抗siRNA的GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定细胞系的构建

生ＬＥＴＦＥ物ＲＳ　ＩＮ技

ＢＩＯＴ术ＥＣＨＮ通ＯＬＯＧ讯

Ｙ…Ｖｏ１．２—６一一Ｎｏ．２一Ｍａｒ　２０—１５　・　・　‘，　

ｄｏｉ：１０．３９６９８．ｉｓｓｎ．１００９－０００２．２０１５．０２．０１２　研究报告　抗ｓｉＲＮＡ的ＧＦＰ—Ｐｌｋ　ｌ同义突变表达载体及其稳定细胞系　的构建　

李伟　，李峰生　，于楠　，刘萱　，李平　，江其生　，曹诚　１．军事医学科学院生物工程研究所，北京１００８５０；２．第二炮兵总医院核与辐射损伤实验室，北京１０００８８　

［摘要］　目的：构建ＧＦＰ－Ｐｌｋ１同义突变表达载体及其稳定转染细胞系。方法：设计Ｐｏｌｏ样激酶１（Ｐｌｋ１）ｓｉＲＮＡ序列　及相对应的同义突变引物，并利用二次ＰＣＲ方法扩增Ｐｌｋ１基因，定向克隆到ｐＲｅｘ－ＥＧＦＰ—ＩＲＥＳ—Ｈｙｇ　ｏ载体中，构建　

ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１一ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ表达载体；利用逆转录病毒感染的方法，构建ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１稳定细胞系；利用免疫　印迹及激光共聚焦显微镜，验证Ｐｌｋ１　ｓｉＲＮＡ的干扰效果及稳定细胞系的构建。结果：双酶切鉴定和测序结果表明构　建的ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１一ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ正确；免疫印迹实验证明Ｐｌｋ１　ｓｉＲＮＡ序列可以有效抑制ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１细胞中　内源性Ｐｌｋ１蛋白的表达，但不能干扰掉外源ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１蛋白；在荧光共聚焦显微镜下，观察到有丝分裂的前中期和末　期，ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１分别定位于着丝粒和中间体上。结论：构建了Ｐｌｋ１同义突变表达载体ｐＲｅｘ－ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１一ＩＲＥＳ—Ｈｖｇｒｏ　和ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１稳定细胞系，为下一步研究Ｐｌｋ１在有丝分裂期的调控机制提供了模型。　［关键词］Ｐｌｋｌ；抗ｓｉＲＮＡ；同义突变；稳定细胞系　［中图分类号］Ｑ７８　［文献标识码］Ａ　［文章编号］　１００９—０００２（２０１５）０２—０２０７—０４　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ　Ｍｕｔａｔｅｄ　ＧＦＰ－Ｐｌｋ　ｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｓｉＲＮＡ　ａｎｄ　Ｓｔａｂｌｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　

ＬＩ　Ｗｅｉ　，ＬＩ　Ｆｅｎｇ—Ｓｈｅｎｇ　，ＹＵ　Ｎａｎ。，ＬＩＵ　Ｘｕａｎ　，ＬＩ　Ｐ　，ＪＩＡＮＧ　Ｑｉ－Ｓｈｅｎｇ　，ＣＡＯ　Ｃｈｅｎｇ　

１．Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１　００８５０；２．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｄａｍａｇｅ，Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓ—　ｐｉｔａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｒｔｉｌｌｅｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８８；Ｃｈｉｎａ　Ｃｏ—ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒｓ，ＪＩＡＮＧ　Ｑｉ—Ｓｈｅｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｑｓ５９８＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ；ＣＡＯ　Ｃｈｅｎｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃａｏ＠ｎｉｃ．ｂｍｉ．ａｅ．ｃｎ　

【ＡｂｓｔｒａｃｔＪ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ＧＦＰ—Ｐｌｋ１　ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ０ｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｖ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅ１１ｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｓｉＲＮＡ　ａｎｄ　ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｐｏｌｏ—ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ　１（Ｐｌｋ１）ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ｐｌｋ１　

ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｗｏ　ｓｔｅｐｓ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ　ｔ０　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ＤＲｅｘ—　ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１一ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ　ｐｌａｓｍｉｄ．ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１　ｓｔａｂｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｅｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｉｎ—　ｆｅｅｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｂｌｏｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｏｎｆｏｅａｌ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙ　Ｐｌｋ　１　ｓｉＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｔａ—　ｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｈｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１一ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ　ｗａｓ　ｃｏｒｒｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ｐｌｋ１　ｓｉＲＮＡ　ｃｏｕｌｄ　ｅｆ－　ｆｅｅｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｐｌｋ　１　ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ＧＦＰ—ｒＰｌｋ　１　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｃｏｎ．　

ｆｏｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｉｍａｇｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ　ａｎｄ　ｔｅｌｏｐｈａｓｅ，ＧＦＰ—ｒＰｌｋ　１　ｗａｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　

ｔｈｅ　ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ　ａｎｄ　ｍｉｄｂｏｄｙ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：　Ａｎｔｉ－ｓｉＲＮＡ　ＧＦＰ—Ｐｌｋ　１　ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ＤＲｅｘ—　ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１一ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ　ａｎｄ　ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１　ｓｔａｂｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｏｎｓｔｒｕｅｔｅｄ。ｗｈｉｃｈ　ｗｉｌｌ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　

ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌｋ　ｌ　ｉｎ　ｍｉｔｏｓｉｓ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｐｏｌｏ—ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ　１；ａｎｔｉ—ｓｉＲＮＡ；ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｓｔａｂｌｖ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅ１１ｓ　

有丝分裂是细胞周期的一个重要时期，它涉及　到遗传物质的分配和调控，任何调控发生缺陷都将　导致严重的遗传物质传递故障，比如基因组的不稳　定性增加，从而增加癌症的易发性并促进癌症的发　展”　。有丝分裂受许多因子的调控，而Ｐｏｌｏ样激酶１　

收稿日期：２０１４—１１－２６　作者简介：李伟（１９７６一），女，博士　通信作者：江其生，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｊｑｓ５９８＠ｓｉｎａ．ｃｏｎ；曹诚，（Ｅ—ｍａｉｌ）　ｃａｏ＠ｎｉｃ．ｂｍｉ．ａｃ．ｃｎ　

（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ　１，Ｐｌｋ１）是这一时期重要的调节　因子　。　Ｐｌｋｌ是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸／　苏氨酸激酶，其作用可贯穿于整个有丝分裂过程　，　它可促进中心体的成熟、有丝分裂期的进入、双极纺　锤体的形成、姐妹染色单体的分离及胞质分裂沟的　形成　。为了进一步研究Ｐｌｋｌ在有丝分裂期的作　用，我们构建了可以抵抗Ｐｌｋｌ小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）　２０８　ｒｒ　技　术　通　讯ｖ…Ｎ。．２　Ｍａｒ．，Ｓ　ＩＮ　Ｂ１０ＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹ　ＯＩ．ＺＯ　ａｔ．２０１５　ＩＪＥ　ｒＴＥＲ　ｏ・　ｕ　３　

