基因芯片技术在肺癌研究中的应用

基因芯片技术在肺癌研究中的应用Application of gene chip in study of lung cancer李　芸1,2　综述 余秉翔1　审校1军医进修学院，北京　100853；2解放军第309医院 呼吸科，北京　100091摘要：基因芯片技术是一项新的生物学技术，该技术以其迅速、高通量、大规模等特点在恶性肿瘤的分子生物学研究中具有广泛用途。

本文综述了新近用基因芯片技术在肺癌基因表达及基因功能、基因诊断等研究方面的应用。

关键词：肺肿瘤；寡核苷酸序列分析；基因中图分类号：R 73.3 文献标识码：A 文章编号：1005-1139(2010)04-0401-03基因芯片(Gene Chip)属于生物芯片(Biochip)的一种，它能快速解读遗传基因的碱基排列。

基因芯片技术是高效的大规模获取相关生物信息的主要手段，此技术可检测出以1：300 000水平出现的mRNA，且易于同时检测成千上万的基因。

基因芯片技术的基本原理是反向固相分子杂交，大量寡聚核苷酸或cDNA作为探针固着于固相支持物上，借助核酸分子碱基互补配对特性，与标记的样本靶分子进行杂交，经激光共聚焦扫描仪检出杂交信号强度，通过计算机处理、分析而获得所需信息。

其技术流程包括：芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析。

基因芯片主要分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片，前者主要用来检测基因表达；而后者既可以用来检测基因表达，也可以用来研究基因组结构、检测基因突变、筛查单核苷酸多态性等。

已有大量文献报道了此技术在肺癌研究中的应用[1]，本文就此作简要综述。

1 肺癌基因表达谱分析肿瘤的发生、发展是以复杂的基因异常表达变化为基础的，肺癌也不例外。

了解肺癌细胞与正常细胞基因表达谱的差异，可加深对肺癌发生、发展分子机制的认识。

这些研究利用基因芯片来确定不同肺癌亚型的基因表达谱，并比较它们之间的差异表达基因，更深入了解肺癌的发病机制。

Nacht M[2]等用基因芯片检测正常肺上皮细胞及非小细胞肺癌组织的基因表达谱，再用分层群聚方法进行分析，结果显示能代表鳞癌的基因序列主要包括编码参与细胞解毒和抗氧化蛋白的基因－如谷胱苷肽S转移酶和羧基酯酶，这暗示肺鳞癌是由支气管上皮细胞在持续的环境制癌因素(主要与吸烟有关)的刺激下产生的。

标示肺腺癌的是编码表面活性剂和与小气道有关基因的异常表达，如表面活性剂A2，表面活性剂B和黏液素1，提示肺腺癌可能来源于小气道的II型肺泡细胞和克拉拉(Clara)细胞。

2 探索肺癌新的分子亚型目前，肺癌的病理分型主要以细胞组织来源、分化程度、形态特征、生物学特点和蛋白标记物为依据，但在临床上经常可见到同一病理类型同一分期的患者在预后上却有很大差异，利用基因表达谱从基因水平对肺癌进行分型可以在传统的分类基础上发现新的类型和亚型，从而更真实准确地估计病情，对制定合理的治疗方案和估计预后有很大帮助。

Bhattacharjee等[3]利用基因芯片对127例肺腺癌的基因表达进行了研究，发现腺癌的异质性很大。

根据基因表达的差异进一步把肺腺癌分成4个亚型：C1以细胞分裂、增殖相关基因表达为著；C2特异表达几种神经内分泌基因，如多巴脱羧酶、丝氨酸蛋白水解酶、舒血管素11；C3表达鸟氨酸脱羧酶1、谷胱苷肽-S-转移酶和II型肺泡标记物(如甲状腺转录因子1，表面活性蛋白B、C、D基因等)；C4高表达细胞色素b5、组织蛋白酶H、上皮黏蛋白1等。

