乳酸菌菌种地分离筛选方法

乳酸菌的筛选（初筛）一、实验目的对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。

二、实验材料PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。

三、实验步骤1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。

2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。

3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10-4、10-5梯度菌液进行平板涂布。

4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。

5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。

乳酸菌的筛选一、实验目的利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。

二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。

通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。

实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

四、实验步骤1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。

2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。

乳酸菌菌种的分离筛选原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，广泛应用于食品、饲料、医药等领域。

乳酸菌菌种的分离筛选是乳酸菌应用研究中的重要一环，其目的是从大量的混合菌群中筛选出具有优良特性的菌株。

乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基：乳酸菌菌种对营养要求较高，因此选择适宜的培养基是分离筛选的首要步骤。

常用的培养基有MRS培养基、DC培养基等，它们含有适宜乳酸菌生长的营养成分，能提供所需能量和营养物质。

2. 适宜的培养条件：乳酸菌对培养环境的温度、pH、氧气和二氧化碳等条件有一定要求。

通常情况下，乳酸菌分离筛选需要在适宜的温度（一般为30-40）下进行，pH值保持在4.5-7.0之间，氧气和二氧化碳含量适中。

3. 分离方法：乳酸菌菌种的分离常采用传统的分离培养技术，如层析法、稀释平板法、摇瓶培养法等。

其中，层析法是一种常用的快速分离方法，通过将混合菌群在筛选培养基上涂抹或刺激，使不同菌株在筛选培养基上形成分离的菌落。

4. 鉴定鉴别：乳酸菌菌种的筛选与鉴定是不可分割的一步，只有确定菌株的种属和特性才能真正确认其乳酸菌的菌种类型。

目前，常用的鉴定方法包括形态学观察、生理和生化特性检测、分子生物学方法（如PCR技术、16S rDNA序列分析）等。

在乳酸菌菌种的分离筛选过程中，还需要注意以下几个问题：1. 选择样品：样品的选择对于乳酸菌菌种的分离筛选至关重要。

通常情况下，从乳制品、肠道、土壤等环境中寻找潜在的乳酸菌菌种，可以提高分离到优良菌株的几率。

2. 优化培养条件：对于特殊的乳酸菌菌种，可能需要优化培养条件，如调整温度、添加特定的营养成分等，以促进其生长和繁殖。

3. 评价筛选结果：乳酸菌菌种的分离筛选结果需要综合考虑其特性和应用价值。

如菌株的酸奶生产能力、耐酸碱能力、抗菌能力、抗氧化能力等。

总结起来，乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括选择合适的培养基和培养条件、采用适当的分离方法和鉴定鉴别技术。

1、分离培养基采用MRS培养基, 分离培养基中添加溴甲酚紫作为指示剂;采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离, 挑取直径在115mm以下能使培养基中溴甲酚紫变红或变黄的单菌落, 菌落表面光滑的菌株，采用划线法进行分离纯化，获得纯种。

2、MRS 固体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，琼脂25g，水1000mL。

调pH6.2～6.4，1% CaCO3，121℃灭菌15min。

改良MRS培养基：向MRS培养基中加入1% CaCO3。

10 倍比稀释至10-10，分别吸取稀释液各0.2mL，涂布于含钙MRS 培养基平板上，37℃静置培养48h。

挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2~3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种3、MRS 固体培养基: 蛋白胨10g, 牛肉膏10g, 酵母提取物5g, K2HPO4 2g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠5g, 葡萄糖20 g, 吐温-801mL, MgSO4 #7H2O 0.5g, MnSO4 0.25g, 琼脂25g，蒸馏水1000mL, pH6.2~ 6.4, 3%的CaCO3, 121℃灭菌20min。

稀释倾倒平板法分别接种于MRS固体培养基上，30 ℃培养24h30℃培养24h, 在MRS+3%CaCO3 固体培养基上形成明显的透明圈, 表面光滑湿润。

45、培养基MRS液体培养基(pH5. 0) , 富集培养用; 改良MRS固体培养基(pH6.8) : 在培养基成分中,加入2%的CaCO3菌种分离方法先在MRS( pH5. 0) 液体培养基中进行富集培养, 18～24h后采用改良的MRS固体培养基进行稀释平板法分离,挑取生长在平板中下层且具溶钙圈的乳白色菌落,按常规方法进行纯化,获得纯菌。