序列的同义突变（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｐｌｋｌ，ｒＰｌｋ１）表达载体，并　构建其稳定细胞系，这种稳定细胞系中内源Ｐｌｋｌ可　以被Ｐｌｋｌ　ｓｉＲＮＡ敲低，但表达的外源Ｐｌｋｌ不受其影　响，这为下一步研究工作奠定了基础。　１材料和方法　１．１材料　人胚肾２９３Ｔ细胞、人宫颈癌ＨｅＬａ细胞为本室　保存；大肠杆菌ＤＨ５ｏＬ感受态菌株购自北京天根科　技有限公司；质粒ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ、ｑｂ２２１、　ＶＳＶ—Ｇ为胥全彬博士惠赠；质粒Ｆｌａｇ—Ｐｌｋｌ为本室保　存；限制性内切酶Ｘｈｏ　Ｉ、Ｎｏｔ　Ｉ及Ｔ　ＤＮＡ连接酶购　自ＮＥＢ公司；碱性磷酸酶购自ＴａＫａＲａ公司；高保真　ＰＣＲ系统购自Ｒｏｃｈｅ公司；质粒小量中提试剂盒购　自北京天根科技有限公司；胶回收试剂盒购自Ｐｒｏ．　ｍｅｇａ公司；胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限　公司；细胞培养基ＤＭＥＭ、胰蛋白酶、青霉素、链霉素　购自ＧＩＢＣＯ公司；Ｖｉｇｏｆｅｃｔ转染试剂购自Ｖｉｇｏｒｏｕｓ公　司；ｓｉＲＮＡ转染试剂购自Ｂｉｏｒａｄ公司；蛋白酶抑制剂　购自Ｒｏｃｈｅ公司；蛋白质预染ｍａｒｋｅｒ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　公司；ＥＣＬ显色系统购自Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ公司；ＨＲＰ标　记的ａｎｔｉ—Ｂ—ａｃｔｉｎ购自Ｓｉｇｍａ公司；小鼠单克隆抗体　ａｎｔｉ—Ｐｌｋ１购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；二抗　羊抗鼠购自Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ公司；　Ｃｒｅｓｔ抗人抗体及抗人二抗购自Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｉｎｃ公司；　引物和测序由奥科公司完成。　１．２　Ｐｌｋｌ及阴性对照ｓｉＲＮＡ序列　Ｐｌｋ１　ｓｉＲＮＡ：５　一ＡＧＡＴＴＧＴＧＣＣＴＡＡＧＴＣＴＣＴ一３　；　对照ｓｉＲＮＡ：５　一ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵＴＴ一３　。　１－３　ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１表达载体的构建　所用载体为ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ，本研究　将Ｐｌｋｌ基因克隆至姗０　Ｉ与Ｎｏｔ　Ｉ位点之间。ｐＲｅｘ—　ＥＧＦＰ—ｒＰｌｋ１基因克隆正向引物（下划线序列为Ｘｈｏ　Ｉ酶切位点）为５　一ＣＣＧｃＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＧＣＡ　ＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＧ一３　，反向引物（下划线序列为　Ｎｏｔ　Ｉ酶切位点）为５＂－ＡＴＡＡＧＡＡＴ　ＴＴＡ　ＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＡＣＧＧＴＴＧＣ－３　。　同义突变正向引物为５　ＴＴＣＧＣＧＧＧＣＡＡＧＡＴ　！　ＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧ－３　，反向弓Ｉ物为５　一ＣＡ　ＧＣＡＧＡＧＡＣＴ’Ｉ’　。！’Ｃ。ｒＩ。ＧＣＣＣＧＣＧＡＡ一３　，　下划线序列为同义突变氨基酸密码子。　以野生型Ｐｌｋｌ基因为模板，用基因克隆正向引　物和同义突变反向引物扩增Ｐｌｋｌ的５　端序列Ｍ１，用　基因克隆反向引物和同义突变正向引物扩增Ｐｌｋｌ的　３　端序列Ｍ２。