上述分型与患者的预后相关，预后最差的是C2，最好的是C4。

Hayes[4]等利用DNA微阵列技术建立了3个肺腺癌亚型，根据这3种亚型的基因表达与已知的支气管肺泡癌、鳞癌和大细胞癌基因表达的相关性，分别命名为细支气管型、鳞型和大细胞型，进一步研究发现，细支气管型预后较好，而大细胞型预后则较差。

这些研究即进一步揭示了腺癌的分子基础，同时也可以初步解释同一临床分期中不同腺癌患者之间在治疗和预后方面为何存在差异。

3 肺癌转移相关基因的研究转移是恶性肿瘤最本质的特点，是导致肿瘤患者死亡的主要因素。

文献报道，即使是早期(I期和II期)肺癌患者，原发灶已根治性切除后，术后5年生存率仍只有50%~70%。

通过对肿瘤转移相关基因的研究，可以阐明肿瘤转移的分子机制，对提高肺癌患者生存率有重要临床意义。

Diederichs[5]等利用基因芯片对82例I－II期非小细胞肺癌患者癌组织的基因表达谱进行比较分析，发现了几个基因家族在发生转移的患者和未发生转移患者间的差异性表达，这其中包括已为大家熟知的转移预测因子(如基质金属蛋白酶)，除此以外，他们发现S100钙结合蛋白P、收稿日期：2009-09-21 修回日期：2009-10-21基金项目：军队“十一・五”杰出人才课题(060J019)Military Science Foundation of the Eleventh Five-year Plan for Outstanding Scholarship(060J019)作者简介：李芸，女，在读硕士，住院医师。

Email: bhyt326@ 通信作者：余秉翔，主任医师，硕士生导师。

Email: bingxiang_yu@ S100钙结合蛋白A2、胰蛋白酶原C(TRY6)、胰蛋白酶原IVb(PRSS3)在发生转移的患者组织中表达上调，紧接着他们又在另一亚组42例患者中，用实时定量反转录PCR的方法证实S100蛋白和胰蛋白酶原在肿瘤转移中的诱导作用以及和患者生存之间的显著相关性，由此证明包括S100蛋白和胰蛋白酶原在内的几个基因家族参与了肺癌转移，可以预测转移和预后。

Gemma等[6]用基因芯片技术检测了具有高度转移性的两个肺腺癌的亚群细胞株PC9/f9和PC9/f14的基因表达谱，并与母代细胞进行比较，结果发现MMF-2、I型纤溶酶原激活物抑制因子、白介素1α等3条基因高表达，CEA、Met、CD44等12条基因呈低表达。

该研究表明，癌细胞的转移是多个因素异常的共同表达结果，对上述基因进行深入的研究，有助于对肺癌转移机制的了解。

4 肺癌化疗药物作用机制及耐药机制研究肿瘤化学治疗中对细胞毒性药物的耐受性是引起治疗失败的重要原因，利用基因芯片技术分析肺癌细胞株的耐药机制，快速筛选相关的耐药基因，有助于指导临床治疗和研制开发新型的抗肿瘤药物。

国内周向东等[7]在成功建立顺铂(CDDP)诱导的人小细胞肺癌多药耐药(SCLCMDR)细胞系SH77/CDDP的基础上，分别提取SH77/CDDP和其亲代SH77细胞的总RNA，反转录合成双链的cDNA，通过反转录合成生物素标记的cRNA探针，片段化处理后分别与Affymetrix GeneChip人类U133系列杂交，结果发现与SH77亲代细胞相比，在SH77/CDDP细胞中有2389个(6.3％)基因表达增高。

其中差异最显著的36个基因包括ABCC3、HSP70、CYP4A11、CYP26B1、IGF1R、LOX2、CAP2、LRP2BP、AKNA、ELTD1等，高通量的基因芯片技术筛选出大量CDDP所致的SCLCMDR相关基因，对这些耐药相关基因功能进行验证将有助于揭示CDDP所致的SCLCMDR的发生机制。