从土壤中分离筛选菌种的流程一、引言土壤是一个复杂的生态系统，其中包含着丰富的微生物资源。

微生物在土壤中起着非常重要的作用，能够参与土壤的养分循环、有机物降解、植物生长调节等多种生态功能。

因此，从土壤中分离筛选菌种对于研究土壤微生物的多样性、功能和应用具有重要意义。

二、分离菌种的基本步骤1. 样品采集需要在目标土壤中采集样品。

样品的选择应该代表性，可以从不同地理位置、土壤类型、植被类型等方面进行选择。

采集样品时，应使用无菌工具，避免外部微生物的污染。

2. 样品处理采集的土壤样品需要进行一系列的处理步骤，以便分离目标菌种。

首先，样品需要经过筛选，去除大颗粒杂质。

然后，样品需要进行稀释，以获得合适的菌落形成单位（CFU）浓度。

3. 菌种分离将处理后的土壤样品均匀涂布在含有富含营养物的琼脂平板上。

琼脂平板中的富含营养物能够促进菌落的形成。

将涂布好的琼脂平板置于恒温培养箱中，使菌落在适宜的温度下生长。

4. 菌种筛选在菌落形成后，需要进行菌种的筛选。

筛选的方法可以根据需要选择不同的方式，比如形态学特征、生理生化特性、抗生素敏感性等。

通过筛选，可以得到具有特定特征的菌种。

5. 单菌分离在筛选得到目标菌种后，需要进行单菌分离。

单菌分离可以通过传代培养的方式进行，即从单个菌落中选取一个单独的菌落，再次进行涂布培养，确保得到纯种的菌株。

6. 菌株保存经过单菌分离后，需要对菌株进行保存，以便后续的研究和应用。

常用的保存方式有冷冻保存和冻干保存等。

冷冻保存可以利用低温冰箱或液氮罐，将菌株保存在-80℃以下的低温环境中。

冻干保存则是将菌株培养液进行冻干处理，保存在干燥的状态下。

三、分离筛选菌种的注意事项1. 样品采集时，需要避免污染，使用无菌工具，并在无菌条件下进行操作。

2. 样品处理时，需要保持样品的湿润状态，避免样品过度干燥。

3. 琼脂平板的选择应根据菌种的需求来确定，可以选择不同富含营养物的琼脂平板。

4. 菌种筛选时，需要根据研究目的选择合适的筛选方法，确保得到具有特定特征的菌种。

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。

为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。

营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。

在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。

当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。

对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。

M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。

其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。

粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。

革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。

在MRS培养基上菌落小，呈白色。

沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。

分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。

分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。

也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。

产高光学纯度D—乳酸野生菌株的分离筛选目的從某发酵食品中分离筛选出产高光学纯度D-乳酸的野生菌株。

方法用平板划线法对某发酵食品中的野生菌株进行分离纯化，用高压液相色谱法测定所分离野生菌株发酵液中D-乳酸的光学纯度，筛选出产高光学纯度D-乳酸的菌株。

结果从某发酵食品中共分离筛选出9株野生菌株，产D-乳酸的光学纯度达100%，将其命名为SZD菌株。

结论某发酵食品中存在产光学纯度为100%D-乳酸的野生菌株。

标签：D-乳酸；棒状乳杆菌；分离右旋乳酸（D-乳酸）是一种重要的可降解的化工原料，由其单体聚合而成的聚乳酸可应用于手术缝合线、冠脉覆膜支架和骨折内固定材料等[1]。

生产乳酸大多采用发酵法，发酵法制备D-乳酸的主要技术瓶颈是缺乏产高光学纯度（光学纯度>97%）D-乳酸的菌株[2]。

笔者在观察某发酵食品原液抑菌活性的过程中意外发现此发酵食品原液中含有较高光学纯度的D-乳酸。

本研究拟从该发酵食品原液中分离筛选出产高光学纯度D-乳酸的野生菌株。

1 资料与方法1.1试剂发酵食品原液采自陕西的一种发酵食品，该食品的细节因专利保护的需要目前不便公开。

MRS肉汤培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

L-乳酸（色谱纯，纯度98%）及D-乳酸（色谱纯，纯度93%）均由美国西格玛-奥德里奇公司出品。

1.2实验仪器Waters高效液相色谱仪2695（美国沃特世公司），waters紫外检测器2489（美国沃特世公司）；色谱柱：型号为Chirex 3126（D）-penicillami 的手性柱（美国菲罗门公司）。

