ测定ꎮ该液相芯片为山东省农业科学院畜牧兽医研究所猪繁育饲养团队集成了近年来候选基因㊁功能基因组研究方面公开发表的功能ＳＮＰ㊁Ｄｅｌ㊁Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ等标记ꎬ采用博瑞迪ＧＢＴＳ技术体系中的ＧｅｎｏＢａｉｔｓ技术[１５]设计并优化开发的一款中低密度(６Ｋ)猪功能标记液相芯片ꎬ其中ＭＣ１Ｒ基因中影响毛色的１０个ＳＮＰ位点信息参考Ｆａｎｇ等[１２]ꎬ详见表１ꎮ㊀㊀表１㊀ＭＣ１Ｒ基因１０个ＳＮＰｓ位点信息突变名称突变ＩＤ基因组位置密码子碱基变化氨基酸变化突变类型Ｘ３０１ｒｓ３３７７６４７２３６＿１８１２８５３０１ＧңＡＴｙｒңＴｙｒ同义突变Ｘ２４３ｒｓ３２１４３２３３３６＿１８１４６１２４３ＣңＴＡｌａңＴｈｒ错义突变Ｘ１６６ｒｓ７８６４４１６７３６＿１８１６９２１６６ＧңＡＡｒｇңＴｒｐ错义突变Ｘ１６４ｒｓ４５４３５０３２６＿１８１６９７１６４ＧңＡＡｌａңＶａｌ错义突变Ｘ１２４ｒｓ３２６９２１５９３６＿１８１８１８１２４ＣңＴＡｓｐңＡｓｎ错义突变Ｘ１２２ｒｓ７０５２２２４３３６＿１８１８２４１２２ＣңＴＶａｌңＩｌｅ错义突变Ｘ１２１ｒｓ４５４３５０３１６＿１８１８２５１２１ＡңＧＡｓｎңＡｓｎ同义突变Ｘ１１７ｒｓ６９１７２９８０９６＿１８１８３７１１７ＣңＴＧｌｎңＧｌｎ同义突变Ｘ１０２ｒｓ４５４３４６３０６＿１８１８８３１０２ＡңＧＬｅｕңＰｒｏ错义突变Ｘ９５ｒｓ４５４３４６２９６＿１８１９０５９５ＣңＴＶａｌңＭｅｔ错义突变１.３㊀数据处理与分析利用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ软件对杜黑猪毛色表型类型进行统计分析ꎮ利用ＰＬＩＮＫｖ１.９０软件[１６]从液相芯片数据中调取出ＭＣ１Ｒ基因１０个ＳＮＰ的基因型数据ꎬ并计算基因型频率㊁基因频率和哈代温伯格平衡显著性ꎮ使用ＨａｐｌｏＶｉｅｗ４.１软件[１７]对ＳＮＰ进行单倍型分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀杜黑猪Ｆ２代群体毛色表型分析杜黑猪Ｆ２代个体出现了毛色的分离ꎮ其中ꎬ与母本(枣庄黑盖猪)全黑色毛色一致的个体最４５１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀多(２９３头)ꎬ占总数的７５.１３％ꎻ呈现父本(杜洛克)棕红色毛色的５１头ꎬ占总数的１３.０８％ꎻ其余４６头(１１.７９％)毛色呈现混杂颜色ꎬ其中５头呈黑红条纹ꎬ另外４１头毛色既不是黑色也不是棕红色ꎬ而是呈棕色偏黄(２４头)或棕色偏白(１７头)ꎮ２.２㊀杜黑猪Ｆ２代ＭＣ１Ｒ基因ＳＮＰ基因型和等位基因频率分析本研究测定的ＭＣ１Ｒ的１０个ＳＮＰ中ꎬ５个ＳＮＰ(ｒｓ３３７７６４７２３㊁ｒｓ７８６４４１６７３㊁ｒｓ３２６９２１５９３㊁ｒｓ７０５２２２４３３㊁ｒｓ６９１７２９８０９)在杜黑Ｆ２代群体中只有一种基因型ꎬ为单态ＳＮＰꎮ另外５个多态ＳＮＰ的基因型和等位基因信息详见表２ꎮ可以看出ꎬ５个多态ＳＮＰ的等位基因频率均在０.５左右ꎬ处于哈代温伯格平衡状态(Ｐ>０.０５)ꎬ这与试验猪为未经毛色选择的Ｆ２代群体有关ꎮ另外ꎬ５个多态ＳＮＰ不同基因型的个体数基本一致ꎬ推测可能存在紧密连锁ꎮ利用ＨａｐｌｏＶｉｅｗ４.１进一步分析了５个多态ＳＮＰ单倍型ꎬ定义了１个单倍型块(图２)ꎮ单倍型块中各个方块的颜色由浅至深ꎬ表示变异位点连锁程度由低到高ꎬ深红色表示完全连锁ꎮ结果显示ꎬ组成５个ＳＮＰ的各个方块均为深红色ꎬ表示它们紧密连锁在一起ꎮ单倍型ＣＧＧＧＴ的频率为０.５２６ꎬ含有该单倍型的个体全部为黑色毛色ꎬ单倍型ＴＡＡＡＣ的频率为０.４６９ꎬ含有该单倍型的个体全部为棕红色毛色ꎮ图１㊀杜黑猪Ｆ２代群体毛色统计㊀㊀表２㊀杜黑猪ＭＣ１Ｒ基因多态ＳＮＰ位点等位基因和基因型信息突变名称突变ＩＤ基因型个体数㊁频率等位基因频率哈代温伯格平衡Ｐ值Ｘ２４３ｒｓ３２１４３２３３３ＣＣＴＣＴＴＣＴ９５(０.２４３６)２０８(０.５３３３)８７(０.２２３１)０.５１０３０.４８９７０.２２８３Ｘ１６４ｒｓ４５４３５０３２ＡＡＡＧＧＧＡＧ８７(０.２２３１)２０７(０.５３０８)９６(０.２４６２)０.４８８５０.５１１５０.２６８７Ｘ１２１ｒｓ４５４３５０３１ＡＡＧＡＧＧＡＧ８７(０.２２３１)２０６(０.５２８２)９７(０.２４８７)０.４８７２０.５１２８０.３１３６Ｘ１０２ｒｓ４５４３４６３０ＡＡＧＡＧＧＡＧ８７(０.２２３１)２０８(０.５３３３)９５(０.２４３６)０.４８９７０.５１０３０.２２８３Ｘ９５ｒｓ４５４３４６２９ＣＣＴＣＴＴＣＴ８７(０.２２３１)２０９(０.５３５９)９４(０.２４１)０.４９１００.５０９００.１９２４图２㊀ＭＣ１Ｒ基因５个多态ＳＮＰ位点单倍型块２.３㊀毛色与基因型关系分析按照Ｋｉｊａｓ等[１０]的划分标准ꎬ本研究中的５个多态ＳＮＰ位点可以划分为ＥＤ１和ｅ等位基因ꎬ其中ＥＤ１等位基因包含ｒｓ４５４３５０３１㊁ｒｓ４５４３４６３０㊁ｒｓ４５４３４６２９３个位点ꎬｅ等位基因包含ｒｓ４５４３５０３２㊁ｒｓ３２１４３２３３３２个位点ꎮＥＤ１等位基因ＳＮＰ位点中ꎬ突变纯合基因型(ＧＧ㊁ＧＧ㊁ＴＴ型)的Ｆ２代杜黑猪全部为黑色毛色ꎬ野生纯合基因型(ＡＡ㊁ＡＡ㊁ＣＣ)为棕红色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＧＡ㊁ＴＣ)个体中大部分(８０.８３％)为黑色毛色ꎬ少部分个体(１９.１７％)毛色为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白(表３)ꎮｅ等位基因ＳＮＰ位点中ꎬ突变纯合基因型(ＡＡ㊁ＴＴ)个体全部为棕红毛色ꎬ野生纯合基因型(ＧＧ㊁ＣＣ)个体全部为黑色毛色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＴＣꎬＡＡ㊁ＴＣꎬＧＡ㊁ＴＴ)大部分个体５５１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀巩静ꎬ等:ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究(８０.９９％)为黑色毛色ꎬ少部分个体(１９.０１％)毛色为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白(表３)ꎮ５个多态ＳＮＰ位点在枣庄黑盖猪群体内均只有２种基因型ꎮＥＤ１等位基因有突变纯合基因型和杂合基因型ꎬ频率分别为８３.３３％和１６.６７％ꎻｅ等位基因有野生纯合基因型和杂合基因型ꎬ频率分别为８３.３３％和１６.６７％(表４)ꎮ㊀㊀表３㊀杜黑猪Ｆ２代毛色与ＳＮＰ基因型关系毛色ｒｓ３２１４３２３３３基因型个体数ｒｓ４５４３５０３２基因型个体数ｒｓ４５４３５０３１基因型个体数ｒｓ４５４３４６３０基因型个体数ｒｓ４５４３４６２９基因型个体数黑色ＣＣ９５ＧＧ９６ＧＧ９７ＧＧ９５ＴＴ９４黑色ＴＣ１９６ＧＡ１９５ＧＡ１９４ＧＡ１９６ＴＣ１９７黑红条纹ＴＣ５ＧＡ５ＧＡ５ＧＡ５ＴＣ５棕红色ＴＴ５３ＡＡ５３ＡＡ５３ＡＡ５３ＣＣ５３棕色偏黄ＴＣ２２ＡＡ２２ＧＡ２２ＧＡ２２ＴＣ２２棕色偏黄ＴＴ２ＧＡ２ＧＡ２ＧＡ２ＴＣ２棕色偏白ＴＣ１２ＡＡ１２ＧＡ１２ＧＡ１２ＴＣ１２棕色偏白ＴＴ５ＧＡ５ＧＡ５ＧＡ５ＴＣ５㊀㊀表４㊀枣庄黑盖猪毛色与ＳＮＰ基因型关系毛色ｒｓ３２１４３２３３３基因型个体数ｒｓ４５４３５０３２基因型个体数ｒｓ４５４３５０３１基因型个体数ｒｓ４５４３４６３０基因型个体数ｒｓ４５４３４６２９基因型个体数黑色ＣＣ１２ＧＧ１２ＧＧ１２ＧＧ１２ＴＴ１２黑色ＴＣ６ＧＡ６ＧＡ６ＧＡ６ＴＣ６等位基因频率/％Ｃ８３.３３Ｇ８３.３３Ｇ８３.３３Ｇ８３.３３Ｔ８３.３３Ｔ１６.６７Ａ１６.６７Ａ１６.６７Ａ１６.６７Ｃ１６.６７３㊀讨论与结论我国绝大多数地方猪种毛色均为黑色ꎬ而我国消费者对黑猪肉具有一种与生俱来的青睐感ꎮ市场需求决定育种目标ꎬ因此ꎬ利用国内外两类基因资源ꎬ培育优质高效㊁适应不同市场需求的专门化品系并配套生产黑色优质风味猪成为猪育种领域的主攻目标ꎮ然而ꎬ很多黑毛色的专门化品系选育和新品种(配套系)培育过程中后代会出现明显毛色分离ꎬ从而影响产品经济价值ꎮ研究毛色关键基因的突变位点与毛色类型的关系ꎬ寻找目标毛色的分子标记ꎬ可利用分子标记辅助育种快速建立育种目标毛色类型种群ꎮＭＣ１Ｒ基因位于Ｅ座位ꎬ定位在猪第６号染色体短壁的末端[１８]ꎮＫｉｊａｓ等[１０]研究认为ＥＤ１等位基因ｒｓ４５４３５０３１㊁ｒｓ４５４３４６３０和ｒｓ４５４３４６２９对应于欧洲大黑猪和中国梅山猪的黑毛色ꎬ其中ꎬｒｓ４５４３５０３１为同义突变ꎬｒｓ４５４３４６３０和ｒｓ４５４３４６２９是错义突变ꎬ使所编码的氨基酸Ｌｅｕ和Ｖａｌ突变为Ｐｒｏ和Ｍｅｔꎮ本研究中枣庄黑盖猪毛色为黑色ꎬ大部分个体(８３.３３％)为ＥＤ１等位基因突变基因型(ＧＧ㊁ＧＧ和ＴＴ)ꎬ与邓素华[１９]㊁师科荣[２０]等的研究结果相一致ꎬ表明我国地方猪种的黑毛色可能主要由显性黑等位基因ＥＤ１调控ꎮ杜黑猪群体中ꎬＥＤ１等位基因突变基因型个体全部表现为黑色毛色ꎬ杂合基因型(ＧＡ㊁ＧＡ和ＴＣ)个体中大部分(８０.８３％)表现为黑色毛色ꎬ其他表现为黑红条纹㊁棕色偏黄和棕色偏白ꎬ表明黑色对棕红色为不完全显性ꎬ与张建[２１]㊁曾检华[２２]等的报道一致ꎮｒｓ４５４３５０３２和ｒｓ３２１４３２３３３２个ＳＮＰ位点皆为错义突变ꎬ使Ａｌａ分别突变为Ｔｈｒ和Ｖａｌꎬ对应于Ｋｉｊａｓ等[１０]研究中的等位基因ｅꎬ其突变纯合基因型(ＡＡ和ＴＴ)决定了杜洛克猪的棕红毛色ꎮ本研究中ꎬ因为没有采集杜黑杂交猪的父本杜洛克样本ꎬ故没有检测杜洛克的ＭＣ１Ｒ基因ＳＮＰ基因型ꎮ但杜黑猪Ｆ２中棕红色猪全部为突变纯合基因型ꎬ与Ｋｉｊａｓ等[１０]报道的等位基因ｅ突变纯合基因型影响棕红色毛色的结论一致ꎮ６５１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀ＭＣ１Ｒ基因中ＥＤ１和ｅ等位基因的５个多态ＳＮＰ位于４４４ｂｐ的序列上ꎬ在分析杜黑猪Ｆ２个体时发现呈现相似的基因频率ꎬ推测可能存在紧密连锁ꎮ利用ＨａｐｌｏＶｉｅｗ４.１进行５个ＳＮＰ单倍型分析ꎬ结果显示５个ＳＮＰ定义了１个高度连锁的单倍型块ꎮ单倍型ＣＧＧＧＴ的频率为０.５２６ꎬ含有该单倍型的个体全部为黑色毛色ꎬ单倍型ＴＡ￣ＡＡＣ的频率为０.４６９ꎬ含有该单倍型的个体全部为棕红色毛色ꎮ该结果提示在杜黑猪新品种选育中ꎬ对ＭＣ１Ｒ基因的５个ＳＮＰ位点进行毛色分子标记辅助选择ꎬ有助于快速剔除隐性棕红色等位基因ꎬ使杜黑猪新品种的毛色迅速固定为全黑色ꎮ综上ꎬ本研究分析了ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪Ｆ２群体毛色的关系ꎬ揭示了杜黑猪毛色中黑色对棕红色为不完全显性ꎬ利用ＭＣ１Ｒ基因的５个多态ＳＮＰ标记进行分子标记辅助选择可快速剔除隐性棕红色等位基因ꎬ为杜黑猪新品种培育中黑色毛色固定奠定基础ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀国家畜禽遗传资源委员会.