乳酸菌的筛选与鉴定

引用格式：高宇, 廖彩羽, 汤科, 等. 泡菜盐水中降胆固醇乳酸菌的筛选鉴定及性能研究[J]. 中国测试，2023, 49(11): 132-140.GAO Yu, LIAO Caiyu, TANG Ke, et al. Isolation and characterization of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from pickle juice[J].China Measurement & Test, 2023, 49(11): 132-140. DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2023010015泡菜盐水中降胆固醇乳酸菌的筛选鉴定及性能研究高 宇1， 廖彩羽1， 汤 科1， 程道梅1， 赵长菘1，刘 鑫1， 张 弛1， 韩云蕾2(1. 成都医学院公共卫生学院，四川 成都 610500; 2. 成都医学院基础医学院，四川 成都 610500)摘　要: 为筛选出具有降胆固醇能力且益生性能优良的乳酸菌，从28份四川传统泡菜盐水中分离得到103株乳酸菌。

通过体外胆固醇降解能力、耐酸耐胆盐能力、人工胃肠液耐受性、盐耐受性、疏水性、自聚性和抑菌能力测定，筛选得到一株体外降解胆固醇能力为42.7%的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum ）LAB4。

该菌具有一定的耐酸、耐胆盐能力，在含2% NaCl 的培养基中可正常生长，在经模拟人工胃、肠液处理后其活菌数均能达到108 CFU/mL 。

LAB4具有较好的肠道定殖潜力，其发酵上清液对4种常见食源性致病菌均表现出中度抑菌活性。

综上，植物乳杆菌LAB4益生性能优良，可作为开发降胆固醇功能性食品的潜力菌株。

关键词: 降胆固醇; 乳酸菌; 泡菜; 益生菌; 筛选中图分类号: R3文献标志码: A文章编号: 1674–5124(2023)11–0132–09Isolation and characterization of cholesterol-lowering lacticacid bacteria from pickle juiceGAO Yu 1, LIAO Caiyu 1, TANG Ke 1, CHENG Daomei 1, ZHAO Changsong 1,LIU Xin 1, ZHANG Chi 1, HAN Yunlei 2(1. School of Public Health, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China; 2. Preclinical MedicineSchool, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China)Abstract : In order to screen lactic acid bacteria with cholesterol-lowering ability and excellent probiotic properties, 103 strains of lactic acid bacteria were isolated from 28 Sichuan traditional pickle juice. From the in vitro cholesterol degradation ability, acid resistance and bile salt resistance, artificial gastrointestinal fluid tolerance, salt tolerance, hydrophobicity, self-aggregation, and antibacterial ability Lactiplantibacillus plantarum LAB4 with an in vitro cholesterol degradation ability of 42.7% was isolated. Moreover,Lactiplantibacillus plantarum LAB4 showed promising probiotic characteristics with remarkable tolerance to pH, bile salt and 2% NaCl. Furthermore, the strain could reach 108 CFU/mL after incubation in artificial gastrointestinal fluid and possesses good potential for adhesion and colonization of intestinal epithelial cells;收稿日期: 2023-01-03；收到修改稿日期: 2023-02-24基金项目: 四川省卫生健康委普及应用项目（17PJ439）；成都医学院研究生创新基金项目（YCX2022 -01-38）作者简介: 高　宇（1993-），女，湖北十堰市人，硕士研究生，专业方向为营养与健康管理。

酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选酸菜是一种常见的食品，其发酵过程中存在防腐乳杆菌。

为了确保酸菜的质量和安全，必须对发酵过程中的防腐乳杆菌进行检测与筛选。

防腐乳杆菌是一种乳酸菌，能够在酸菜的发酵过程中起到防腐和酸化的作用。

过多的防腐乳杆菌可能会导致酸菜的质量下降甚至腐败。

在酸菜生产过程中，对防腐乳杆菌的检测与筛选显得尤为重要。

酸菜的发酵过程中防腐乳杆菌的检测可以采用传统方法和分子生物学方法。

传统方法主要是通过对酸菜样品进行菌落计数。

具体步骤如下：1. 从发酵的酸菜样品中取出一定量的样品，加入适量的生理盐水进行稀释。

2. 将样品均匀涂布在含有适宜培养基的琼脂平板上。

3. 将琼脂平板放置在恒温培养箱中，设定适宜的温度和时间进行培养。

4. 检查培养后的琼脂平板上的菌落形状，统计菌落数量，并计算菌落形成单位（CFU）。

5. 通过菌落形态、颜色和其他特征进行初步鉴定。

还可以利用分子生物学方法对防腐乳杆菌进行检测与筛选。

这种方法主要是通过PCR技术检测酸菜样品中的防腐乳杆菌的特异基因序列，从而准确快速地确定防腐乳杆菌的存在。

1. 从酸菜样品中提取基因组DNA。

2. 设计特异性引物，使其能扩增防腐乳杆菌特异基因序列。

3. 进行PCR反应，扩增目标基因序列。

4. 将PCR产物进行电泳分析，以确定是否存在防腐乳杆菌的基因序列。

检测与筛选防腐乳杆菌的目的是为了确保酸菜发酵的质量和安全。

在生产中，可以根据检测结果对防腐乳杆菌的数量进行控制，以避免过量使用导致质量下降。

根据筛选结果，可以进一步研究和培育具有优良特性的防腐乳杆菌，以提高酸菜的质量和发酵效果。

传统发酵型泡菜中乳酸菌的分离筛选及直投式发酵剂的制备泡菜发酵过程中接种乳酸菌发酵剂可以很容易诱导和监控自然发酵,缩短发酵时间,降低发酵失败的风险。

因此,分离筛选具有优良发酵性能的乳酸菌对于提高蔬菜的感官品质,营养价值和货架期具有重要的意义。

优良乳酸菌的筛选是传统泡菜发酵模式向接种发酵模式转变的关键。

而与液态培养的乳酸菌发酵剂相比,直投式发酵剂具有活菌数多、发酵活力高、便于保藏和运输的优势,同时在工业化生产中能够缩短发酵周期,降低生产成本,提高产品的稳定性和安全性。

本文从传统发酵型的泡菜中筛选具有产酸速率快,产酸量多,降解亚硝酸盐和抑制病原菌能力强的乳酸菌,通过筛选合适的冻干保护剂,运用冷冻干燥法制备直投式发酵剂,并研究其贮藏稳定性和发酵活力,为乳酸菌直投式发酵剂的规模化、标准化生产提供理论和技术基础。

本研究主要有以下结果:1.采用MRS选择培养基从四川、重庆、湖北、陕西四省家庭自制泡菜,实验室自制泡菜和商品泡菜中分离纯化得到93纯菌株,并通过革兰氏染色发现有81株革兰氏阳性菌株(G+),12株革兰氏阴性菌株;通过过氧化氢酶试验,发现这81株G+均为过氧化氢酶阴性。

根据革兰氏染色和过氧化氢酶试验可初步判定这81株G+为乳酸菌。

2.以无菌白萝卜原汁+4%食盐水等比例混合为发酵培养基,用pH计和酸碱滴定法分别测定pH值和总酸,从上述81株菌株中筛选产酸速率快、产总酸量多的乳酸菌,并与从商品泡菜中分离的产酸速率最快的乳酸菌CK1进行Dunnet’s多重比较检验,结果表明,从自制泡菜中筛选的68株编号为BC6、LJ3、BC1、LJ7、PC1的5株乳酸菌在发酵6h时,pH值下降较快,从初始的5.36下降至4.12~4.43,发酵72h时产总酸量较多(17.10~17.96g/100mL)多,与CK1(pH=4.61,总酸量15.96g/100mL)的产酸速率和产总酸量形成显著性差异(P<0.05)。

乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。

3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。

糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。

将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。

3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。

培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

1.2.3 乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。

1.结果和分析2.1 乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一2.2乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。

在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。

说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。

也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。

在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡（如图三）；加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡（如图四）。

《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》篇一一、引言乳酸菌作为一种益生菌，因其能够调节肠道微生态平衡，促进肠道健康而备受关注。

近年来，研究发现乳酸菌的胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）在保持益生菌的生理功能中发挥着重要作用。

乳酸菌EPS具有提高机体免疫力、抗氧化、降血脂等多种生物活性。

因此，筛选出具有优良性能的乳酸菌EPS并研究其纯化及免疫活性具有重要意义。

二、乳酸菌胞外多糖的筛选1. 菌种来源本研究所用菌种来源于多种乳酸菌菌株，通过初步筛选，选择具有高产EPS特性的菌株进行深入研究。

2. EPS提取采用适宜的提取方法，如热水浸提法、有机溶剂浸提法等，从筛选出的乳酸菌中提取EPS。

提取过程中需注意温度、时间等条件对EPS产量的影响。

3. EPS纯化将提取得到的EPS进行纯化处理，包括脱盐、浓缩、透析等步骤。

在纯化过程中，可采用色谱法、超滤法等方法进一步纯化EPS。

三、乳酸菌胞外多糖的纯化1. 纯化方法本部分主要介绍采用高效液相色谱法（HPLC）和超滤法对EPS进行纯化的方法。

HPLC法可有效分离不同分子量的EPS组分，超滤法则可去除EPS中的杂质和低分子量组分。

2. 纯化效果评价通过对比纯化前后EPS的物理化学性质、分子量分布、结构特点等，评价纯化效果。

同时，采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）对纯化后的EPS进行结构分析。

四、乳酸菌胞外多糖的免疫活性研究1. 动物实验采用动物实验研究EPS的免疫活性。

将EPS以适当剂量喂食实验动物，观察其对动物免疫系统的影响，如对免疫器官发育、免疫细胞数量和功能的影响等。

2. 细胞实验通过细胞实验研究EPS对免疫细胞的刺激作用及信号传导机制。

采用流式细胞术、荧光定量PCR等技术检测EPS对免疫细胞表面标志物、细胞因子分泌等的影响。

3. 结果分析根据实验结果，分析EPS的免疫活性及其作用机制。

同时，结合文献报道的其他乳酸菌EPS的免疫活性研究结果，进行综合分析。