1.3方法1.3.1菌株的分离、纯化用灭菌接种环取发酵食品原液在MRS平板上三区划线接种，35℃烛缸法培养48h后观察菌落生长情况。

用灭菌接种环从平板上选取菌落形态不同的菌落，分别采用三区划线法接种于不同的MRS平板，35℃烛缸法培养48h，观察每个平板菌落形态是否一致，重复以上操作直至每个平板上菌落形态一致。

乳酸菌菌种的分离筛选方法WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。

为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。

营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。

在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。

当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。

对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。

M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。

其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。

粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。

革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。

在MRS培养基上菌落小，呈白色。

沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。

分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。

分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。

也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

乳酸菌的分离和初步鉴定刘海音张超(长春师范学院生物系，长春，130032)摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。

为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。

此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。

以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。

关键词：乳酸菌分离鉴定乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。

利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。

这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。

利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。

因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。

本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。

通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌1. 材料和方法1.1材料1.1.1 选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶1.1.2 培养基BCG牛乳培养基A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml,80 摄氏度灭菌20 min.B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。

乳酸菌培养基牛肉膏 5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠 5 g ,水1000 ml , PH : 6.8121摄氏度湿热灭菌20 min蛋白胨水培养基蛋白胨10 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4121 摄氏度湿热灭菌20 min糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10 ml.制法：1）.将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH : 7.6 ）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（Durhem tube）,使充满培养液。

乳酸菌的筛选与鉴定流程1.材料首先要确定目标，即所筛选的乳酸菌来自哪里，例如想要筛选一株果蔬发酵乳酸菌，那我们就得找一个产区或者其他地方自然发酵果蔬的样品。

1.1培养基查找相关文献，菌种生化鉴定用培养基建议查看文献：工业微生物实验手册MRS培养基：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，吐温801g/L，葡萄糖50 g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，溴甲基酚紫0.4 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 6.3～6.7，121 ℃湿热灭菌30 min。

（PS：若自己嫌麻烦，可买现成的MRS培养基）初筛培养基：在MRS分离培养基的基础上，添加0.5%碳酸钙，乳酸调至PH2.0.（加碳酸钙是为了能更好的挑出优势菌，乳酸调至PH2.0也是同样道理）如图：若是乳酸菌菌落旁会有清晰可见的透明圈，这是由于乳酸与碳酸钙反应了。

高盐复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上，添加10%氯化钠和0.5%碳酸钙。

高糖复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上将葡萄糖质量分数提高到30%，添加0.5%碳酸钙。

明胶培养基∶蛋白胨25 g/L，牛肉膏7.5 g/L，氯化钠5g/L，明胶100 g/L，pH7.0～7.2，121∶湿热灭菌15 min。

果蔬发酵培养基∶将苹果、胡萝卜、西瓜、西红柿等水果、蔬菜清洗去皮切分后分别榨汁除渣制得发酵果酱，然后按1∶1∶1∶1比例混合经巴氏灭菌后4 ∶冷藏。

按照混合果蔬汁33.3%、葡萄糖5%、蔗糖5%、氯化钙0.5%、磷酸氢二钠0.05%、磷酸二氢钠0.05%、硫酸镁0.03%、柠檬酸0.1%的配比配制，除果蔬和柠檬酸外其余成分于115 ∶湿热灭菌15 min。

2.方法2.1乳酸菌的分离筛选取产区自然发酵苹果原浆，用0.9%灭菌生理盐水进行10 倍梯度稀释后，吸取适宜稀释度溶液涂布至MRS分离培养基中，37 ∶恒温厌氧培养24h，挑取菌落黄色范围大并具有乳酸菌典型特征的单菌落，进行革兰氏染色观察菌体形态。

