基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建张飞飞;石牡丹;尚广东【摘要】[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率.[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能.[结果]敲除了编码降解外源DNA的Ⅰ型限制性内切酶的ksdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BI21(DE3)仍保持一致的LS1928菌株.[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料,进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)020【总页数】4页(P29-31,72)【关键词】重组工程;基因敲除;双链断裂修复;大肠杆菌BL21(DE3)【作者】张飞飞;石牡丹;尚广东【作者单位】徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221004;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023;江苏省微生物工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】S188酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。
野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。
高催化活性以及高催化专一性酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率蛋白突变体库的基础之一。
突变体库也是研究基因或蛋白结构和功能的关键手段。
常规的得到蛋白突变体的试验步骤是将通过特定方法(如 DNA shuffling［1］和易错 PCR［2］)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)如DH10B或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源蛋白表达宿主菌。
重组菌的培养、诱导表达
一、固体培养
1．将含有重组菌的保存菌种采取无菌操作技术，用接种环将细菌在平板上用稀释法分区划线。
2．37℃培养14-16小时，可见单克隆菌落时终止培养。
二、液体培养
1．无菌操作，挑取单克隆菌落于一个含有5ml含有抗生素的LB培养液的无菌管中，用透气的薄膜封住管口。
37℃，250rpm摇床12-14小时，同时做阴性对照。
2．取已培养好的种子菌液，按1%的的接种量接种于灭菌的LB培养液（含抗生素）中，即取2.5ml菌液加入250mlLB培养液中。
37℃，250rpm摇床3.5-4小时，使其OD值达到1.0左右（0.8-1.2）。
三、诱导表达
1．取IPTG加入已培养好的LB培养液中，使IPTG终浓度为1mmol/L。
2．37℃，250rpm诱导4-5小时。
3．4℃，4000 rpm离心10分钟收集菌体。
注意：
（1）操作过程严格，需要无菌操作。
（2）培养液加的抗生素因不同质粒而异。
（3）收集时，保持低温，防止蛋白降解。
1。
影响重组工程菌发酵产率的因素作者：孙冉阳来源：《华东科技》2013年第08期【摘要】随着科技的飞速发展，分子生物学对外源基因重组的研究不断深入和重组DNA 技术的不断突破，给我国发酵工程提供了更多的技术支持。
但是对于重组工程菌的发酵问题还有很多问题需要解决，只有及时准确的处理好各个因素的关系才会更好的实现产率的最大效益。
本文通过对影响工程菌产率的各种因素的分析来进一步阐述各个因素的重要性。
【关键词】溶氧量；酶活性；物质浓度社会在发展各个领域对于各种工程菌发酵产物的需求也越来越大，对于各种发酵产物的需求量的增加，最大效益增加工程菌的发酵产率也成了一个各个企业关心的问题，如何实现最大化的发酵产率也是研究人员一直在努力的目标。
在不断研究的同时最大程度上满足菌类生存的最佳状态，才会更好的实现产率的增加。
1 影响重组工程菌的生存因素1.1 温度对微生物的影响万物的生存都离不开温度的影响，温度的变化直接影响着微生物的新陈代谢速度。
首先，温度的变化直接影响到各种酶的活性。
当温度在酶的最佳范围之内随着温度的增加菌的新陈代谢也会增加，同样发酵的反应速度也会增加。
当温度超过这个适宜温度以后温度增加时会直接影响到酶的活性，温度进一步升高的话还会导致酶失去活性。
从而使菌体出现衰老，发酵周期缩短，产量降低等情况。
当温度降低时酶的新陈代谢也会随之降低。
例如，金色链菌在低于30度以下时合成金霉素的产率很大但是温度高于35度时不但不会生成金霉素反而会生成四环素。
所以温度不仅影响到酶的活性还会有时影响到发酵液的物理性质和菌对营养物质的吸收及分解。
要想更大效益的增加产率就应该了解工程菌酶的最佳活性温度。
更好的控制菌在最佳范围之间。
对于各种菌类得最佳温度可以通过实验的办法来确定，采用分段控制。
1.2 PH值对酶活性的影响PH值能够直接影响酶的活性。
同时还会影响细胞膜的带电荷的情况。