中国畜禽遗传资源志[Ｍ].北京:中国农业出版社ꎬ２０１１.[２]㊀ＬüＭＤꎬＨａｎＸＭꎬＭａＹＦꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔ￣ｅｄｗｉｔｈｓｉｘ￣ｗｈｉｔｅ￣ｐｏｉｎｔｃｏａｔｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎＤｉａｎｎａｎｓｍａｌｌ￣ｅａｒｐｉｇｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６:２７５３４. [３]㊀ＬｉｕＲꎬＪｉｎＬꎬＬｏｎｇＫＲꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ１(ＭＣ１Ｒ)ｇｅｎｅｉｎＴｉｂｅｔａｎｐｉｇｓａｎｄＬａｎｄｒａｃｅｐｉｇｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅꎬ２０１６ꎬ５７５(２):５３７－５４２.[４]㊀ＡｎｄｅｒｓｓｏｎＬ.Ｔｈｅｕｓｅｏｆａｗｉｌｄｐｉｇˑｄｏｍｅｓｔｉｃｐｉｇｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓｔｏｍａｐｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｔｒａｉｔｌｏｃｉ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｒｅｄｉｔｙꎬ１９９７ꎬ８８(５):３８０－３８３.[５]㊀李玉莲ꎬ吴买生ꎬ夏敏ꎬ等.湘沙猪配套系毛色遗传研究[Ｊ].养猪ꎬ２０２１(４):７０－７２.[６]㊀ＺｈｏｎｇＨＷꎬＺｈａｎｇＪꎬＴａｎＣꎬｅｔａｌ.Ｐｉｇｃｏａｔｃｏｌｏｒｍａｎｉｐｕｌａ￣ｔｉｏｎｂｙＭＣ１Ｒｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃ￣ｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２２ꎬ２３(１８):１０３５６.[７]㊀ＪｉＲＬꎬＴａｏＹＸ.Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｐｉｇ￣ｍｅｎｔａｔｉｏｎ:ｉｎｓｉｇｈｔｓｆｒｏｍｌａｒｇｅａｎｉｍａｌｓ[Ｊ].ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＭｏｌｅｃｕ￣ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１８９(１):１７９－２１３.[８]㊀ＦａｎＹＫꎬＷｕＸＷꎬＬｉＹＭꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎｔｈｅ５ᶄ￣ｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＭＣ１ＲｏｎｆｅａｔｈｅｒｃｏｌｏｒｉｎＴａｉｈａｎｇｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１０１(１２):１０２１９２. [９]㊀Ｇａｒｃíａ￣ＢｏｒｒóｎＪＣꎬＳáｎｃｈｅｚ￣ＬａｏｒｄｅｎＢＬꎬＪｉｍéｎｅｚ￣ＣｅｒｖａｎｔｅｓＣ.Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ￣１ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００５ꎬ１８(６):３９３－４１０. [１０]ＫｉｊａｓＪＭＨꎬＷａｌｅｓＲꎬＴöｒｎｓｔｅｎＡꎬｅｔａｌ.Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎｒｅｃｅｐ￣ｔｏｒ１(ＭＣ１Ｒ)ｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｃｏａｔｃｏｌｏｒｉｎｐｉｇｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ１９９８ꎬ１５０(３):１１７７－１１８５.[１１]ＫｉｊａｓＪＭＨꎬＭｏｌｌｅｒＭꎬＰｌａｓｔｏｗＧꎬｅｔａｌ.Ａｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｍｕｔａ￣ｔｉｏｎｉｎＭＣ１Ｒａｎｄａｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｓｏｍａｔｉｃｒｅｖｅｒｓｉｏｎｓｃａｕｓｅｂｌａｃｋｓｐｏｔｔｉｎｇｉｎｐｉｇｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００１ꎬ１５８(２):７７９－７８５.[１２]ＦａｎｇＭＹꎬＬａｒｓｏｎＧꎬＲｉｂｅｉｒｏＨＳꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｍｏｄｅｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｔａｃｏａｔｃｏｌｏｒｌｏｃｕｓｉｎｗｉｌｄａｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃｐｉｇｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００９ꎬ５(１):ｅ１０００３４１.[１３]王彦平ꎬ林松ꎬ呼红梅ꎬ等.枣庄黑盖猪生长和胴体品质性能测定的初步研究[Ｊ].猪业科学ꎬ２０１９ꎬ３６(５):１３０－１３１. [１４]王继英ꎬ王彦平ꎬ林松ꎬ等.屠宰体重对枣庄黑盖猪胴体及肉质的影响[Ｊ].猪业科学ꎬ２０２０ꎬ３７(９):１３０－１３２. [１５]徐云碧ꎬ杨泉女ꎬ郑洪建ꎬ等.靶向测序基因型检测(ＧＢＴＳ)技术及其应用[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２０ꎬ５３(１５):２９８３－３００４.[１６]ＰｕｒｃｅｌｌＳꎬＮｅａｌｅＢꎬＴｏｄｄ－ＢｒｏｗｎＫꎬｅｔａｌ.ＰＬＩＮＫ:ａｔｏｏｌｓｅｔｆｏｒｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄｌｉｎｋａｇｅａｎａｌｙｓｅｓ[Ｊ].ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２００７ꎬ８１(３):５５９－５７５.[１７]ＢａｒｒｅｔｔＪＣꎬＦｒｙＢꎬＭａｌｌｅｒＪꎬｅｔａｌ.Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ:ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｖｉ￣ｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＬＤａｎｄｈａｐｌｏｔｙｐｅｍａｐｓ[Ｊ].Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２００５ꎬ２１(２):２６３－２６５.[１８]ＭａｒｉａｎｉＰꎬＭｏｌｌｅｒＭＪꎬＨøｙｈｅｉｍＢꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎｃｏａｔｃｏｌｏｒｌｏｃｕｓａｎｄｔｈｅｌｏｃｉｆｏｒｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐＯａｎｄｔｙｒｏｓｉｎｅａｍｉｎ￣ｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｒｅｏｎｐｉｇｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ６[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅ￣ｒｅｄｉｔｙꎬ１９９６ꎬ８７(４):２７２－２７６.[１９]邓素华ꎬ高军ꎬ任军ꎬ等.猪黑素皮质素受体１(ＭＣ１Ｒ)基因与毛色表型的研究[Ｊ].遗传学报ꎬ２００３ꎬ３０(１０):９４９－９５４.[２０]师科荣ꎬ王爱国ꎬ李宁ꎬ等.中国地方猪种黑素皮质激素受体１基因(ＭＣ１Ｒ)的单核苷酸多态性[Ｊ].中国科学(Ｃ辑:生命科学)ꎬ２００４ꎬ３４(２):１４４－１４９.[２１]张建ꎬ陈伟ꎬ王慧ꎬ等.猪毛色遗传机制的研究进展[Ｊ].猪业科学ꎬ２０１３ꎬ３０(１):１００－１０３.[２２]曾检华ꎬ罗艳凤ꎬ胡杰ꎬ等.不同黑猪杂交组合生产性能研究与分析[Ｊ].养猪ꎬ２０１５(１):６１－６４.７５１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀巩静ꎬ等:ＭＣ１Ｒ基因多态性与杜黑猪毛色关系研究。
钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白系统在雄性生殖调控中的研究进展朱桂玉【摘要】钙蛋白酶(calpain)是一族钙离子依赖性的、水解半胱氨酸的蛋白酶,钙蛋白酶抑制蛋白(cal-pastatin)是钙蛋白酶的特异性抑制蛋白.钙蛋白酶-钙蛋白酶抑制蛋白系统在多种细胞中发挥作用,本文就国内外对该系统在雄性生殖调控中的作用的研究情况作一概括,为人们进一步了解该系统奠定基础.【期刊名称】《泰山学院学报》【年(卷),期】2014(036)003【总页数】4页(P26-29)【关键词】钙蛋白酶;钙蛋白酶抑制蛋白;生殖调控【作者】朱桂玉【作者单位】泰山学院生物与酿酒工程学院,山东泰安271021【正文语种】中文【中图分类】Q55钙蛋白酶(calpain)是一个依赖于Ca2+的半胱氨酸蛋白酶(通过半胱氨酸位点水解蛋白)，它水解的蛋白能在一系列生理、生化反应中发挥作用，包括细胞骨架的形成、细胞增殖、信号传导、细胞调亡与坏死、细胞内物质运输、蛋白的合成和降解等.钙蛋白酶与多种疾病有关，包括糖尿病、白内障、细胞硬化症、癌症、杜氏肌营养不良、老年痴呆等.1 钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白在人类中，钙蛋白酶家族一共有14个成员，在其众多成员中，钙蛋白酶1(calpain－1/μ－calpain)和钙蛋白酶2(calpain－2/m－calpain)研究的最为深入.体外研究表明，各calpain成员对Ca2+的敏感度不同，5－50μM的Ca2+浓度能刺激calpain－1达到最大活性，而当Ca2+浓度为0.2－1μM能使calpain－2 活性达到最大.［1］Calpain的众多成员按其表达规律可以大致分为两类，第一类是在各种细胞中组成性表达的，包括calpain －1，2，5，7，10，13 和15;其余的只在某一种或几种细胞中表达，包括 calpain －3，6，8，9，11 和 12.比如calpain－11只在睾丸中表达，calpain－6只在胎盘中表达，calpain－3在骨骼肌，心肌和肝中特异表达［2］.Calpain的激活原理以及其作用于靶蛋白的具体机制非常复杂，calpain的活性可以被一种特异的钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)所调控，而迄今所确定的calpastatin的唯一作用就是抑制calpain的活性.Calpastatin由唯一一个基因编码，但是它却能运用不同位置的启动子以及选择性剪切产生十几种异构体，最后翻译成分子量为17－100多kDa不等的各种蛋白.虽然产生大量异构体的具体作用还有待于进一步研究，但它们都能结合到calpain上的三个位点，其中两个位点的结合必须有Ca2+的参与［1］.由于calpain－calpastatin系统在一系列生理过程中发生重要作用，因此机体需要对其进行精细而有效的调节，近年来，随着对calpain和calpastatin系统在生殖发育中的研究的逐步深入，人们发现calpain－calpastatin系统对精子和卵母细胞的发育、顶体反应、受精以及一些常见生殖疾病，如睾丸扭转、妊娠高血压综合症等有重要作用，本文将对calpain－calpastatin系统在雄性生殖发育过程中的调控机制进行下总结.2 雄性生殖系统中钙蛋白酶—钙蛋白酶抑制蛋白的调控最早关于calpain－calpastatin系统在雄性生殖发育中的研究始于1986年，Schollmeyer用免疫荧光技术将calpain－2定位于猪精子的顶体部位和中心粒附近，考虑到顶体反应和Ca2+浓度密切相关，因此Schollmeyer预测calpain－2可能参与了顶体反应［3］.Rojas等第一次在人的精子细胞内对calpain－calpastatin系统进行了较全面的定位研究，发现calpain－1和calpain－2在精子细胞中都有分布，同时，他用免疫印记的方法获得了一条68 kDa大小的calpastatin蛋白条带［4］，也有研究人员在人精子细胞中得到了除68kDa以外的另一条为110kDa左右的calpastatin蛋白［5］.Calpain家族众多成员中已经确定calpain－1，calpian－2和calpain－11在睾丸中存在，通过western杂交证明精子中的calpain－1和calpain－2蛋白与其他组织中的并无差异［4，6］，而calpain－11则是在睾丸中生精细胞特异表达，其蛋白序列和结构与较保守的calpain－1和calpain－2有一定的区别，但其主要功能域都是保守的［7］.人的睾丸特异calpastatin蛋白大小大约为68kDa，由一个40个氨基酸组成的N端结构域和结构域II，III和IV组成，其中N端结构域为睾丸特异的，其余结构域部分和其他体细胞calpastatin蛋白完全一样［5］.通过绿色荧光蛋白示踪技术对其N端结构域进行研究，发现其能引导calpastatin蛋白定位于膜上.而在小鼠中睾丸特异calpastatin蛋白中也观察到了类似的N端结构域，并发现这个结构域内的一个十四烷基化位点对其膜定位有关键作用，对这个位点进行定点突变后calpastatin均匀分布于精子内［5］.2.1 钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白在精子发育过程中的表达Sultana研究了calpain在精子发育过程中的表达变化规律，发现calpain1在大鼠生长到20－25天左右时，即精母细胞(spermatocytes)发生减数分裂的旺盛时期，睾丸中的calpain－1基因表达量有显著的升高，他预测calpain－1在精子细胞发生过程中有重要作用，而calpain－2保持相对稳定［8］.在小鼠中，在精子发育的各个阶段都能检测到calpain－1和calpain－2的mRNA以及蛋白的表达，而calpain－1在晚期的次级精母细胞(second spermatocytes)和早期的精细胞(spermatids)中表达量显著升高［9］，这一现象与大鼠中的相同.Calpain－2在小鼠精子发育中的表达也相对稳定，与calpain－1不同的是，calpain－2在输精管的周围细胞中也有少量表达［9］.Calpain－11是睾丸特异表达的蛋白，经检测发现calpain－11的mRNA和蛋白在处于粗线期的精母细胞(pachytene spermatocytes)中才开始表达，同样在成熟精子的顶体部位也能检测到其蛋白存在［7］.Wei等利用荧光原位杂交技术对calpastatin在人睾丸中进行了定位和表达分析，发现calpastatin的mRNA在精细胞中大量分布，由于精细胞是由次级精母细胞经过第二次减数分裂后产生的，说明calpastatin在减数分裂后的精子发育中有重要作用［10］.同样，在小鼠中，calpastatin基因只在单倍体的生殖细胞中表达，如精细胞，而在双倍体的生殖细胞中没有表达，如精母细胞［5］.总结各研究结果发现，calpain－1和calpain－2在各种生精细胞中都有表达，而calpastatin在还未发生减数分裂的精母细胞中没有表达，只在进入减数分裂后的精母细胞中表达，由于发生减数分裂的精母细胞是发生调亡程度较高的细胞，因此calpastatin的这种时期特异表达可能与精母细胞的调亡有一定联系.精母细胞自身发生调亡，将活力低和有突变的细胞淘汰掉对提高精子质量有重要作用.Somwaru 等成功的用转基因小鼠的方法将calpastatin基因在精母细胞中进行异位表达，接着利用热刺激诱导睾丸内的细胞发生调亡，结果显示粗线期的精母细胞是发生调亡程度最高的细胞，而转基因小鼠中调亡细胞的数量比正常小鼠显著减少，说明calpastatin有抑制精母细胞调亡的作用［11］.Coureuil等利用一个不育转基因小鼠品系(MTp53)，该小鼠能在次级精母细胞和精细胞中异位过表达P53，使这些细胞发生调亡而产生不育.经检测发现calpain－1在这两类细胞中表达升高，而当加入calpain的抑制剂后，细胞的调亡现象在一定程度上被抑制，说明calpain 在这两类细胞的调亡过程中起到了关键作用［12］.以上结果分别从正反两方面证明了calpain－calpastatin系统在生精细胞的末端分化和调亡过程中发挥了重要作用.2.2 钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白在精子中的分布与顶体反应研究人员对calpain－calpastatin蛋白在精子中的空间分布规律进行了大量研究，发现calpain主要分布在精子头部的顶体部位［5，6，9］以及颈部［13］，进一步的研究发现在短尾猕猴的精子的顶体外膜和细胞浆膜之间，分布于大量的calpain－1和calpain－2蛋白［14］.Calpastatin蛋白也主要分布在精子头部相同的区域［14］.Ozaki等发现在体外的精子中加入少量孕酮后，精子内的钙离子浓度显著升高，同时还使calpain－1蛋白，由头颈部转移到颈部和尾部，但是具体机制不明确［13］.获能的精子渗入卵母细胞前要发生顶体反应(acrosome reaction)，而Ca2+是顶体反应中所必须的，calpain－calpastatin蛋白在顶体附近的分布以及其与Ca2+浓度的密切关系说明该系统可能在顶体反应中发挥了重要作用.Rojas和Moretti－Rojas最早对calpain－calpastatin系统在顶体反应中的作用进行了研究，发现在精子中加入calpain的抑制因子(calpain inhibitor－I)后，精子的渗入率显著降低，但是该抑制因子对精子活力以及卵母细胞没有明显作用，此外，加入calpain－1和calpain－2的抗体同样对顶体反应有抑制作用［15］.随后，大量研究表明calpain的各种抑制剂能不同程度的降低精子活力以及抑制顶体反应的发生［6，13，9，16］.Ashizawa等首次对禽类的精子中的 calpain 蛋白进行了研究，由于禽类动物的体温为40℃，其顶体反应和受精机理与哺乳动物有一定的区别.Ashizawa等发现Ca2+浓度在鸡的精子活力和顶体反应中发挥了关键的作用，体外实验表明，Ca2+浓度升高可以提高鸡精子的活力和促进顶体反应，而用PD 150606(特异的calpain抑制剂)对精子进行处理后，对顶体反应没有影响，但对精子的活力有抑制作用，进一步的实验发现PD 150606对去膜后的精子的活力没有影响，说明发挥功能的calpain蛋白主要分布在鸡精子的膜部位［16］.3 钙蛋白酶－钙蛋白酶抑制蛋白与某些雄性生殖疾病的关系雄性哺乳动物的睾丸扭转(Testicular torsion)会导致睾丸内细胞的缺血并发生坏死或者调亡，细胞会产生大量的一氧化氮，同时calpain蛋白的活性也显著升高，在此过程中如加入calpain的抑制剂，抑制calpain的蛋白水解活性，可以抑制精原细胞的调亡和坏死，从而说明抑制calpain可以对睾丸扭转损伤的恢复有一定作用，calpain蛋白可以作为治疗睾丸扭转一个药物靶点［17－18］.Umemoto等进一步研究了发生睾丸扭转过程中未发生损伤的细胞中的calpain蛋白的变化，发现当大鼠一侧的睾丸发生睾丸扭转损伤后，在另一侧的睾丸的精母细胞核中发现了大量的calpain－1，而calpain－2没有观察明显的变化，在未发生损伤的外周细胞中同样发现了调亡的现象，而calpain抑制剂也可以抑制这些细胞的调亡［19］.4 展望总之，目前的研究表明calpain－calpastatin在雄性生殖系统中发挥着重要作用.随着对calpaincalpastatin在生殖系统中的研究的逐渐深入，有望对这一系统在生殖调控方面的功能和发挥作用的具体机制有更准确的了解，在临床上可以利用它们作为药物的靶位点，为治疗相关疾病提供新途径，还可以运用到动物生产领域，提供动物的繁殖力，更好的为人类服务.［参考文献］［1］Goll D E，Thompson VF，Li H，et al.The calpain system［J］.PhysiolRev，2003，83(3):731 －801.［2］单体中，汪以真.钙蛋白酶系统研究进展［J］.中国饲料，2006(7):2. ［3］Schollmeyer J E.Identification of calpain II in porcine sperm［J］.Biol Reprod，1986，34(4):721 －731.