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病毒载体疫苗研究进展
王步森;徐婧含;高智强;侯利华
【期刊名称】《合成生物学》
【年(卷),期】2024(5)2
【摘要】近十年来,中东呼吸综合征、埃博拉出血热、寨卡病毒感染、新型冠状病毒肺炎等重大传染性疾病疫情相继出现,对疫苗的快速研发提出重大挑战。
其中病毒载体疫苗是新型疫苗研发的重要形式,它可以通过雾化吸入或口服等方式进行无创免疫,在没有佐剂的情况下发挥免疫作用,同时诱导体液、细胞和黏膜免疫反应,具有良好的免疫原性和安全性。
随着对病毒基因组和结构蛋白等元件认识的不断深入,利用合成生物学研究思路系统设计、改造病毒载体,从而赋予重组病毒载体疫苗高滴度生产、高安全性和高免疫原性等生物学特征,对疫苗研发具有重要指导意义。
本文综述了复制型、非复制型等病毒载体疫苗研发策略,以及具有临床应用价值的疫苗病毒载体,如腺病毒载体、痘病毒载体、水疱性口炎病毒载体等,希望对利用合成生物学进行新型病毒载体疫苗的研发提供一定的参考。
未来,病毒载体疫苗必将向着更高的安全性、更强的保护性、更好的依从性、更低的生产成本等方向迭代发展。
【总页数】13页(P281-293)
【作者】王步森;徐婧含;高智强;侯利华
【作者单位】军事科学院军事医学研究院前沿生物技术实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R373
【相关文献】
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基于反向遗传学操作技术新城疫病毒载体的研究进展林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【摘要】新城疫病毒是严重危害养禽业的重要疫病——新城疫的病原微生物.随着反向遗传学操作技术的快速发展,重组新城疫病毒载体已成为新城疫研究的重点,也是当今病毒载体系统研究的热点之一.笔者在简要综述了新城疫病毒的基因组结构和反向遗传载体的构建等的基础上,重点阐述了新城疫病毒载体在外源基因表达方面的研究概况.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)035【总页数】4页(P17146-17149)【关键词】反向遗传学;新城疫病毒;载体【作者】林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600【正文语种】中文【中图分类】G813.1新城疫(Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV）引起的多种禽类易感的一种急性、高度接触性、毁灭性传染病，也是目前严重危害我国养禽业的重要疫病之一。
反向遗传学(Reverse genetics）是相对于经典遗传学而言的。
经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律，而反向遗传学与经典遗传学的研究思路正好相反，是直接从生物遗传物质入手，通过对遗传物质进行加工和修饰来研究基因突变后产生的生物体的特性(表型和性状等），从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物体特性的影响。
与之相关的各种研究技术统称为反向遗传学技术(Reverse genetics manipulation technique）［1－3］，主要包括 RNA 干扰 (RNA interference，RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是DNA重组技术应用范围的扩展与延伸。
CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。
通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。
而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。
因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。
二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。
具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。
2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。
3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。
4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。
三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。
2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。
3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。
四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。
同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。
作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。
为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。
本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。
1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。
编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。
非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。
第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。
其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。
但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。
在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。
此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。
DOI：10.3969/j.issn.l007-5062.2021.03.015•基础研究•重组腺病毒载体敲减ApoE-/-小鼠血管平滑肌细胞Orai1基因模型的构建费舒扬葛长江［摘要］目的：为探讨Orai1基因在动脉粥样硬化进展中的作用，通过重组腺病毒载体建立ApoE"小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Orai1基因的敲低模型,为深入相关研究奠定基础。
方法：构建针对小鼠Orai1基因的重组腺病毒载体。
高脂饲养ApoE，小鼠至16周龄后处死。
取胸主动脉原代VSMCs改为体外培养，细胞分为三组,分别为shOrai1组、shNC组和对照组。
转染后通过实时定量聚合酶链式反应(qPCR),Western blot检测Orai1表达水平，同时对转染模型进行验证。
结果：qPCR示，重组腺病毒在ApoE"小鼠VSMCs中Orai1基因的干扰效率达57%,Western blot结果示,Ad-GFP-Orial-shRNA转染组Orai1蛋白表达水平显著降低。
结论：通过成功建立ApoE"-小鼠VSMCs中Orai1基因敲低模型，从而为阐明钙库操纵性钙通道在动脉粥样硬化进程中的作用，尤其关于斑块延展和不稳定的相关性研究奠定了基础。
［关键词］Orai1基因；动脉粥样硬化;核糖核酸干扰;血管平滑肌细胞［中图分类号］R54［文献标志码］A［文章编号］1007-5062(2021)03-281-06Establishment of Orail gene knock down model in ApoE""mouse vascular smooth mucsle cells with adenovirus interference vector FEI Shuyang,GE Changjiang Department of Cardiology,Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing Institute of Heart,Lung and Blood Vessel Diseases,Beijing100029,China［Abstract］Objective:To further investigate the role of calcium release-activated calcium channelmodulator1(Orai1)in the process of Atherosclerosis,the recombinant adenovirus vector was used to establishthe ApoE--mouse vascular smooth mucsle cells(VSMCs)Orai1gene knock down model for further relatedstudies.Methods:A recombinant adenovirus vector(Ad-GFP-Orial-shRNA)targeting the Orai1gene in micewas constructed.ApoE--mouse fed with high-fat diet were sacrificed at16weeks of age.VSMCs extracted fromthe thoracic aorta were cultured in vitro.The cells were randomly divided into3groups for Ad-GFP-Orial-shRNA infection,Ad-GFP-NC-shRNA infection and control group.Orai1expression was tested by qPCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)and Western blot to validated the model.Results：qPCRshowed that the Orai1mRNA in VSMCs decreased by57%,Western blot showed that Orai1protein expressionlevel was significantly reduced.Conclusions:The ApoE--mouse VSMCs Orai1gene knock down model wassuccessfully established,building a foundation to further study the mechanism of SOCC participate in theprocess of atherosclerosis and its impact on plaques'extension and instability.［Keywords］Orai1；RNA intereference；Atherosclerosis；Vascular smooth mucsle cells钙库操纵性钙通道(stored operated calcium内流的重要离子通道，参与调节血管平滑肌细胞channel,SOCC)是非兴奋细胞所介导胞质外钙离子(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖、迁移基金项目：2020年北京自然科学基金（7202039）作者单位：100029首都医科大学2018级临床心血管专业硕士研究生（费舒扬）；首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所心内科（葛长江）通信作者：葛长江,教授,研究生导师，博士，研究方向：冠心病的药物和介入治疗。