随着PH值得变化会直接影响细胞电荷的变化，从而使细胞膜的渗透性发生变化。
生物工程导论复习题选择题填空题名词解释简答题论述题第一章：绪论生物工程的研究对象包括活的生物体或它们的一部分（1）第二章：基因工程一：选择题1.DNA双螺旋结构是由（）提出（10）A. Monod和JacobB. NirebergC. Watson和CrickD.boyer2.起分子缝纫作用的酶是( )（11）A．限制性内切酶 B．DNA连接酶 C．TaqDNA聚合酶 D逆转录酶3.( )的发现，打破了中心法则（11）A．限制性内切酶 B．DNA聚合酶C．逆转录酶 D DNA连接酶4.( )携带生物细胞的全部遗传信息（13）A．mRNA B．tRNA C．氨基酸 D DNA5.基因工程的分子剪刀是（）（13）A．T4DNA连接酶B．限制性内切酶C．TaqDNA聚合酶 D RNA聚合酶III6.以下不能决定DNA双螺旋结构的因素( )（14）A 氢键的形成 B．碱基的堆积力C．氨基酸排列顺序 D碱基分子内能的作用7.决定DNA双螺旋结构的因素有 ( )（14）A．四种核糖核苷三磷酸组成B．磷酸基之间的静电斥力C．核糖的构成形式 D A和C8.使复制叉处双螺旋DNA解旋的是( )（14）A．DNA连接酶B．逆转录酶 C．DNA拓扑异构酶 D. DNA解旋酶9.DNA复制起主要作用的酶是( )（14）A．限制性内切酶 B．DNA聚合酶 C．DNA连接酶 D DNA解旋酶10.在加热或某些试剂作用下，双链DNA的多核苷酸能完全分离，此分离过程称为( )（15）A．变性 B．杂交 C．复性 D 解离11.遗传信息的传递方式( )（15）A.DNA---RNA---蛋白质B.RNA---DNA---蛋白质C.RNA---RNA---蛋白质D.DNA---DNA---蛋白质12.利用DNA为模板合成RNA的过程叫( )（15）A．翻译 B．杂交 C．变性 D转录13.依赖于RNA的DNA聚合酶是( )（16）A 限制性内切酶 B．逆转录酶C．DNA聚合酶 D DNA连接酶14.逆转录酶是一种特殊的( ) （16）A．RNA聚合酶 B．RNA连接酶C．DNA聚合酶 D限制性内切酶15.氨酰tRNA合成酶在DNA的( )过程发挥作用（16）A．复制 B．转录 C．逆转录 D 翻译16.作为一个能转录和翻译的基因必须包括( )（16）A．结构基因 B．调节基因 C．操作基因 D启动子17.乳糖操纵子是( )（17）A 操纵基因 B．结构基因C．调节基因D基因调控体系18.以下是病毒载体的是( )（20）A．大肠杆菌素因子 B．F因子 C．R因子 D SV4019.常用于原核生物宿主的载体( )（20）A．Ti 质粒 B．杆状病毒 C．YAC载体D噬菌体20.质粒广泛存在于细菌外的( )中（21）A．植物细胞 B．动物细胞 C．病毒 D蓝藻21.携带者参与或控制一些特殊代谢途径的基因的是（ A ）（21）A 降解质粒 B．F质粒 C．R因子D大肠杆菌素因子22.动物细胞的常用载体是( )（27）A．噬菌体 B．农杆菌 C．杆状病毒 D腺病毒23.真核生物目的基因的获得方法( )（30-31）A cDNA方法 B．DNA的化学合成法C．PCR法D．A,B和C24.TaqDNA聚合酶是( )（31）A．嗜热酶 B．嗜冷酶 C．嗜压酶 D嗜盐酶25.噬菌体颗粒感染宿主细胞将外源DNA转移到受体细胞内的方法叫( )（35）A．转化B．转导 C．显微注射 D脂质体介导法26.（）可将外源重组分子导入原核的细菌细胞（35）A 显微注射 B．电穿孔 C．转染 D多聚物介导27.最早应用于基因工程，至今仍然最广泛使用的受体细胞是（）（35）A.大肠杆菌B.枯草杆菌C.酵母D.霉菌28.基因工程常用的的宿主是( )（35）A 大肠杆菌 B．枯草芽孢杆菌C．放线菌 D霉菌29.表达产物常在体内形成包涵体的是( )（35）A．大肠杆菌 B．枯草芽孢杆菌 C．酵母菌 D 霉菌30.( )在转基因操作中不属于．．．微生物表达系统（35）A．大肠杆菌 B．霉菌 C．酵母D猴肾细胞31.能用于抗体生产的细胞表达系统是（）（35）A.植物细胞B.昆虫细胞C.HeLa细胞D. 猴肾细胞32.用于食品工程的基因工程菌可以是（）（35）A.链霉菌B.假单胞菌C.乳酸菌D.棒状杆菌33.动物基因转移受体细胞可以是（）（35）A.体细胞B.腺细胞C.肝细胞D.胚胎细胞34.多聚物介导DNA转移中常用的多聚物是（ )（36）A.磷酸钙B.DEAE-葡聚糖C. 聚乙二醇（PEG)D.二乙氨乙基葡聚糖(DEAE)35.DEAE-葡聚糖介导的转染法常用于将外源基因导入( )（37）A．酵母细胞 B．动物细胞 C．植物细胞 D大肠杆菌36.粒子轰击法常用于( )转基因操作（37）A．大肠杆菌 B．酵母菌 C．植物细胞 D 动物细胞37.下列哪种是重组蛋白常需要经过的修饰( )（45）A．蛋白质的氧化 B．脱氨基 C．降解 D糖基化38.( )已成为当下基因工程药物研究和开发的新热点（47）A. 疫苗 B．单克隆抗体 C．酶 D 激素39.基因组工程研究中，采用的载体是( )（48）A．Ti质粒 B．人工染色体 C．噬菌体载体 D质粒载体pBR322二：填空题1.基因工程的实施至少要有四个必要条件：工具酶，基因，载体，受体细胞（11）2.逆转录酶的发现打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。
