胶原_壳聚糖_硫酸软骨素三元膜材料的制备与性能研究

  • 格式:pdf
  • 大小:515.03 KB
  • 文档页数:5

第19卷第2期2009年4月皮革科学与工程LE AT HER SC I E NCE AND E NGI N EER I N GVol .19,No .2Ap r .2009文章编号:1004-7964(2009)02-0026-05胶原壳聚糖硫酸软骨素三元膜材料的制备与性能研究王康建1,2,曾 睿3,叶易春1,2,但年华1,2,但卫华1,23(1.四川大学制革清洁技术国家工程实验室,四川成都,610065;2.四川大学生物医学工程技术研究中心,四川成都,610065;3.四川大学轻纺与食品学院,四川成都,610065)摘要:通过热脱氢交联(DHT )-碳化二亚胺(E DC )复合改性制备胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜材料。

对复合膜的力学强度、吸水率、降解性能、细胞毒性进行了表征,并将其应用于全层皮肤损伤动物修复实验。

结果表明:复合膜具有良好的力学性能和吸水性,耐酶解性,生物相容性,并能加速创面愈合,作为一种潜在的皮肤组织工程支架将具有良好的应用前景。

关键词:胶原;壳聚糖;硫酸软骨素;医用复合膜;创面修复中图分类号:O 636.1; R 318.08 文献标识码:AThe Preparati on and Character i zati on of Coll agen -chitos an -chondroiti n Sulfate Co mposite M e mbranesWAN G Kang -jian1,2,ZEN G R ui 3,YE Y i -chun1,2,DAN N ian -hua1,2,DAN W ei -hua13(1.N ational Engineering L aboratory for C lean Technology of L eatherM anufacture,S ichuan U niversity;2.The Research Center of B io m edicine Engineering of S ichuan U niversity;3.Institute of L ight Industry,Textile and Food Engineering,S ichuan U niversity,Chengdu 610065,China )Abstract:The collagen -chit osan -chondr oitin sulfate (CS )composite membranes were modified by dehydrather mal (DHT )and 1-ethyl -3-(3-di m ethyla m inop r opyl )carbodii m ide (E DC )and used t o repair the full -thickness injury in ani m al .The i m portant p r operties,such as rati o of abs orbing water,mechanical p r operties,degradati on,cyt ot oxicity of me mbranes were investigated .The result indicates that this composite me mbrane with good mechanical p r operties,water abs or p ti on,digesti on -resistant,bi ocompatibility can i m p r ove wound healing and shows wide potentially app licati on as skin scaff olds in tissue engineering .Keywords:collagen;chit osan;chondr oitin sulfate;medical composited membrane;wound repair收稿日期:2008-10-12基金项目:成都市科技计划资助项目(06GGY B965GX -030)第一作者简介:王康建(1981-),男,湖北宜昌人,硕士研究生。

3通讯联系人,博导,教授,d wh -bi o@引 言胶原因其特殊的四级结构,具有独特的理化性质和优良的生物相容性、可降解性、低免疫原性等,在生物医用材料领域得到了广泛的应用[1-3]。

壳聚糖是甲壳质的脱乙酰产物,具有极好的生物相容性和可降解性、无刺激性、无免疫原性、无热源性,并具有促进创面愈合的功能。

大量胶原-壳聚糖复合材料研究表明,壳聚糖和胶原是多种人体组织细胞生长繁殖良好的诱导支架材料和细胞生长基质[4,5]。

硫酸软骨素(CS )是一种糖胺聚糖,具有抗炎、加速伤口愈合等作用,加入CS,可提高材料的生第2期王康建,等:胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜材料的制备与性能研究27物相容性[6]。

本研究在胶原-壳聚糖二元复合膜制备[7]、胶原-壳聚糖分子间作用力[8]等前期工作基础上,通过热脱氢交联(DHT)-碳化二亚胺(EDC)复合改性,将CS引入胶原-壳聚糖二元复合膜中,为材料提供多糖类的生物活性,进一步提高材料的生物稳定性和生物相容性。

DHT是一种通过加热使胶原上的羧基和伯胺侧基发生缩合反应而交联的改性方法,其优点在于没有引入有潜在毒性的化学试剂。

E DC是一种通过在羧基和伯胺侧链基团之间形成酰胺键而交联的改性方法,其优点是使反应后留下的水溶性异脲能很容易被洗掉。

因此DHT-E DC复合改性既能有效交联,又不会造成细胞毒性,是一种有效的交联改性方法[9]。

1 实验1.1 主要试剂和仪器2-N-吗啉乙烷磺酸(MES,美国Am resco公司),碳化二亚胺(E DC,上海延长生化公司),N-羟基丁二酰亚胺(NHS,上海延长生化公司),壳聚糖(脱乙酰度>87%,成都科龙化工试剂厂),硫酸软骨素(CS,美国Sig ma公司),茚三酮(德国MERCK 公司),溶菌酶(生物纯,成都天泰生命科技有限公司),甘氨酸(美国AMRESCO公司),人重组bFGF (生物纯,美国Sig ma公司),胶原(实验室自制)[10,11],其它试剂均为市售分析纯试剂,且使用前未经任何处理。