［4］Rojas FJ，Brush M，Moretti－Rojas I.Calpain－calpastatin:a novel，complete calcium －dependent protease system in human spermatozoa ［J］.Mol Hum Reprod，1999，5(6):520 － 526.［5］Li S，Goldberg E.A novel N － terminal domain directs membrane 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－79.［17］Shiraishi K，Naito K，YoshidaK.Inhibition of calpain but not caspase protects the testis against injury after experimental testicular torsion of rat ［J］.Biol Reprod，2000，63(5):1538 －1548.［18］Shiraishi K，Naito K，Yoshida K.Nitric oxide promotes germ cell necrosis in the delayed phase after experimental testicular torsion of rat［J］.Biol Reprod，2001，65(2):514 －521.［19］Umemoto Y，Ozaki Y，Sasaki S，et al.Involvement of calpain for apoptosis in dysfunction of the unaffected testis in rats with experimental testicular torsion［J］.Am J Reprod Immunol，2001，45(4):239 －245.。
三个猪品种钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性研究程丰;赵聘;郁枫;王金勇;白小青【期刊名称】《河南畜牧兽医（市场版）》【年(卷),期】2005(026)008【摘要】采用3种限制性内切核酸酶对杜洛克、内江猪和荣昌猪共153头的钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因进行PCR-RFLP分析.结果表明:①HinfⅠ、MspⅠ和RsaⅠ均检测到多态性,同时还发现一个杜洛克个体的HinfⅠ-RFLP出现120 bp突变片段.②X2检验表明,HinfⅠ、MspⅠ和RsaⅠ酶切所产生的基因及基因类型处于Hardy-Weinberg平衡状态(p＜0.05);杜洛克、内江猪和荣昌猪三个品种猪的优势基因型分别为ABCCEE、AACCEE、AACCFF,在99%程度上分别与相应的品种有关.【总页数】2页(P5-6)【作者】程丰;赵聘;郁枫;王金勇;白小青【作者单位】信阳农业高等专科学校,河南,信阳,464000;信阳农业高等专科学校,河南,信阳,464000;西北农林科技大学动物科技学院;重庆市养猪科学研究院;重庆市养猪科学研究院【正文语种】中文【中图分类】S828.2【相关文献】1.三个猪品种钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性研究 [J], 程丰;赵聘;郁枫;王金勇;白小青2.牦牛钙蛋白酶抑制蛋白基因部分片段PCR-RFLP多态性研究 [J], 金鑫燕3.新疆阿勒泰羊钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性与嫩度的关联性分析 [J], 田佳;周卫东;马晓燕;郑文新;高维明;迪拉热·沙塔尔;左晓佳;师帅;张蓉银4.猪钙蛋白酶抑制蛋白基因外显子9多态性检测及其对山西白猪背膘厚的影响 [J], 赵先萍;黎威;王彦玲;贺晓丽;高鹏飞;郭晓红;李步高;曹果清5.牛钙蛋白酶抑制蛋白基因(CAST)的多态性的研究 [J], 邱大伟;赵金红;黄勇富因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(８):１７２２￣１７２８ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ贺卫华ꎬ陈诗琪ꎬ王丽华ꎬ等.猪ＵＧＴ１Ａ１酶基因的克隆㊁表达及其对呕吐毒素特异性降解的作用[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(８):１７２２￣１７２８.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０８.０１２猪ＵＧＴ１Ａ１酶基因的克隆㊁表达及其对呕吐毒素特异性降解的作用贺卫华１ꎬ㊀陈诗琪１ꎬ㊀王丽华１ꎬ㊀丁㊀斓１ꎬ㊀翟晓虎１ꎬ㊀杨俊花２(１.江苏农牧科技职业学院ꎬ江苏泰州２２５３００ꎻ２.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所ꎬ上海２０１４０３)收稿日期:２０２３￣０３￣２１基金项目:江苏农牧科技职业学院科研项目(ＮＳＦ２０２３ＺＲ０６)ꎻ第二批国家级职业教育教师教学创新团队课题研究项目(ＺＩ２０２１１００１０４)作者简介:贺卫华(１９８２－)ꎬ女ꎬ山西太谷人ꎬ硕士ꎬ副教授ꎬ主要从事动物毒理学研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｈｅｗｅｉｈｕａ０１０＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:翟晓虎ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｉｘｉａｏｈｕ０１０＠１６３.ｃｏｍꎻ杨俊花ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙａｎｇｊｕｎｈｕａ３０３＠１２６.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀为了在Ｓｆ９昆虫细胞中表达猪尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(ＵＧＴ)１Ａ１蛋白并对其进行功能鉴定ꎮ首先ꎬ合成密码子优化的ＵＧＴ１Ａ１基因ꎬ克隆到载体ｐＦａｓｔＢａｃⅠ中ꎬ构建杆状病毒重组转移载体ꎬ然后导入ＤＨ１０Ｂａｃ中ꎬ获得重组的穿梭质粒ꎬ再转染Ｓｆ９细胞得到重组杆状病毒ꎬ采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法鉴定重组后ＵＧＴ１Ａ１蛋白的表达ꎻ对镍柱亲和层析纯化获得目的蛋白酶的动力学参数及其对呕吐毒素(ＤＯＮ)的代谢进行检测ꎮ结果表明:ｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１质粒被成功构建ꎬ导入感受态细胞ＤＨ１０Ｂａｃ中获得重组穿梭质粒Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１ꎬ再转染昆虫细胞Ｓｆ９获得重组Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１蛋白ꎬ能够与多组氨酸标签单抗发生特异性反应ꎮ优化目的蛋白表达ꎬ并对其体外代谢ＤＯＮ进行了酶学性质和动力学参数的研究ꎮ本研究通过基因克隆㊁表达和代谢产物的分析等技术手段获得具有较好的生物活性且纯化的Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１蛋白ꎬ为揭示ＤＯＮ在肝脏中的代谢途径㊁代谢产物和关键调控因子提供参考ꎮ关键词:㊀呕吐毒素(ＤＯＮ)ꎻ葡萄糖醛酸缀合物ꎻ尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(ＵＧＴ)ꎻ猪肝脏中图分类号:㊀Ｓ８５２.２３㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０８￣１７２２￣０７ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅＵＧＴ１Ａ１ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｓｐｅｃｉａｌｅｆｆｅｃｔｏｆｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｆｏｒｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌＨＥＷｅｉ￣ｈｕａ１ꎬ㊀ＣＨＥＮＳｈｉ￣ｑｉ１ꎬ㊀ＷＡＮＧＬｉ￣ｈｕａ１ꎬ㊀ＤＩＮＧＬａｎ１ꎬ㊀ＺＨＡＩＸｉａｏ￣ｈｕ１ꎬ㊀ＹＡＮＧＪｕｎ￣ｈｕａ２(１.ＪｉａｎｇｓｕＡｇｒｉ￣ａｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙＶｏｃａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＴａｉｚｈｏｕ２２５３００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＡｇｒｉ￣ｆｏｏｄＳｔａｎｄａｒｄｓａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｇｈａｉＡ￣ｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１４０３ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ(ＵＧＴ)１Ａ１ｐｒｏｔｅｉｎｉｎＳｆ９ｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎꎬｔｈｅｃｏｄｏｎ￣ｏｐｔｉｍｉｚｅｄＵＧＴ１Ａ１ｇｅｎｅｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＦａｓｔＢａｃＩｖｅｃｔｏｒｔｏｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｔｒａｎｓｆｅｒｖｅｃｔｏｒ.ＴｈｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏＤＨ１０Ｂａｃｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｃｏｍｂｉ￣ｎａｎｔｓｈｕｔｔｌｉｎｇｐｌａｓｍｉｄꎬｗｈｉｃｈｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｔｈｅＳｆ９ｃｅｌｌｓｔｏｇｅｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ.Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉ￣ｎａｎｔＵＧＴ１Ａ１ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ.Ｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅａｓｅｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｎｉｃｋｅｌｃｏｌ￣ｕｍｎａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｉｔｓｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｅｆｆｅｃｔｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ(ＤＯＮ)ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｗａｓｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｄｉｎｔｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓＤＨ１０ＢａｃｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｈｕｔｔｌｉｎｇｐｌａｓｍｉｄＢａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｈｕｔｔｌｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｒａｎｓｆｅｃｔＳｆ９ｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓａｎｄｏｂｔａｉｎｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＢａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１ꎬｗｈｉｃｈｗａｓｃａｐａｂｌｅｏｆｔａｋｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃ２２７１ｒｅａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈＨｉｓ￣ｔａｇｇｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ.ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＤＯＮｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅａｓｐｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｐｕｒｉｆｉｅｄＢａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１ｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｇｏｏｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｅｃｈｎｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｓｕｃｈａｓｇｅｎｅｃｌｏｎｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｒｅｖｅａｌｉｎｇｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓꎬｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｎｄｋｅｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓｏｆＤＯＮｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌꎻｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｃｏｎｊｕｇａｔｅꎻｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ(ＵＧＴ)ꎻｐｏｒ￣ｃｉｎｅｌｉｖｅｒ㊀㊀真菌毒素是在适宜的温度㊁湿度环境下ꎬ由真菌在粮食作物中产生的次级代谢产物ꎬ全球每年都因真菌毒素污染造成农产品及其加工制品质量降低ꎬ间接对畜禽和人类健康产生危害ꎬ每年造成的经济损失高达数百亿美元ꎮ联合国粮农组织统计发现ꎬ赭曲霉毒素㊁黄曲霉毒素㊁呕吐毒素(Ｄｅｏｘｙｎｉ￣ｖａｌｅｎｏｌꎬＤＯＮ)等在农产品里检出率较高[１]ꎮ其中ＤＯＮ的污染不仅范围广而且频率高ꎬ在日常生产中危害极大ꎮ因此ꎬ探索ＤＯＮ在生物机体内的转化代谢㊁降解途径和控制代谢的关键因子对畜禽健康和其加工制品的生物安全性及保护人类健康安全具有重大意义ꎮＤＯＮ属烯醇类化合物ꎬ其化学结构式中含有多个羟基ꎬ对细胞㊁肠道和肾脏等具有较强的毒性作用[２]ꎮ由于种属差异性ꎬ猪对ＤＯＮ的耐受性低[３]ꎮ以往有研究发现ꎬＤＯＮ在动物肠道或瘤胃中发生脱环氧作用并代谢产生脱环氧ＤＯＮ(ＤＯＭ１)[４]ꎮ有研究结果表明ꎬ由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(ＵＧＴ)催化的葡萄糖醛酸结合反应ꎬ是ＤＯＮ在肝脏内代谢的主要途径ꎬ代谢成为ＤＯＮ葡萄糖醛酸缀合物[５]ꎮＤＯＮ结构上的羟基结合葡萄糖醛酸后ꎬ亲水性大大增强ꎬ从而使生物机体更容易代谢和排泄ＤＯＮꎮＵＧＴ基因存在多态性ꎬ已有研究发现ꎬ人肝脏有１９种ＵＧＴ亚型ꎬ如ＵＧＴ１Ａ１㊁ＵＧＴ１Ａ３㊁ＵＧＴ２Ｂ７和ＵＧＴ２Ｂ１５等[６]ꎬ猪有ＵＧＴ２Ｂ３１㊁ＵＧＴ２Ｂ４㊁ＵＧＴ２Ａ１㊁ＵＧＴ１ＡＢ３等４种ＵＧＴ亚型ꎮ有研究发现ꎬ由于ＵＧＴ基因亚型不同ꎬ除去受生物年龄㊁种类和饮食方面的影响ꎬ不同基因亚型在机体中的表达也不同ꎬ以致于降解药物㊁毒素的效应也各不相同[７]ꎮ肝脏作为ＤＯＮ的主要解毒器官ꎬ在猪体内是如何将ＤＯＮ代谢为葡萄糖醛酸缀合物及哪种ＵＧＴ酶起主要作用ꎬ还未见报道[８]ꎮ因此ꎬ本实验室前期通过猪原代肝脏细胞培养ꎬ攻ＤＯＮ毒后发现猪ＵＧＴ１Ａ１表达量高ꎮ基于此ꎬ本试验拟通过质粒构建㊁Ｂａｃ￣ｔｏ￣Ｂａｃ重组表达系统完成猪肝脏中ＵＧＴ１Ａ１的克隆表达[９]ꎬ再通过超高效液相色谱￣串联质谱(ＵＰＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ)[１０￣１１]等技术分析ＤＯＮ的葡萄糖醛酸代谢物来充分验证关键酶的功能ꎮ本研究旨在探索猪体内真菌毒素ＤＯＮ降解的途径ꎬ挖掘潜在的降解酶及其功能ꎬ为后期靶向性开发ＤＯＮ高效脱霉剂㊁保障中国畜牧业养殖安全提供基础数据和新思路ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂ＤＯＮ标准品购自青岛普瑞邦生物工程有限公司ꎻＰＣＲ试剂盒㊁限制性内切酶和ＤＮＡ连接酶等购自宝生物工程(大连)有限公司ꎻＤＭＥＭ培养基和胰酶等购买于赛默飞世尔科技公司ꎻ组氨酸标签(Ｈｉｓ￣ｔａｇ)抗体购买于生工生物工程(上海)股份有限公司ꎻ质粒提取和胶回收试剂盒㊁Ｔｒｉｚｏｌ试剂购买于天根生化科技有限公司ꎻｐＦａｓｔＢａｃＴＭ１购买于赛默飞世尔科技公司ꎻＳｆ９细胞由上海市农业科学院动物传染病预防与生物技术研究课题组提供ꎮ本研究所用的主要仪器有:电泳凝胶成像系统ꎬ购自上海天能生命科学有限公司ꎻ微量紫外分光光度计ꎬ购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ꎻ蛋白质电泳仪㊁ＰＣＲ仪㊁核酸检测仪和多功能荧光酶标仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司ꎻ细胞培养箱购自赛默飞世尔科技公司ꎻ显微镜购自奥林巴斯(中国)有限公司ꎻ漩涡振荡器购自艾卡(广州)仪器设备有限公司ꎻ恒温混匀器和超低温冰箱购自艾本德(上海)国际贸易有限公司ꎻ电子天平购自梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司等ꎮ１.２㊀引物设计和目的基因的扩增根据ＮＣＢＩ(美国国立生物技术信息中心)已有猪ＵＧＴ１Ａ１的基因序列ꎬ设计与合成引物ꎮ用实验室保存的新鲜猪原代肝细胞ｃＤＮＡ进行基因扩增ꎮ３２７１贺卫华等:猪ＵＧＴ１Ａ１酶基因的克隆㊁表达及其对呕吐毒素特异性降解的作用上游引物:５ᶄ￣ＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣ￣ＣＡＧＧＧＣＴＴ￣３ᶄꎬ设计增加ＢａｍＨⅠ的酶切位点(用于酶切)以及包含ＡＴＧ的起始密码子ꎻ下游引物:５ᶄ￣ＣＧＣＴＡＧＴＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴ￣３ᶄꎬ在终止密码子前加入连续编码６个组氨酸的序列以及ＨｉｎｄⅢ的酶切位点用于酶切ꎮＰＣＲ的总扩增体系为５０μｌ:上下游引物各２μｌꎬ２μｌＤＮＡ模板ꎬＰｒｅｍｉｘＰｒｉｍｅｓＳＴＡＲＨＳ高保真酶体系２５μｌꎬ最后用ｄｄＨ２Ｏ补充到５０μｌꎮ扩增程序:９４ħ保持５ｍｉｎꎻ９４ħ保持１５ｓꎬ５６ħ保持３５ｓꎬ７２ħ保持１ｍｉｎꎬ完成３０个循环ꎻ７２ħ延伸８ｍｉｎꎮ使用１％凝胶对ＰＣＲ产物进行电泳ꎬ并由生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎬ待用ꎮ１.３㊀重组ｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１质粒的构建在３７ħ条件下ꎬ用ＢａｍＨＩ及ＨｉｎｄⅢ对目的基因和转移载体质粒ｐＦａｓｔＢａｃⅠ双酶切２ｈꎬ产物通过ＤＮＡ胶回收ꎮ载体ｐＦａｓｔＢａｃⅠ片段与目的基因片段在ＤＮＡ连接酶作用下ꎬ４ħ连接过夜ꎬ转化感受态细胞ＪＭ１０９ꎮ采用具有氨苄抗性的ＬＢ固体培养基进行筛选ꎬ挑选若干单个菌落ꎬ用特异性引物进行ＰＣＲ扩增(方法同１.２)ꎬ小量提取质粒ꎮ对阳性克隆提取质粒后进行ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定㊁测序ꎬ检验插入位置和序列的正确性ꎬ其中完整的被命名为ｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１ꎮ１.