孙海等[8]应用基因芯片比较人肺腺癌多西他赛耐药细胞系SPC2A/Docetaxel与其亲本株基因表达的差异，筛选与耐药相关的基因，再用RT-PCR验证部分差异表达基因，结果显示两者差异表达基因一共有934条，其中上调428条，下调506条，涉及ABC运载体、凋亡、微管蛋白、信号转导、酶等多方面，这些差异表达基因为我们进一步研究化疗耐药机制提供了线索。

5 肺癌患者术后预后的分子检测近年来越来越多的研究开始应用基因芯片来探讨肺癌预后相关因素。

Larsen等[9-10]对98例NSCLC患者(其中鳞癌50例、腺癌48例)术后组织的全基因组基因数变异(DNA获得/丢失，CNV)进行研究，结果发现17个CNV能够区分肺鳞癌术后复发与否，15个CNV能够区分肺腺癌术后复发情况。

无论肺鳞癌还是肺腺癌，在复发组和不复发组之间基因表达存在明显差异的基因均定位在8p11.21、9p21.1-21.3和1p34.1-33三个区域。

与复发相关CNV与基因拷贝数和表达水平明显相关(r＝0.4-0.8)，包括7q21.3-32.32(CYP3A7、CAV2和WASL)、10p15.3-11.21(SVIL、TCF3和RAB18)和14q23.3-32.33(MARK3、BAG5、SIVA和MTA1)。

Chen等[11]确定了16个与NSCLC患者生存期有关的基因，4个与延长患者生存期有关，12个与缩短患者生存期有关。

通过这一研究他们制定了一个可以区分高低危险级和复发率的临界分数。

后来他们又用RT-PCR分析技术对101个标本进行了分析以验证先前结果，RT-PCR分析的结果显示肺癌患者生存期的长短与16个基因中的5个关系最为密切，它们是：DUSP6、MMD、STAT1、ERBB3和LCK。

这些研究对NSCLC具有重要临床意义，它提示我们有高危险基因表达的患者可以从辅助化疗中获益，而低危险基因表达的患者则可以省去不必要的化疗。

6 寻找新的肺癌标记物临床上用于肺癌诊断的癌标记物众多，但迄今尚无一种血清癌标记物对诊断肺癌具有较高的特异性。

Fukumoto 等[12]用基因芯片技术结合免疫组织化学，发现AKR1B10在肺鳞癌以及有吸烟史的肺腺癌患者中呈高表达。

Kobayashi 等[13]用含有637个人肿瘤相关基因的cDNA芯片，比较了基因表达的差异，认为MMP15和MX2可以作为肺腺癌诊断和治疗的标记物。

Hofmann等[14]利用芯片技术，检测发现RAGE/cyclin－B2比例在肺癌组织与正常组织中存在差异，从而认为RAGE/cyclin－B2比例是一个可能诊断肺癌的方法。

Spira等[15]用基因芯片技术分析怀疑肺癌的吸烟者正常大气道上皮细胞的基因表达，筛选出一80基因组成的生物标记物，以此区别肺癌患者与非肺癌患者。

这些基因功能涉及炎症、细胞周期、抗氧化防御作用等方面，一些与RAS癌基因通路相关基因，包括RAB1A和FOX表达上调，而碱性亮氨酸链式转录因子2(BACH2)，它在氧化条件下编码一诱导凋亡的转录因子，表达下调。

紧接着他们又证明了，此项检查与气管镜下取得的下气道细胞的细胞病理学检查结合，可以获得95％的敏感性和95％的特异性，由此得出结论：正常大气道上皮细胞的基因表达可以作为肺癌的生物标记，用于筛选吸烟者中的肺癌高危人群。

7 结语经过10余年的发展，基因芯片技术已日渐成熟，广泛应用于各学科研究工作中，虽然该技术也存在一些缺点，如设备昂贵、检查费用高、技术比较繁琐、质量控制体系不完善等，但随着基因芯片技术的不断深入发展和使用经验的积累，以上问题都会逐渐解决。