凝胶电泳回收Ｍ１、Ｍ２片段，以１　Ｌ　Ｍ１和１　ｔｘＬ　Ｍ２的混合物为模板，用基因克隆引物　进行二次ＰＣＲ，扩增Ｐｌｋｌ同义突变基因全序列。　将回收的ＰＣＲ产物和质粒ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ＩＲＥＳ—　Ｈｙｇｒｏ分别用　０　Ｉ／Ｎｏｔ　Ｉ双酶切，将酶切产物分别　进行１０　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，回收的目的基因与酶　切的载体连接后转化大肠杆菌ＤＨ５￣ｘ，用氨苄西林　平板筛选阳性克隆，ＰＣＲ鉴定阳性克隆，提质粒，酶　切鉴定，将鉴定正确的质粒送奥科公司测序。　１．４细胞培养及转染　２９３Ｔ细胞、ＨｅＬａ细胞均用含１０％胎牛血清和　１００　Ｕ／ｍＬ青霉素、１００　Ｕ／ｍＬ链霉素的ＤＭＥＭ在　５％ＣＯ　、３７￣Ｃ培养箱中培养。转染前２４　ｈ将２９３Ｔ　细胞传代，待细胞长满平皿的７０％一９０％密度时即可　进行转染；转染前１　ｈ更换５　ｍＬ新鲜培养基。取６　ｇ＠２２１、４　ｇ　ＶＳＶ—Ｇ、６　Ｉ．ｚｇ　ｐＲｅｘ—ＥＧＦＰ—ｒＰ１ｋ１一　ＩＲＥＳ—Ｈｙｇｒｏ进行转染，８～１２　ｈ后更换新鲜培养基；　４８　ｈ后取培养上清，并更换新鲜培养基；将培养上　清离心，去掉细胞碎片，上清可用于感染；７２　ｈ后第　２次取培养上清，上清可继续用于感染。ｓｉＲＮＡ转染　步骤同上。　１．５　ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１细胞系的构建　在感染前１　ｄ将ＨｅＬａ细胞传代，当细胞密度达　６０％～８０％时可进行病毒感染。分别取培养４８和７２　ｈ的病毒上清对ＨｅＬａ细胞进行感染。感染时，在含　有逆转录病毒的培养上清中加入聚凝胺（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）　至终浓度为８￣ｇ／ｍＬ，以提高病毒感染效率；３　ｄ后　加入含潮霉素（５ｏｏ　ｐ，ｇ／ｍＬ）的培养基进行筛选，１周　后将潮霉素量改为２００￣ｇ／ｍＬ，２周左右可得到　ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１稳定细胞系。　１．６　Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１细胞系　将ＨｅＬａ／ＧＦＰ—ｒＰｌｋ１细胞传代１－２４　ｈ，转染　Ｐｌｋｌ　ｓｉＲＮＡ及阴性对照，转染步骤按照试剂说明书　进行，第１次转染后２４　ｈ再进行第二次转染。转染　４８～７２　ｈ后收集细胞，用５　ｍＬ预冷的１ｘＰＢＳ洗涤细　胞，１７００　ｒ／ｍｉｎ、４￣Ｃ离心２　ｍｉｎ，弃上清，如此重复２　次；用裂解缓冲液（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ８．０，　１５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，１％ＮＰ－４０，０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，　蛋白酶抑制剂１片／５０　ｍＥ）裂解细胞；将细胞与裂解　液混匀，冰浴裂解２０～２５　ｍｉｎ，１４　０００　ｒ／ｍｉｎ、４￣Ｃ离　心１０　ｍｉｎ；吸取细胞裂解上清，加入ＳＤＳ上样缓冲　液，沸水浴５　ｍｉｎ，离心后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；电泳结束　后转移至ＰＶＤＦ膜上，用封闭液（含５％脱脂奶粉的　ｌ￣ＰＢＳＴ）室温封闭１　ｈ；封闭完成后，用１￣ＰＢＳＴ（１×　ＰＢＳ，０．５％Ｄ　Ｔｗｅｅｎ一２０）洗膜３次，每次５～１０　ｍｉｎ；按　抗体使用说明，用１ｘＰＢＳＴ配制非ＨＲＰ酶标记抗体　（一抗），与ＰＶＤＦ膜室温孵育１　ｈ，之后用１￣ＰＢＳＴ洗　膜３次，每次５—１０　ｍｉｎ；按抗体使用说明，用封闭液　配ＨＲＰ标记二抗，同样室温孵育１　ｈ，再用１￣ＰＢＳＴ　洗膜３次，每次５～１０　ｍｉｎ（上述孵育和洗膜过程均在