４㊀重组穿梭质粒Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１的构建及鉴定按Ｂａｃ￣ｔｏ￣Ｂａｃ表达系统的操作说明ꎬ用５μｌ的ｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１转化感受态细胞ＤＨ１０Ｂａｃꎮ在摇床上３７ħ培养４ｈꎮ将培养液倍比稀释ꎬ选取适当的２个浓度的菌液涂布在ＬＢ筛选培养基[包含质量浓度为１０μｇ/ｍｌ的庆大霉素㊁５０μｇ/ｍｌ的卡那霉素㊁７μｇ/ｍｌ的四环素㊁４０μｇ/ｍｌ的ＩＰＴＧ(异丙基￣β￣Ｄ￣硫代半乳糖苷)和２００μｇ/ｍｌ的Ｘ￣Ｇａｌ(５￣溴￣４￣氯￣３￣吲哚￣β￣Ｄ￣半乳糖苷)]上ꎬ３７ħ倒置培养４８ｈꎮ挑取白色单菌落再次培养ꎬ接种到ＬＢ液体培养基中ꎬ３７ħ过夜ꎮ提取重组质粒Ｂａｃｍｉｄｓꎬ并用引物(ＭＦ:５ᶄ￣ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ￣３ᶄꎬＭＲ:５ᶄ￣ＣＡＧ￣ＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ￣３ᶄ)进行ＰＣＲ验证ꎮ２０.０μｌ反应体系:２ˑＴａｑ１０ ０μｌꎬ上下游引物各０ ８μｌꎬ０ ５μｌＢａｃｍｉｄｓꎬｄｄＨ２Ｏ７ ９μｌꎮ扩增程序:９４ħ保持５ｍｉｎꎻ９４ħ保持２０ｓꎬ５６ħ保持１５ｓꎬ７２ħ保持５ｍｉｎꎬ循环３０次ꎻ最后７２ħ延伸５ｍｉｎꎮ成功的重组穿梭质粒被命名为Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１ꎮ１.５㊀重组杆状病毒的获得依据试剂盒ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎⅡＲｅａｇｅｎｔ的说明书ꎬ在Ｓｆ９细胞处于对数生长期时转染Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１ꎬ同时设置染毒组Ｓｆ９细胞作为阴性对照ꎬ２８ħ培养约７２ｈꎬ细胞出现明显病变时ꎬ收获Ｐ１代杆状病毒ꎬ继续传代ꎬ获得Ｐ２和Ｐ３代的重组杆状病毒毒株ꎮ提取基因组ＤＮＡꎬ用方法１.４中的引物扩增ꎬ完成重组杆状病毒的鉴定ꎮ１.６㊀重组蛋白质的表达及鉴定调节Ｓｆ９细胞数为１ｍｌ１.０ˑ１０６ꎬ将Ｐ３代Ｂａｃ￣ｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１接种于其中ꎬ２８ħ悬浮培养７２ ０ｈꎬ约８０％细胞出现病变时ꎬ收集细胞ꎮ取培养液ꎬ低速(３００ｒ/ｍｉｎ)离心１５ｍｉｎꎬ分离上清液和细胞ꎬ收集沉淀细胞ꎬ用含蛋白酶抑制剂的昆虫活性蛋白抽提试剂裂解细胞ꎬ３ˑ１０５ｇ离心后ꎬ用镍亲和层析柱进一步纯化蛋白质ꎮ先进行蛋白质电泳ꎬ转染ＰＶＤＦ(聚偏二氟乙烯)膜ꎬ用含量为５％的脱脂奶粉封闭１ ０ｈꎬ一抗用鼠抗Ｈｉｓ(１ʒ２５００ꎬ稀释度)４ħ孵育过夜ꎬ二抗为羊抗鼠抗体(１ʒ２５００ꎬ稀释度)室温培养１ ５ｈꎬ用ＤＡＢ(二氨基联苯胺)试剂盒显色ꎬ检测表达蛋白质的准确性ꎮ１.７㊀重组酶动力学参数测定及对ＤＯＮ的降解分析１.７.１㊀重组酶动力学参数测定㊀精密量取不同浓度的ＤＯＮ溶液加入到最佳酶浓度的重组酶蛋白稀释液中ꎬ选定最大激发波长４１０ｎｍꎬ在酶标仪上对空白Ｓｆ９蛋白液和含ＤＯＮ的Ｓｆ９蛋白液中的孵育液进行扫描ꎮ其中底物浓度分别为２μｍｏｌ/Ｌ㊁５μｍｏｌ/Ｌ㊁１０μｍｏｌ/Ｌ㊁２０μｍｏｌ/Ｌ㊁５０μｍｏｌ/Ｌ㊁１００μｍｏｌ/Ｌ㊁２００μｍｏｌ/Ｌꎬ重组酶质量浓度为１ｇ/Ｌꎬ３７ħ预孵育５ｍｉｎꎬ加入启动剂ＮＡＤＰ/ＮＡＤＰＨ(还原型辅酶Ⅰ/还原型辅酶Ⅱ)反应ꎬ２４ｈ后加４００μｌ含一定量内标ＤＯＮ的乙酸乙酯液终止反应ꎬ涡旋９０ｓ混匀ꎬ６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ去除上清液后用氮气吹干ꎻ样品用１００μｌ流动相复溶ꎬ涡旋９０ｓ混匀后１３０００ｒ/ｍｉｎ离心１５ｍｉｎꎬ取上清液２０μｌ进行超高效液相色谱￣串联质谱分析ꎬ测定底物ＤＯＮ的剩余量和ＤＯＮ￣３￣Ｇｌｕ的生成量ꎬ每个底物浓度做３管平行试验ꎮ按ＬｉｎｅｗｅａｖｅｒＢｕｒｋ双倒数作图法求得Ｋｍ(酶在达到最大反应速度一半时的底物浓度)和Ｖｍａｘ(酶的最大反应速度)ꎬ并根据公式计算清除率(ＣＬｉｎｔ):ＣＬｉｎｔ＝Ｖｍａｘ/Ｋｍˑ１００％ꎮ１.７.２㊀ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ方法检测培养液中ＤＯＮ和４２７１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第８期ＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡ㊀提取方法:ＤＯＮ染毒培养Ｓｆ９细胞２４ｈ后ꎬ２０００ｒ/ｍｉｎ离心收集１ ０ｍｌ上清液于１ ５ｍｌ离心管ꎬ取４００μｌ的上清液加入１.２ｍｌ的甲醇溶液ꎬ漩涡３０ｓ加速溶解ꎬ冰浴超声４０ｍｉｎ后ꎬ１２０００ｇ离心１０ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ置于冻干机中ꎮ加６０μｌ１％甲酸水溶液复溶ꎬ再次于４ħ㊁１２０００ｇ离心１０ｍｉｎꎮ取上清液ꎬ用０.２２μｍ膜过滤ꎬ待上机分析ꎮ色谱条件ꎮ(１)色谱柱:ＸＢｒｉｄｇｅＢＥＨ￣Ｃ１８柱(１００.０ｍｍˑ３ ０ｍｍꎬ２ ５μｍ)ꎮ(２)流动相:Ａ相为甲醇ꎬＢ相为５ｍｍｏｌ/Ｌ乙酸铵溶液ꎮ(３)梯度洗脱程序:０~１ ０ｍｉｎꎬ１０％Ａꎻ１.０~６ ５ｍｉｎꎬ１０％~９０％Ａꎻ６.５~６ ７ｍｉｎꎬ９０％~１０％Ａꎻ６.７~８ ０ｍｉｎꎬ１０％Ａꎻ再保持平衡２ ０ｍｉｎꎬ总运行时间为１０ ０ｍｉｎꎬ流速０ ４ｍｌ/ｍｉｎꎻ进样量３μｌꎻ柱温４０ħ[１]ꎮ质谱条件:采用电喷雾电离(Ｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｒａｙｉｏｎ￣ｉｚａｔｉｏｎꎬＥＳＩ)正负离子模式同时扫描ꎻ正负离子喷雾电压:５５００Ｖ和４５００Ｖꎻ去簇电压９６Ｖꎻ射入电压８Ｖꎻ射出电压１２Ｖꎻ雾化温度:５００ ０ħꎻ雾化和辅助气均选用高纯空气ꎬ其中雾化气为１０３４２.１４Ｐａꎬ辅助气为１７２３６.８９Ｐａꎻ碰撞气为高纯氮气:５５１５８.０６Ｐａꎻ喷雾电压气帘气:２.４１ˑ１０５Ｐａꎻ通过多反应监测(ＭｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇꎬＭＲＭ)模式对目标化合物进行峰值积分和数据分析[１１]ꎮ表１为２种毒素的质谱参数ꎮ表１㊀呕吐毒素和呕吐毒素￣３￣葡萄糖苷的质谱参数Ｔａｂｌｅ１㊀Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｆｏｒｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌａｎｄｄｅ￣ｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ￣３￣ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ真菌毒素㊀母离子质荷比(ｍ/ｚ)子离子质荷比(ｍ/ｚ)保留时间(ｍｉｎ)碰撞电压(ｅＶ)ＤＯＮ２９７２０３∗/１７５３.７０２８/２８ＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡ４７１１７５∗/２６５２.６６－４０/－３６∗为定量离子ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀猪ＵＧＴ１Ａ１基因的ＰＣＲ扩增及测序经１％琼脂糖凝胶电泳后观察ＰＣＲ扩增产物ꎬ在约１６７７ｂｐ左右的位置出现１条与猪肝脏ＵＧＴ１Ａ１片段预期大小一致的条带(图１)ꎮ２.２㊀ｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１的鉴定经ＰＣＲ分析和电泳鉴定ꎬ检测出长约１６７７ｂｐ图１㊀猪尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶１Ａ１基因片段的ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ.１㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１Ａ１的１条特异性条带ꎻ经内切酶ＢａｍＨⅠ㊁ＨｉｎｄⅢ双酶切后ꎬ电泳结果呈现２条带ꎬ其中１条为载体ꎬ约５２００ｂｐꎬ另外１条为目的条带ꎬ约１６７７ｂｐꎬ与预期结果一致ꎮ结果(图２)表明ꎬ目标基因的序列正确ꎬ成功构建了ｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１的重组质粒ꎮ１:目的条带ＰＣＲ产物ꎻ２:ｐＦａｓｔＢａｃＵＧＴ１Ａ１双酶切(ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ)ꎻ３:ｐＦａｓｔＢａｃＵＧＴ１Ａ１质粒单酶切线性化ꎻＭＫ:ＤＬ２０００ꎮ图２㊀ｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１的鉴定Ｆｉｇ.２㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＦａｓｔＢａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１２.３㊀重组穿梭质粒Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１的鉴定图３显示ꎬ采用方法１.４的引物ꎬ以Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１的ＤＮＡ为模板完成ＰＣＲ扩增ꎮ扩增结果与预测的结果一致ꎬ在大约４０００ｂｐ的地方呈现１条特异性的ＤＮＡ片段ꎮ２.４㊀蛋白质表达结果的检测感染Ｓｆ９细胞７２ｈ后ꎬ收集上清液ꎬ浓缩ꎬ用镍亲和层析柱进行纯化ꎬ完成蛋白质电泳十二烷基硫酸钠￣聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ)(图４)ꎮ转膜后进行抗体反应ꎬ在６２２００处出现１特异性条带(图５)ꎬ与预测大小一致ꎮ并且ＵＧＴ１Ａ１蛋白主要在Ｓｆ９昆虫细胞内表达ꎮ５２７１贺卫华等:猪ＵＧＴ１Ａ１酶基因的克隆㊁表达及其对呕吐毒素特异性降解的作用１~５:ＰＣＲ产物ꎻＭＫ:ＤＬ５０００ｐｌｕｓＤＮＡ标记ꎮ图３㊀重组杆状病毒Ｂａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１的鉴定Ｆｉｇ.３㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＢａｃｍｉｄ￣ＵＧＴ１Ａ１Ａ:上清液ꎻＢ:细胞裂解上清液ꎻＣ:细胞沉淀ꎻＭＫ:蛋白质标记ꎮ图４㊀十二烷基硫酸钠￣聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Ｆｉｇ.４㊀Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ￣ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ￣ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ￣ｓｉｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ２.５㊀ＵＧＴ１Ａ１重组酶动力学参数分析ＵＧＴ１Ａ１重组酶动力学参数采用Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ￣Ｂｕｒｋ法作图ꎮ结果(图６)表明ꎬ不同ＤＯＮ浓度培养条件下ꎬＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ￣Ｂｕｒｋ曲线呈良好的线性关系(Ｒ２＝０ ９９)ꎬ说明试验条件下ＵＧＴ１Ａ１重组酶对ＤＯＮ的代谢反应符合米氏方程ꎮ推算分别得到ＵＧＴ１Ａ１酶对ＤＯＮ的Ｋｍ＝(２.７１ʃ０ ２９)μｍｏｌ/ＬꎬＶｍａｘ＝(０.３５９５ʃ０.００６４)μｍｏｌ/(ｍｉｎ ｍｇ)ꎬＣＬｉｎｔ＝０.１３２７Ｌ/(ｍｉｎ ｍｇ)ꎮ２.６㊀ＤＯＮ和ＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡ的ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ分析结果㊀㊀图７为ＤＯＮ经ＵＧＴ１Ａ１培养液代谢后的ＭＲＭ图谱ꎬ可见ＤＯＮ和ＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡ２种物质色谱峰形较好且响应强度高ꎮ推测ＤＯＮ在ＵＧＴ１Ａ１的作用Ａ:上清液ꎻＢ:细胞裂解上清液ꎻＣ:细胞沉淀ꎻＭＫ:蛋白质标记ꎻＣｔｒｌ＋:组氨酸抗体Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ阳性对照ꎮ图５㊀重组ＵＧＴ１Ａ１蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定Ｆｉｇ.５㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＵＧＴ１Ａ１ｐｒｏｔｅｉｎｂｙＷｅｓｔ￣ｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ下可代谢为ＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡꎬ降解率为４５％ꎮ３㊀讨论ＵＧＴ是在内质网膜和核膜上催化Ⅱ相代谢途径ꎬ是真菌毒素葡萄糖醛酸结合反应的超家族基因ꎮＵＧＴ１Ａ和ＵＧＴ２Ｂ亚家族的成员在终止生物作用和亲脂性药物的消除方面起着关键作用ꎮ这些酶主要催化源自辅因子尿苷二磷酸(ＵＤＰ)￣葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸ꎬ同样ꎬ也可以催化具有共价连接的合适受体官能团的底物ꎬ这个过程被称为葡萄糖醛酸化[１２]ꎮ体内一般脂溶性物质的代谢主要通过这一反应ꎬ如内源性物质㊁胆红素㊁类固醇等的降解过程[１３￣１６]ꎮ前期研究发现ＤＯＮ主要在肝脏中被ＵＧＴ催化ꎬ通过Ⅱ相代谢途径发生葡萄糖醛酸结合反应而被迅速排出体外ꎬ降低其毒性作用ꎮ而ＵＧＴ基因家族有多个亚型ꎬ在猪体内主要发现的ＵＧＴ亚型包括ＵＧＴ２Ｂ３１㊁ＵＧＴ２Ｂ４㊁ＵＧＴ２Ａ１㊁ＵＧＴ１ＡＢ３４种ꎬ这些亚型基因在真菌毒素体内代谢中的作用㊁解毒效应和代谢途径各不相同ꎮ本研究在前期工作基础上探索催化ＤＯＮ在猪肝细胞中发生葡萄糖醛酸化的ＵＧＴ１Ａ１关键亚型基因ꎮ目前重组构建技术可以使对体外培养试验中基因变化的观察更为直观ꎬＢａｃ￣ｔｏ￣Ｂａｃ表达系统和传统的同源重组相比可以更快速地产生重组杆状病毒和同时进行大量重组目的蛋白鉴别ꎬ该表达系统主要包括合适的ｐＦａｓｔＢａｃ菌体和ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细６２７１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第８期ＤＯＮ:呕吐霉素ꎮＡ:代谢速率与底物浓度的关系ꎻＢ:ＵＧＴ１Ａ１重组酶代谢ＤＯＮ的Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ￣Ｂｕｒｋ曲线ꎮ图６㊀ＵＧＴ１Ａ１重组酶代谢ＤＯＮ的酶动力学Ｆｉｇ.６㊀ＥｎｚｙｍａｔｉｃｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｂｙＵＧＴ１Ａ１ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｚｙｍｅＤＯＮ:呕吐霉素ꎻＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡ:ＤＯＮ￣葡萄糖醛酸ꎮＡ:ＤＯＮ代谢前的ＭＲＭ图谱ꎻＢ:代谢后ＤＯＮ和ＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡ的质谱多反应监测图谱ꎮ图７㊀ＤＯＮ和ＤＯＮ￣３￣ＧｌｃＡ经ＵＧＴ１Ａ１代谢后的质谱多反应监测图谱Ｆｉｇ.７㊀Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｄｉａｇｒａｍｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌａｎｄｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ￣３￣ｇｌｕｃｏｓｉｄｅａｆｔｅｒＵＧＴ１Ａ１ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ胞及１个可以控制表达的质粒ꎬ通过感染细胞能形成重组杆状病毒[１７]ꎮｐＦａｓｔｂａｃ１的特点是表达水平高㊁启动子部位富含ＡｃＭＮＰＶ聚乙烯(ＰＨ)ꎬ可用于简单的大量克隆[１８]ꎮ为探索猪体内Ⅱ相代谢途径发生葡萄糖醛酸结合反应的关键ＵＧＴ１Ａ１酶基因ꎬ本研究通过合成ＵＧＴ１Ａ１基因ꎬ将目的基因克隆至ｐＦａｓｔｂａｃ１杆状病毒载体上ꎬ然后转化ｐＦａｓｔｂａｃ￣ＵＧＴ１Ａ１质粒至ＤＨ１０ｂａｃ感受态ꎬ制备Ｂａｃｍｉｄ(杆粒)ꎬＳｆ９细胞被Ｂａｃｍｉｄ转染后得到子代的病毒可获得大批量目的蛋白ꎬＡｎｔｉ￣ＨｉｓＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测和放大转染㊁表达检测的结果一致ꎬ显示获得的蛋白质中ＵＧＴ１Ａ１基因表达ꎮ通过ＵＰＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ分析ＤＯＮ代谢产物发现ꎬＤＯＮ在猪肝细胞中通过ＵＧＴ１Ａ１酶的催化作用代谢为ＤＯＮ￣３￣葡萄糖醛酸ꎬ提示猪肝细胞中ＤＯＮ葡萄糖醛酸反应关键ＵＧＴ酶基因ＵＧＴ１Ａ１具有重要作用ꎮ由于真菌毒素污染在畜禽日常生产中难以避免和降解ꎬ研究促进真菌毒素在机体内更快消除代谢的关键因子和调节机制具有重大意义ꎮ本研究发现ꎬＤＯＮ在猪肝细胞中通过Ⅱ相代谢途径发生葡萄糖醛酸结合反应的关键ＵＧＴ酶基因是ＵＧＴ１Ａ１ꎬ后续或许可能通过对ＵＧＴ１Ａ１基因结构进行突变诱导等处理ꎬ提高毒素转化代谢及降解效率ꎬ为后期饲料中ＤＯＮ脱毒剂开发研究和畜禽制品食品安全监督等提供参考ꎮ参考文献:[１]㊀贺烨宇ꎬ杨㊀华ꎬ杨伟康ꎬ等.谷物及其制品中真菌毒素污染和管控策略研究[Ｊ].浙江农业科学ꎬ２０２３ꎬ６４(１):１￣８.[２]㊀ＹＡＯＹＺꎬＭＩＡＯＬ.Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍＴｏｘｉｃｏｌꎬ２０２０ꎬ１４５:１１１６４９.[３]㊀ＰＩＥＲＲＯＮＡꎬＡＬＡＳＳＡＮＥ￣ＫＰＥＭＢＩＩꎬＯＳＷＡＬＤＩＰ.Ｉｍｐａｃｔｏｆｔｗｏｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌａｎｄｆｕｍｏｎｉｓｉｎｏｎｐｉｇｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ７２７１贺卫华等:猪ＵＧＴ１Ａ１酶基因的克隆㊁表达及其对呕吐毒素特异性降解的作用ｈｅａｌｔｈ[Ｊ].ＰｏｒｃｉｎｅＨｅａｌｔｈＭａｎａｇꎬ２０１６ꎬ２:２１.[４]㊀ＳＵＮＹꎬＪＩＡＮＧＪꎬＭＵＰＱꎬｅｔａｌ.Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｉｎａｎｉｍａｌｓａｎｄｈｕｍａｎｓ[Ｊ].ＡｒｃｈＴｏｘｉｃｏｌꎬ２０２２ꎬ９６(１０):２６３９￣２６５４.[５]㊀ＭＡＵＬＲꎬＷＡＲＴＨＢꎬＫＡＮＴＪＳꎬｅｔａｌ.Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｅ￣ｐａｔｉｃｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｔｈｅｆｕｓａｒｉｕｍｍｙｃｏｔｏｘｉｎｄｅｏｘｙｎｉ￣ｖａｌｅｎｏｉｎｖａｒｉｏｕｓｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＣｈｅｍＲｅｓＴｏｘｉｃｏｌꎬ２０１２ꎬ２５(１２):２７１５￣２７１７.[６]㊀ＭＡＣＫＥＮＺＩＥＰＩꎬＢＯＣＫＫＷꎬＢＵＲＣＨＥＬＬＢꎬｅｔａｌ.ＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｕｐｄａｔｅｆｏｒｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎＵＤＰｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ(ＵＧＴ)ｇｅｎｅｓｕ￣ｐｅｒｆａｍｉｌｙ[Ｊ].ＰｈａｒｍＧｅｎｏｍꎬ２００５ꎬ１５(１０):６７７￣６８５. [７]㊀ＧＵＩＬＬＥＭＥＴＴＥＣꎬＬÉＶＥＳＱＵＥＥꎬＨＡＲＶＥＹＭꎬｅｔａｌ.ＵＧＴｇｅ￣ｎｏｍｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ:ｂｅｙｏｎｄｇｅｎｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＤｒｕｇＭｅｔａｂＲｅｖꎬ２０１０ꎬ４２(１):２４￣４４.