冷冻干燥机(Freeze6型,美国Labconco公司), CO2细胞培养箱(S ANY O,JAP AN),倒置相差显微镜照相系统(O ly mpus I X70,JAP AN),离心机(Heraeus Varifuge3.0RS,Ger many),扫描电子显微镜(JS M-5900LV,日本电子株式会社)。

1.2 实验方法1.2.1 DHT-E DC改性胶原-壳聚糖-硫酸软骨素膜的制备 胶原和壳聚糖按1∶1比例混合,溶解于0.5 mol/L的醋酸,置于自制模具中冷冻干燥成膜。

将未改性胶原基二元膜在常温下抽真空,升温,在110℃下处理2h。

将制得的脱氢加热改性(DHT)膜置于40mL pH5.0~6.0,50mmol/L2-N-吗啉乙烷磺酸(2-N-mor pholino ethanesulfonic acid,MES)的40%乙醇中浸泡30m in,再在50mmol/L MES、33mmol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-di m ethyla m inop r opyl)carbo2 dii m ide,EDC]、20mmol/L N-羟基丁二酰亚胺(N -hydr oxysuccini m ide,NHS)和1%硫酸软骨素的40%乙醇溶液中室温浸泡4h。

最后将上述复合支架在0.1mol/L Na2HP O4(pH值为9.1)溶液中清洗4h,再在不同浓度的NaCl溶液中清洗过夜,双蒸水反复清洗至中性,冻干,得DHT-E DC复合改性膜。

胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜EDC改性后,分别用浓度为0.1~1.0mol/LNa2HP O4(pH8.0~9.1)、1~2mol/L NaCl、5~50mmol/L甘氨酸、双蒸水反复清洗,再将自制的b-FGF缓释微球用磷酸盐缓冲液(P BS)分散,均匀喷涂于膜上,复合冻干得含缓释微球的胶原基体表创伤修复膜。

将上述创伤修复膜无菌封装在医用包装袋内用60Co辐照仪辐照灭菌,照射剂量为25kGy。

1.2.2 胶原-壳聚糖-硫酸软骨素改性膜的性能表征(1)拉伸强度测定将膜材料用模具制成哑铃状,空气调节48h,在拉力机上以10mm/m in速度测定材料的拉伸强度,每个样品测5次取平均值。

(2)降解性表征将膜样品(10mm×25mm)真空干燥,精确称量,置于试管中,然后加入5mL的溶菌酶降解液(1.0mg/mL,缓冲液为P BS)将其浸泡。

试管封口,置于(37±1)℃水浴中振荡(固定转速为80),于1 d、2d、3d、5d、8d、12d、15d时取样。

为了保持酶的活力,需每72h更换一次酶液。

样品水洗、干燥至恒重,通过降解后样品质量的减少来确定样品的降解性。

(3)三元膜浸提液细胞毒性试验剪取约1c m2大小膜材,于4mL培养基中37℃浸提3d,每天取一份浸提液,进行成纤维细胞培养。

浸提液培养细胞3d后,用MTT法检测和光境观察。

(4)全层皮肤损伤动物修复实验选取一级新西兰大白兔20只,雌雄各半,体重1.5~2.0kg。

用速眠新对新西兰白兔肌肉注射作全身麻醉,在兔背侧胸腰部脊柱两侧1c m处,脱毛、消毒。

10m in后麻醉起效后,切割建立3c m×4c m28 皮革科学与工程第19卷的全层皮肤损伤。

在左侧创口敷以胶原基复合膜,作为实验组,右侧创口作空白对照,两侧同时敷以灭菌的油纱和纱布,并在纱布边缘用1号线与皮肤缝合,1周拆除。

术后连续3d 注射氨苄青霉素0.25g/只。

观察创口的出血量,创口愈合时间及愈合创面的特征等。

2 结果与讨论2.1 拉伸强度胶原-壳聚糖二元E DC 改性膜的拉伸强度为1.06MPa,胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元E DC 改性膜的拉伸强度为1.19MPa,两者比较,三元膜机械强度更高,这与三元膜改性指数高于二元膜有关。

2.2 降解性能图1表明了改性膜在溶菌酶液中的降解情况:EDC 改性三元膜和EDC 改性二元膜的生物降解性,比未改性膜显著增强;在溶菌酶液中水解15d 后,EDC 改性二元膜保留了89.74%的质量,三元膜保留了93.02%的质量,而未改性膜保留质量不到60%。

这说明EDC 技术能提供有效的交联,提高材料的抗酶解能力;E DC 改性三元膜的性能更加优越,CS 的加入也有利于提高复合材料的抗酶解能力。