一株乳酸片球菌的分离鉴定
对乳酸菌的分离鉴定是识别乳酸菌株的一个必要步骤。

它具有不同的生理，发酵性质，以
及生物学和化学属性。

本文旨在介绍一种乳酸片球菌的分离鉴定方法。

第一步对样品进行培养，以确定乳酸片球菌的细菌性状，并显示其生长特性。

发酵试验也
可以用来测定样品中葡萄糖含量以及乳酸和乳酸盐含量。

我们需要在恒定温度条件下进行
培养，以确保正确的发酵过程，可以利用红色素抑制试验来识别乳酸菌的存在。

其次，对乳酸菌进行抗性测试以鉴定乳酸菌株，其中包括抗生素抗性和耐酸碱等抗性测试，这可以确定乳酸菌的类型，也可以帮助我们正确识别乳酸菌。

另外，可以使用膜过滤法来
检测乳酸菌的活性，并使用育种技术进行筛选以鉴定乳酸菌株。

最后，可以使用基因分析技术来检测乳酸菌的基因型。

通过对基因组的测序，可以了解乳
酸菌的遗传结构，学习其生物学和重要细菌属性，这是识别乳酸菌的最有效方法。

总之，乳酸片球菌的分离鉴定需要各种生物学和化学技术，如培养，发酵分析，抗性测试，抗生素，筛选等技术。

此外，基因分析是鉴定乳酸菌株的优秀方法，可以识别乳酸菌的特征。

以上技术都可以帮助我们准确地分离和鉴定乳酸菌。

乳酸菌的筛选（初筛）一、实验目的对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。

二、实验材料PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。

三、实验步骤1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。

2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。

3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10-4、10-5梯度菌液进行平板涂布。

4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。

5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。

乳酸菌的筛选一、实验目的利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。

二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。

通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。

实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

四、实验步骤1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。

2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。

酸奶中乳酸菌的筛选试验一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法二、实验原理：市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。

、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。

.筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离三、实验药品及仪器牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。

仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机四培养基类型①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。

学院：漓江学院年级专业：09生物技术组员：吴汉川200913007005杨隆荷200913007006李翠200913007007王志远200913007008乳酸菌的分离及初步鉴定一、实验目的1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法2初步掌握军中筛选方法设计3掌握平菌种的选育二、实验原理乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。

乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。

在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3解圈。

乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。

乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。

乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。

平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。

生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。

四、实验器材与试剂含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl；BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。

(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。

以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。

1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。

内蒙古奶豆腐中产胞外多糖乳酸菌的分离筛选1.3乳酸菌分离方法取少量样品接入11%脱脂乳(m/V)中，37℃培养，凝乳后取样逐级稀释，选3个适宜的稀释度，每个稀释度取0.1mL涂布于MRS琼脂平板[7]，37℃培养48h。

选取合适的平板，挑取典型菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，其中革兰氏染色阳性和过氧化氢酶实验阴性的菌株初步鉴定为乳酸菌，继续划线培养分离纯化，直至得到纯菌，纯化后的菌株接种到MRS液体培养基培养后，加入20%甘油，－80℃冰箱保存备用。

1.4乳酸菌属的鉴定根据凌代文等[8]和杨洁彬等[9]介绍，乳杆菌属的生化特征是形态为单个、成对或链状排列的短或长杆菌，通常不运动，革兰氏染色阳性，微好氧。

极少见硝酸盐还原反应，不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和H2S，过氧化氢酶阴性，无细胞色素，联苯胺反应阴性。

最适生长温度是30～40℃，耐酸，最适pH值通常为5.5～6.2。

乳杆菌种的划分主要依据碳水化合物发酵实验。

1.5 API鉴定乳酸杆菌的碳水化合物发酵曲线采用API50CH试条测定，按Snart[10]的方法操作，稍有改动。

乳酸菌于MRS琼脂平板上37℃厌氧培养2d，用无菌牙签挑起部分菌落加入悬液基物(2mL无菌生理盐水)的试管中，制成浓的菌悬液(S)；打开悬液基物(5mL无菌生理盐水)的试管，加入少量上述浓菌(S)制得相当于2 McFarland浊度(OD 600nm≈0.3 5)的菌悬液，记录体积(V)；打开API50CHL培养基的安瓿，加2倍(2V)该菌液接种。

用已接种的API50CHL 培养基加入反应管中，并用灭菌的液体石蜡油覆盖所有的测定管，于37℃厌氧培养48h后读取结果。

发酵结果提交到生物梅里埃公司(北京)，根据API数据库现存的数据判定实验结果。

1.6乳酸菌荚膜显微镜观察M R S培养液中生长的新鲜菌体，采用墨汁负染法，于Olympus BX51显微镜油镜下观察，DP71照相。