[８]㊀ＳＣＨＷＡＲＴＺ￣ＺＩＭＭＥＲＭＡＮＮＨꎬＨＡＭＥＴＮＥＲＣꎬＮＡＧＬＶꎬｅｔａｌ.Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｔｉｏｎｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ(ＤＯＮ)ｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｉｍａｌｓｐｅｃｉｅｓ:ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｓｏ￣ＤＯＮｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｓａｎｄｉｓｏ￣ｄｅｅｐｏｘｙ￣ＤＯＮｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｓａｓｎｏｖｅｌＤＯＮｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｐｉｇｓꎬｒａｔｓꎬｍｉｃｅꎬａｎｄｃｏｗｓ[Ｊ].ＡｒｃｈＴｏｘｉｃｏｌꎬ２０１７ꎬ９１(１２):３８５７￣３８７２. [９]㊀ＬＵＢＪꎬＴＡＮＧＱꎬＷＡＮＧＱＹꎬｅｔａｌ.Ｒｅｃｏｖｅｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｅｎｔｅｒｏ￣ｖｉｒｕｓ７１ｂｙＢａｃ￣ｔｏ￣Ｂａｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０２２ꎬ１３:８２５１１１.[１１]ＬＡＴＴＡＮＺＩＯＶＭꎬＳＯＬＦＲＩＺＺＯＭꎬＤＥＧＩＲＯＬＡＭＯＡꎬｅｔａｌ.ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｕｒｉｎａｒｙｅｘｃｒｅｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆｔｈｅｍｙｃｏｔｏｘｉｎｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｉｎｈｕｍａｎａｎｄｒａｔ[Ｊ].ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢꎬ２０１１ꎬ８７９:７０７￣７１５.[１２]ＦＡＮＫꎬＸＵＪＪꎬＪＩＡＮＧＫＱꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙ￣ｃｏｔｏｘｉｎｓｉｎｐａｉｒｅｄｐｌａｓｍａａｎｄｕｒｉｎｅｓａｍｐｌｅｓｔｏａｓｓｅｓｓｈｕｍａｎｅｘｐｏ￣ｓｕｒｅｉｎＮａｎｊｉｎｇꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｏｌｌｕｔｉｏｎꎬ２０１９ꎬ２４８:８６５￣８７３.[１３]ＲＯＷＬＡＮＤＡꎬＭＩＮＥＲＳＪＯꎬＭＡＣＫＥＮＺＩＥＰＩ.ＴｈｅＵＤＰ￣ｇｌｕｃｕ￣ｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ:ｔｈｅｉｒｒｏｌｅｉｎｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｄｅｔｏｘｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].ＩｎｔＪＢｉｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２０１３ꎬ４５(６):１１２１￣１１３２. [１４]ＢＡＲＢＩＥＲＯꎬＴＲＯＴＴＩＥＲＪꎬＫＡＥＤＩＮＧＪꎬｅｔａｌ.Ｌｉｐｉｄ￣ａｃｔｉｖａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｃｏｎｔｒｏｌｂｉｌｅａｃｉｄｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｔｉｏｎ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌ￣ｂｉｏＣｈｅｍꎬ２００９ꎬ３２６(１):３￣８.[１５]ＧＡＬＬＷＥꎬＺＡＷＡＤＡＧꎬＭＯＪＡＲＲＡＢＩＢꎬｅｔａｌ.Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｌｕｃｕ￣ｒｏｎｉｄａｔｉｏｎｏｆｂｉｌｅａｃｉｄｓꎬａｎｄｒｏｇｅｎｓａｎｄｅｓｔｒｏｇｅｎｓｂｙｈｕｍａｎＵＧＴ１Ａ３ａｎｄ２Ｂ７[Ｊ].ＪＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌꎬ１９９９ꎬ７０(１/２/３):１０１￣１０８. [１６]ＺＥＮＧＷꎬＬＩＵＸꎬＷＵＹꎬｅｔａｌ.ＤｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｈｅｐａｔｉｃＵＤＰ￣ｇｌｕｃｕ￣ｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓａｎｄｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｔｉｏｎｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｌｉｔｉｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙꎬ２０２２ꎬ１３:１０５３６１０. [１７]薛庆凯ꎬ黄玉政.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶在肝脏疾病中的作用及其转录调控机制[Ｊ].热带病与寄生虫学ꎬ２０２２ꎬ２０(１):３６￣４２.[１８]ＶＡＮＯＥＲＳＭＭꎬＰＩＪＬＭＡＮＧＰꎬＶＬＡＫＪＭ.Ｔｈｉｒｔｙｙｅａｒｓｏｆｂａｃ￣ｕｌｏｖｉｒｕｓ￣ｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ:ｆｒｏｍｄａｒｋｈｏｒｓｅｔｏｍａｉｎ￣ｓｔｒｅａｍｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＪＧｅｎＶｉｒｏｌꎬ２０１５ꎬ９６(１):６￣２３.(责任编辑:陈海霞)８２７１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第８期。
日粮不同蛋白质水平对猪骨骼肌钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶基因表达及嫩度的影响张勇;李方方;朱宇旌;李哲;高彦【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2008(20)3【摘要】为研究饲料不同蛋白质含量对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量,选用54头约50 kgLY(长×大)二元杂交去势公猪.随机分为3个处理,每个处理3个重复,每个重复3头猪,分别饲喂蛋白质水平为10%、18%和26%的日粮,各日粮能量及氨基酸模式保持一致,饲养76 d后屠宰取样,用荧光相对定量PcR测定猪背最长肌中calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量,及其对剪切力的影响.结果表明,日粮不同蛋白质水平对calloastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量有显著影响(P<0.01).calpastatin mRNA在骨骼肌中的表达量随日粮蛋白质水平的升高而升高.μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量随日粮蛋白质水平的升高而下降.骨骼肌剪切力与calpastatin表达量显著正相关,骨骼肌中calpastatin mRNA的表达量越高,骨骼肌剪切力值越高(P<0.01),相关系数为0.859.骨骼肌剪切力与μ-calpain显著负相关,骨骼肌中μ-calpain mRNA的表达量越高,骨骼肌剪切力值越低(P<0.05),相关系数为-0.748.骨骼肌中calpastatin mRNA的表达量与μ- calpain mRNA的表达量显著负相关,calpastatin mRNA表达量越高,μ-calpain mRNA的表达量越低(P<0.01),相关系数为-0.875.即日粮不同蛋白质水平对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量有显著影响.【总页数】6页(P360-365)【作者】张勇;李方方;朱宇旌;李哲;高彦【作者单位】沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳,110161;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳,110161;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳,110161;辽宁省农科院,草牧所,沈阳,110161;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳,110161【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.急性肝衰竭大鼠肝组织中钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的表达及乌司他丁对其的影响 [J], 商振球;陈永平;谷甸娜2.不同饲喂方式对猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶基因表达及剪切力的影响 [J], 张勇;高彦;朱宇旌;李红梅;张莹莹;李方方3.日粮不同蛋白质水平对绵羊IGF-1和GH分泌及基因表达的影响 [J], 闫云峰;杨华;杨永林;潘晓亮;邹云龙4.不同饲喂方式对生长猪背最长肌中钙蛋白酶抑制蛋白表达量以及肉嫩度的影响[J], 张勇;刘婷婷;朱宇旌5.新疆阿勒泰羊钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性与嫩度的关联性分析 [J], 田佳;周卫东;马晓燕;郑文新;高维明;迪拉热·沙塔尔;左晓佳;师帅;张蓉银因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
